Le développement du séquençage ARN, ou RNAseq, a permis l'essor de la recherche intensive de biomarqueurs dans de nombreux domaines de la biologie. L’information complète du transcriptome contenue dans les données de sorties, permet à un bioinformaticien assidu de dépasser les connaissances actuelles et d’accéder, grâce à des pipelines informatiques avancés, à d’innombrables signatures d’intérêts inédites. Dans cette thèse nous mettons en avant que ces marqueurs potentiels, essentiellement explorés pour répondre à des problématiques clinique en conditions pathologiques, peuvent être utilisés pour affiner la caractérisation de types de cellules sans marqueurs strictement spécifiques. Nous nous sommes intéressés aux cellules souches mésenchymateuses (MSCs), un type de cellules souches adultes multipotentes, fortement utilisées en clinique mais ne possédant pas de marqueurs positifs strictement spécifiques.Notre étude se concentre sur la recherche des ARN longs non-codants non annotés. Ces ARNs, aussi nommés "lncRNA", constituent une classe émergente de transcrits encore peu explorée à ce jour. De plus, cette catégorie démontre une spécificité conditionnelle et tissulaire élevée. Nous avons élaboré un pipeline d’analyse RNAseq optimisé pour la reconstruction et la quantification de lncRNAs non annotés.En utilisant les données publiques de RNAseq, venant de différentes sources de MSCs et d'autres types de cellules, nous avons identifié de nouveaux lncRNA non annotés exprimés spécifiquement dans les MSCs.Nous avons développé pour ce projet Kmerator.jl, un outil qui permet de décomposer un transcrit en sous séquences spécifiques (k-mers) afin de chercher et quantifier plus rapidement la signature de nos candidats dans un grand nombre de données RNAseq. Kmerator a également été utilisé dans d'autres applications pour tester la qualité des données RNA-seq disponibles en accés public.Après validation de ces nouveaux biomarqueurs de MSCs par qPCR, nous avons eu recours à plusieurs outils informatiques pour prédire leurs fonctions potentielles. Enfin, nous avons analysé des données RNAseq « single-cell » pour aborder l’hétérogénéité d’expression au sein des populations MSCs. / The development of RNA sequencing, or RNAseq, have opened the path of intensive biomarkers research in many areas of biology. The complete information of the transcriptome contained in the output data, allows a bioinformatician to surpass the current knowledge and to access, thanks to advanced computer pipelines, to signatures of new interest. In this thesis, we are showing that these potential markers, classically used in clinical and pathological conditions, can be used to characterize cell types without extensive markers profile. We have studied mesenchymal stem cells, a type of adult multipotent stem cells, strongly used in clinics but without strickly specific positive markers. Our study mainly focuses on the search for non-annotated, long non-coding RNAs. These RNAs, also called "lncRNA", constitute an emerging class of transcripts and are still lightly explored.In addition, this category presents a highly tissue-related specificity. We have developed an optimized RNAseq pipeline for the reconstruction and quantification of non-annotated lncRNAs.Using public data from RNAseq, coming from different sources of MSC and other cell types, we have identified new non-annotated lncRNAs clearly and specifically expressed in MSCs. to complete this project, we developed Kmerator.jl, a bioinformatical tool that allows to decompose a transcript in k-mer, and select specific sub-sequences, in order to search and quantify at a faster rate the signature of our candidates in a large number of RNAseq dataset. After validation of these new biomarkers of MSCs by qPCR, we used several computer tools to predict their potential functions. Finally, we analyzed single-cell RNAseq data to address the heterogeneity of expression within MSC populations.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie dégénérative impliquant des symptômes d’atrophie musculaire et de myotonie. Au niveau moléculaire, elle est caractérisée par une expansion aberrante de CUG dans la région 3’UTR de l’ARNm de DMPK (Dystrophia Myotonica protein kinase). Ces répétitions CUG forment des agrégats toxiques (appelés foci) majoritairement nucléaires dans les cellules de patients DM1 et causent la séquestration anormale de ribonucléoprotéines (RBP), tel que le facteur «Muscleblind-like 1» (MBNL1), qui lieraient normalement les motifs CUG d’autres ARN. Les fonctions normales de ces RBPs seraient alors perturbées. En plus de leur rôle dans l’épissage alternatif, MBNL a récemment été caractérisé pour son implication dans la localisation intracellulaire de ses ARN cibles. Ceci suggèrerait que la pathogénèse de la DM1 pourrait résulter de l’effet perturbateur des répétitions CUG sur la localisation d’ARN précis et de protéines RBPs. À cet effet, un criblage basé sur de la microscopie fluorescente de 322 RBPs dans des myoblastes de patients DM1 a permis d’identifier des nouveaux facteurs qui colocaliseraient avec les expansions pathogéniques CUG. De plus, ces myoblastes DM1 ont été fractionnés et un séquençage-ARN a par la suite permis l’identification de transcrits délocalisés. Les deux banques de données ainsi générées, tant par le criblage que par le fractionnement/séquençage-ARN, pourraient ouvrir des nouvelles avenues de recherches dans la compréhension des anomalies moléculaires associées à la DM1, et potentiellement d’autres maladies à expansions microsatellites. / Myotonic dystrophy of type 1 (DM1) is a degenerative disorder implicating symptoms of muscular atrophy and myotony. In a molecular level, it is caused by the aberrant expansion of CUG repeats in the 3’-UTR region of the DMPK mRNA (Dystrophia Myotonica protein kinase). Excessive CUG repeats then form toxic aggregates (foci) enriched within the nucleus of DM1 patient cells. These RNA foci cause the abnormal sequestration of RNA Binding Proteins (RBP), in particular members of the Muscleblind-like protein 1 (MBNL), that normally bind the CUG motif of other target RNAs, and will hence alter their normal functions. In addition to their role in alternative splicing, MBNL1 has recently been implicated in the intracellular localisation of its RNA targets. It remains elusive whether the pathogenesis of DM1 could result from the deregulating effect of CUG repeats on the localisation of specific RNAs and RBP proteins. In this thesis, a fluorescent imaging-based screening of 322 RBPs in DM1 patient’s myoblasts has been conducted and this had led to the identification of new factors that may colocalize with pathogenic CUG expansions. Moreover, these DM1 myoblasts have been fractionated and subsequent RNA-sequencing has permitted the identification of transcripts that are delocalised between subcellular compartments. From the two large datasets generated from the RBP imaging-based screening and fractionation/RNA-sequencing, new avenues of research can be initiated to further understand not only DM1, but perhaps also other disorders that implicate microsatellite expansions.

« Myopathie héréditaire » est un terme générique pour les maladies génétiques rares caractérisées par une faiblesse musculaire et une hypotonie avec ou sans atrophie musculaire. Les personnes atteintes d'une forme légère peuvent présenter des contractures, une scoliose, une hyporéflexie ou des caractéristiques dysmorphiques, et les plus sévères peuvent être accompagnées de symptômes cardiaques ou respiratoires pouvant s'avérer mortel. Alors que les méthodes de séquençage de nouvelle génération basées sur l'ADN ont considérablement accéléré la découverte de gènes responsables de maladies rares, de nombreux patients demeurent sans diagnostiques génétiques. L'une des principales raisons de ce problème est le grand nombre de variants de signification inconnue identifiés, où l’impact biologique est peu ou pas connu. Ce mémoire de maîtrise contient trois projets distincts dont l'objectif global est d'augmenter le rendement diagnostique pour les patients atteints de myopathies héréditaires rares. La première étude porte sur trois frères et soeurs atteints d'une dystrophie musculaire non diagnostiquée. Une combinaison de techniques « omic » a été utilisée pour identifier un variant faux-sens dans le gène IARS accompagné d’un déséquilibre allélique spécifique aux tissus musculaires. L’inhibition de iars-1 chez le C. elegans a entraîné une désorganisation progressive du muscle de la paroi corporelle, mais sans perte significative de la motilité. Ainsi, nous avons conclu que iars-1 joue clairement un rôle dans l'organisation des myotubes. La pathogénicité du variant, cependant, nécessite une enquête plus approfondie. La deuxième étude porte sur une femme présentant une myopathie statique congénitale se manifestant par une faiblesse proximale et distale. En utilisant le séquençage de l’ARN, nous avons identifié pour la première fois un profil d'expression génique compatible avec une prédominance des fibres musculaires de type I, focussant l’intérêt sur un variant dans le gène RYR1. La troisième étude englobe une cohorte de vingt-huit patients porteurs de la même mutation RYR1, mais présentant une hétérogénéité clinique significative. Des modèles « knock-in » de C. elegans pour les études deux et trois ont démontrés des changements en transmission synaptique, la durée de vie, la taille corporelle et la locomotion. Ainsi, nous avons conclu que les deux variants identifiés dans RYR1 ont probablement également des conséquences cliniques chez les porteurs humains. En fin de compte, ces études mettent en évidence l'utilité du séquençage de l’ARN en tant qu'outil de diagnostic complémentaire, capable de restreindre la liste de candidats potentiellement pathogéniques, ainsi que le pouvoir du C. elegans en tant que modèles pour des tests rapides et coordonnés de variants candidats. / “Hereditary myopathies” is an umbrella term for rare inherited diseases characterized by muscle weakness and hypotonia with or without muscle atrophy. Individuals with a mild affliction may present with contractures, scoliosis, hyporeflexia or dysmorphic features, while those more severely affected may present cardiac or respiratory involvement that could prove deadly. While traditional DNA-based next-generation sequencing techniques have greatly accelerated discovery of genes causing rare diseases, many patients remain without a known genetic cause. The main reason for this diagnostic shortfall is the vast number of variants of unknown significance identified whose biological functions are unknown. This master’s thesis contains three separate projects with an overarching goal to increase the diagnostic yield of patients with rare hereditary myopathies. The first study focuses on three siblings with an undiagnosed muscular dystrophy. A combination of “omic” techniques were used to identify a missense variant as well as a muscle-specific allelic imbalance in the gene IARS leading to the exclusive expression of the mutant allele. Iars-1 knock-down in C. elegans resulted in progressive disorganization of the body wall muscle but with no significant loss of motility. Thus, we concluded that iars-1 likely plays a role in the organization of myotubes. The pathogenicity of the variant, however, requires further investigation. The second study involves a woman with a congenital static myopathy exhibited as proximal and distal weakness. Using RNA-sequencing, we identified for the first time a gene expression profile consistent with type I fiber predominance in the proband which guided the search for the causative RYR1 variant. The third study encompasses a cohort of twenty-eight patients who carry the same RYR1 mutation but display significant clinical heterogeneity. Knock-in models of C. elegans for both studies demonstrated altered synaptic transmission, lifespan, body size and locomotion. Thus, we concluded that both variants identified in RYR1 likely have consequences for human carriers as well. Ultimately, these studies highlight the utility of RNA-seq as a complimentary diagnostic tool capable of narrowing the search for novel pathogenic mutations as well as the value of C. elegans as models for rapid and coordinated testing of candidate variants.