Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La inseminación artificial con espermatozoides refrigerados es empleada en varias especies animales incluidos los perros, sin embargo, aunque en menor grado que la congelación, la refrigeración tiene efectos detrimentales sobre el espermatozoide pudiendo afectar procesos como la capacitación espermática y reacción acrosómica, donde se libera el sistema enzimático proacrosina/acrosina. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante Western Blot en espermatozoides de perro sometidos a refrigeración, la reactividad del sistema proacrosina/acrosina durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se utilizaron 7 eyaculados de 3 perros adultos. En cada muestra se evaluó la concentración espermática y la motilidad progresiva. Los espermatozoides de cada eyaculado fueron procesados como muestras frescas y refrigeradas. Los espermatozoides frescos fueron resuspendidos en medio Fert Talp en cantidad suficiente para lograr una concentración de 5 x 106 espermatozoides/mL y los que se refrigeraron, se resuspendieron en diluyente en base a TRIS en proporción 2:1 (TRIS-semen), yema de huevo, ácido cítrico, fructosa y antibióticos, en cantidad suficiente para lograr una concentración de 200 x 106 espermatozoides/mL, manteniéndolos a 4 ºC por 24 horas. Tanto los espermatozoides frescos (control) como los refrigerados/entibiados, se incubaron en medio de cultivo Fert Talp por periodos de 0 a 3 h para inducir la capacitación espermática. Posterior a cada tiempo de incubación los espermatozoides fueron sometidos a extracción proteica, las que fueron separadas utilizando electroforesis. Luego, a través de Western Blot, las proteínas en estudio se incubaron con el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10, en donde se observaron bandas correspondientes a proacrosina y las formas activas -acrosina y β-acrosina en cada tiempo de capacitación espermática en los espermatozoides caninos frescos y en los refrigerados. La densidad óptica de las bandas se analizó mediante análisis de varianza y posterior prueba de Tukey. Los resultados en espermatozoides frescos mostraron que tanto proacrosina como la forma activa -acrosina no cambiaron en forma significativa durante los diferentes tiempos de incubación, sin embargo, β-acrosina presentó una mayor actividad a partir de la 2 h de incubación (p < 0,05). En espermatozoides refrigerados, la reactividad con el anticuerpo, de proacrosina como tampoco las de sus formas activas  y β, mostró diferencias significativas durante los diferentes periodos. Sin embargo, al comparar la reactividad presentada por proacrosina,  y β-acrosina entre espermatozoides frescos y aquellos sometidos a refrigeración, proacrosina no presentó diferencias significativas entre ambos tratamientos. Se obtuvieron valores mayores (p  0,05) de densidad óptica de -acrosina en espermatozoides refrigerados, a partir de las 3 horas de incubación. En relación a β-acrosina, se pudo observar una mayor reactividad de esta molécula con el anticuerpo al inicio del período de capacitación, en espermatozoides refrigerados en comparación a los frescos. A partir de la segunda hora de capacitación in vitro, no se observaron diferencias significativas en la detección de - acrosina entre estos tipos de espermatozoides. En conclusión, los espermatozoides caninos refrigerados, presentaron una activación más temprana de proacrosina hacia su forma activa β-acrosina, en comparación con los espermatozoides caninos frescos, durante la incubación para capacitación a que fueron sometidos / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1060602-1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La refrigeración de semen equino es una técnica de reproducción asistida que ha ido aumentando su uso y desarrollo en los últimos años, ya que permite el almacenamiento y transporte de semen manteniendo su fertilidad potencial por alrededor de 24 horas. El objetivo del presente estudio fue el de evaluar el uso de distintas marcas de leches descremadas comerciales como diluyente de refrigeración de semen equino, comparándolas entre ellas en su efecto sobre sus características de motilidad espermática. El estudio fue realizado con cuatro potros pura sangre chileno, obteniéndose cuatro eyaculados por padrillo. Cada eyaculado fue filtrado y evaluado en sus características de concentración espermática, volumen total y libre de gel, motilidad total (MT) y motilidad progresiva (MP); esta evaluación fue considerada a tiempo 0 (T0). Cada eyaculado fue fraccionado en cuatro partes, siendo cada fracción homogeneizada con una distinta marca de leche descremada (Colun®, Loncoleche®, Soprole® y Surlat®). Cada dilución de semen fue almacenada en refrigeración a 4° C y evaluada en sus características de MT y MP mediante microscopía cada 24 horas hasta las 72 horas de almacenamiento. Los valores de MT y MP fueron más altos (p < 0,05) en la evaluación inicial, disminuyendo progresivamente en el tiempo hasta obtener los menores valores tras 72 horas. Las leches con mejores resultados (Colun® y Soprole®) no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre ellas, obteniendo los mejores valores en todos los tiempos evaluados, tanto para MT como para MP. Las leches que obtuvieron los menores valores para MT y MP (Loncoleche® y Surlat®) tampoco presentaron diferencias entre ellas (p < 0,05). El potro jugó un rol importante en la mantención de la motilidad, influyendo considerablemente en los resultados. Al diluir semen de los potros con mejor motilidad con las leches que mejor mantenían la motilidad espermática, se permitió la mantención de esta hasta por 48 horas de refrigeración; y las otras marcas hasta por 24 horas. De esta manera la elección de una determinada marca de leche descremada permite la utilización de semen para inseminar hasta por 48 horas al mantenerlo a 4° C

Orientador: Marion Burkhardt de Koivisto / Banca: Gisele Mingoti / Banca: Cássia Orlandi / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o empacotamento da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozoides criopreservados de touros Bos taurus indicus da raça Nelore de diferentes idades e a influência do grau de compactação da cromatina na produção in vitro de embriões (PIV). Foram utilizados 40 animais mantidos em centro de coleta e processamento de sêmen (CCPS) e distribuídos em três grupos: Grupo Jovens (entre 1,8 e 2 anos), Grupo Adultos (entre 3,5 e 7 anos) e Grupo Senis (entre 8 e 14,3 anos). Os ejaculados foram congelados de acordo com os padrões pré-estabelecidos do CCPS. Utilizou-se a coloração de azul de toluidina, que permite a avaliação simultânea da cromatina e morfometria da cabeça espermática, a cromomicina A3 (CMA3) para analisar a protaminação espermática e a PIV para o desenvolvimento embrionário. O azul de toluidina foi avaliado pela microscopia óptica e a CMA3 pelo citômetro de fluxo. Na PIV foram realizadas quatro repetições por grupo, com 25 a 30 oócitos em cada repetição. A análise seminal revelou que espermatozoides de touros jovens obtiveram maiores valores de área (A), perímetro (P) e largura (L) quando comparados a adultos e senis (Jovens: A=1848,5±119,79, P=10,23±0,29, L=1,95±0,1; Adultos: A=1672,9±104,46, P=9,86±0,33, L=1,81±0,06; Senis: A=1723,1±124,41, P=9,97±0,33, L=1,83±0,09; P<0,0001) e apresentaram maior deficiência de protaminação quando analisado pela CMA3 (Jovens: 1,57±0,76; Adultos: 1,09±0,63, Senis: 0,90±0,59; P<0,05). Da mesma forma, variáveis de tamanho (A, P, L) e protaminação espermática, avaliado pela CMA3, obtiveram correlação negativa com a idade e positiva com a elipsidade (P<0,05). Espermatozoides com anormalidades na cromatina obtiveram maior área quando comparado àqueles sem alteração de cromatina (P<0,0001). Não houve diferença significativa na PIV quando sêmen com maior e menor parcela de alteração de cromatina foi ... / Abstract: The aim of this study was to evaluate chromatin condensation and sperm head morphometry of cryopreserved semen samples from Bos taurus indicus bulls of different ages and the influence of the degree of chromatin condensation on in vitro embryo production (IVP). A total of 40 animals kept in an Artificial Insemination Centre were divided into three groups: Young Group (1.8 to 2 years), Adult Group (3.5 to 7 years) and Senile Group (8 to 14.3 years). The ejaculates were frozen in accordance with established standards of the Artificial Insemination Centre. The thawed semen samples were evaluated with toluidine blue, which analyzes the chromatin condensation and sperm head morphometry simultaneosly, chromomicin A3 (CMA3) to analyze the protamination and in vitro embryo production to analyze the embryonic development. The toluidine blue was evaluated by optical microscopy and the CMA3 by flow cytometry. Semen analyses revealed that spermatozoa of young bulls had higher values of area (A), perimeter (P) and width (W) when compared to adults and senile (Young: A = 1848.5 ± 119.79, P = 10. 23 ± 0.29, W = 1.95 ± 0.1; Adults: A = 1672.9 ± 104.46, P = 9.86 ± 0.33, W = 1.81 ± 0.06; Senile: A = 1723.1 ± 124.41, P = 9.97 ± 0.33, W = 1.83 ± 0.09; P<0.0001) and had higher protamination deficiency when analyzed with CMA3 (Young: 1.57 ± 0.76, Adults: 1.09 ± 0.63, Senile: 0.90 ± 0.59, P<0.05). Variable size (A, P, W) and sperm protamination evaluated by CMA3 showed negative correlation with age and a positive with ellipticity (P<0.05). Spermatozoa with abnormal chromatin obtained larger area when compared to those with normal chromatin (P<0.0001). There was no significant difference in IVP using semen with higher and lower altered chromatin condensation, evidencing that the proportion of spermatozoa with abnormal chromatin (4 to 16.15%) did not affect the embryonic development. Our results indicate that sperm head of young bulls are ... / Mestre

A degeneração testicular é a mais frequente afecção reprodutiva em machos e leva a queda da qualidade espermática e, consequentemente, da fertilidade. Uma das principais causas é o estresse térmico, sendo caracterizada pelo aumento na produção de espécies reativas ao oxigênio, assim, substâncias antioxidantes podem reduzir os impactos negativos ao sêmen desses animais. A melatonina tem alto fator antioxidante, além de atuar na proteção ao DNA espermático e na regulação da apoptose. O presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos do tratamento exógeno com melatonina de longa ação sobre a recuperação do quadro de degeneração testicular em touros da raça Nelore. Para tal, foram realizados dois experimentos. O experimento 1 foi realizado para definir a dose exógena de melatonina (diluída em veículo oleoso e administrada por via intramuscular) que provocaria aumento por tempo prolongado na concentração sérica da mesma em bovinos. Foram utilizadas nove vacas ovariectomizadas distribuídas em três grupos: Controle (somente veículo oleoso); Melatonina 18 mg/50 kg de peso vivo; e Melatonina 27 mg/50 kg de peso vivo. Foram colhidas amostras de sangue no dia da aplicação e 4, 8, 16 e 24 dias após. A concentração de melatonina foi dosada pela técnica de ELISA. Os dados foram analisados utilizando o software Statistical Analysis System (SAS), pela ANOVA, adicionando-se o fator medidas repetidas no tempo. As probabilidades de interações ao longo do tempo foram determinadas pelo comando RANDOM (PROC GLIMMIX do SAS), com nível de significância de 5%. A aplicação de melatonina intramuscular diluída em veículo oleoso, na concentração de 18 mg/50 kg de peso vivo, provocou aumento estável por oito dias na concentração sérica de melatonina em bovinos. No experimento 2 foi avaliado o tratamento com melatonina sobre a degeneração testicular em touros, utilizando a dose estabelecida no experimento 1. A degeneração testicular foi induzida pela colocação de bolsas insuladoras testiculares por 96 horas. Foram utilizados 22 touros da raça Nelore distribuídos em 4 grupos: CON - touros não induzidos à degeneração testicular e não tratados (n=5); DT - touros induzidos à degeneração testicular e não tratados (n=6); ME - touros não induzidos à degeneração testicular e tratados com melatonina exógena (n=5); e DTME - touros induzidos à degeneração testicular e tratados com melatonina exógena (n=6). Foram realizadas colheitas de sêmen e sangue semanalmente, iniciando-se duas semanas antes da colocação das bolsas testiculares; no dia da retirada; e por mais 11 semanas após. Foram analisadas as características clínicas, tais como perímetro escrotal, consistência testicular, homogeneidade testicular (presença de pontos hipercóicos) e hemodinâmica do parênquima e plexo pampiniforme e índice de resistência vascular. As características seminais avaliadas foram volume, concentração, motilidade e vigor subjetivos, análise computadorizada dos espermatozoides, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial, morfologia espermática, peroxidação lipídica e bioquímica do sêmen. O plasma sanguíneo foi utilizado para avaliar a peroxidação lipídica e componentes bioquímicos (proteína total, albumina, GGT, AST, ALT, creatina quinase, triglicérides, colesterol, HDL, BHB e NEFA). Os dados foram analisados utilizando o software SAS, pela ANOVA, adicionando-se o fator medidas repetidas no tempo. As probabilidades de interações ao longo do tempo foram determinadas pelo comando RANDOM (PROC GLIMMIX do SAS), com nível de significância de 5%. A insulação provocou queda na consistência testicular, motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial, bem como aumentou os defeitos espermáticos e a peroxidação lipídica. O tratamento com melatonina não mostrou influência sobre as características clínicas; contudo, apresentou melhora no vigor (p=0.05), na motilidade total (p=0.05) e no potencial mitocondrial (p=0.003) 15 dias após a aplicação da melatonina. Além disso, a melatonina diminuiu os valores de HDL, colesterol e BHB. O tratamento da degeneração testicular em touros (28 dias após a insulação) utilizando melatonina exógena em veículo de liberação lenta, na dose de 18 mg/kg, é eficiente em melhorar características de vigor, motilidade e potencial mitocondrial espermático. / Testicular degeneration is the most frequent reproductive affection in males and leads to a decrease in sperm quality and, consequently, fertility. One of the main causes is heat stress, being characterized by the increase in the production of reactive oxygen species, thus, antioxidant substances can reduce the negative impacts to the semen of these animals. Melatonin has a high antioxidant factor, besides acting in the protection of sperm DNA and in the regulation of apoptosis. The present study aimed to evaluate the effects of exogenous treatment with long acting melatonin on the recovery of testicular degeneration in Nellore bulls. Therefore, two experiments were conducted. Experiment 1 was performed to define the exogenous dose of melatonin (diluted in oily vehicle and administered intramuscularly) which would cause a prolonged increase in serum concentration of melatonin in cattle. Nine ovariectomized cows were divided into three groups: Control (only oily vehicle); Melatonin 18 mg/50 kg of body weight; and Melatonin 27 mg/50 kg of body weight. Blood samples were collected on the day of application and at 4, 8, 16 and 24 days after administration. The melatonin concentration was measured by ELISA. The data were analyzed using the Statistical Analysis System (SAS) software, by ANOVA, adding the factor repeated measures in time. The probabilities of interactions over time were determined by the RANDOM command (PROC GLIMMIX from SAS), with a significance level of 5%. The application of intramuscular melatonin, diluted in oily vehicle at the concentration of 18 mg/50 kg of live weight, caused stable increase for eight days in the serum concentration of melatonin in cattle. In experiment 2 was evaluated melatonin treatment on testicular degeneration in bulls, using that dose assessed in the experiment 1. Testicular degeneration was induced by the placement of testicular insulation bags for 96 hours. Twenty two Nelore bulls were distributed in 4 groups: CON - bulls not induced to testicular degeneration and untreated (n = 5); DT - bulls induced to testicular degeneration and untreated (n = 6); ME - bulls not induced to testicular degeneration and treated with exogenous melatonin (n = 5); and DTME - bulls induced to testicular degeneration and treated with exogenous melatonin (n = 6). Semen and blood samples were collected weekly, starting two weeks before the placement of testicular bags; on the day of removal; and for another 11 weeks thereafter. Clinical characteristics such as scrotal perimeter, testicular consistency, testicular homogeneity (presence of hypercoic points) and parenchyma and pampiniform plexus hemodynamics and the vascular resistance index were analyzed. The seminal characteristics evaluated were subjective volume, concentration, motility and vigor, computerized analysis of spermatozoa, plasma, acrosomal and mitochondrial membranes, sperm morphology, lipid peroxidation and biochemistry of semen. Blood plasma was used to evaluate lipid peroxidation and biochemical components (total protein, albumin, GGT, AST, ALT, creatine kinase (CK), triglycerides, cholesterol, HDL, BHB and NEFA). Data were analyzed using the SAS software by ANOVA, adding the factor repeated measures in time. The probabilities of interactions over time were determined by the RANDOM command (PROC GLIMMIX from SAS), with a significance level of 5%. Insulation caused reduction on testicular consistence, motility, integrity of plasma membranes, integrity of acrosome, mitochondrial potential, as well as increased sperm defects and lipid peroxidation. Treatment with melatonin showed no influence on clinical characteristics, however, showed improvement in vigor (p = 0.05), total motility (p = 0.05) and mitochondrial potential (p = 0.003) 15 days after melatonin application. Besides that, melatonin decreased HDL, cholesterol and BHB values. The treatment of testicular degeneration in bulls (28 days after insulation) using exogenous melatonin in a slow-release vehicle, at a dose of 18 mg/kg, is efficient in improving sperm characteristics of vigor, motility and mitochondrial potential.

A resposta inflamatória uterina pós-cobertura ocorre para remoção de espermatozoides e contaminantes; todavia, o atraso em debelar este processo têm sido identificado, em equinos, como a principal causa de endometrite persistente pós-cobertura. A pentoxifilina atua como um inibidor da fosfodiesterase e aumenta as características de motilidade espermática, ainda tem sido relatada sua participação como agente reológico, aumentando o fluxo sanguíneo de tecidos comprometidos, e como agente imunomodulador. O propósito deste estudo foi examinar os efeitos da pentoxifilina adicionada ao diluidor seminal pós-descongelação, sobre a motilidade espermática, membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e integridade de cromatina, bem como sobre a resposta inflamatória uterina após a inseminação artificial de éguas. Dez partidas de sêmen de um único garanhão foram criopreservadas (100x106 espermatozoides/palheta 0,5 mL) em sistema automatizado (TK 3000) e mantidas em botijão criogênico, sendo posteriormente utilizadas para análises laboratoriais e inseminação artificial. Para análise laboratorial duas palhetas de sêmen de cada partida foram descongeladas (37ºC/30 segundos) e diluídas em diluidor à base de leite desnatado (controle) e diluidor à base de leite desnatado contendo pentoxifilina (7,18 mM). As alíquotas de cada tratamento foram mantidas em banho-Maria seco (37°C) e analisadas em quatro momentos: 5 (T0), 30 (T30), 60 (T60) e 120 minutos (T120) pós-diluição e incubação. As amostras foram analisadas quanto às características de movimento espermático, por sistema computadorizado de análise espermática (CASA), membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial por associação de sondas fluorescentes (PI, H342, FITC-PSA e JC-1), morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e integridade da cromatina pelo Azul de Toluidina. Para avaliar os efeitos do diluidor contendo ou não pentoxifilina na resposta inflamatória uterina, foram utilizadas 15 éguas distribuídas em cinco grupos: Grupo Control (controle): sem deposição de sêmen, nem diluidor, mimetizando-se o procedimento da IA; Grupo SM Extender: deposição de diluidor sem pentoxifilina (Botusemen®, Botupharma); Grupo SM Extender + PTX: deposição de diluidor contendo pentoxifilina; Grupo Sêmen: deposição de sêmen diluído com diluidor sem pentoxifilina; Grupo Sêmen + PTX: deposição de sêmen diluído com diluidor contendo pentoxifilina (7,18 mM). A hemodinâmica uterina foi avaliada por ultrassonografia nos modo color e espectral realizadas nos períodos: imediatamente antes da indução da ovulação (aproximadamente 30 horas antes da IA, T-30), imediatamente antes da inseminação artificial (TIA) e 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) e 48 (T48) horas após a inseminação artificial. Uma amostra para citologia endometrial foi coletada, por escova ginecológica no momento T6. A análise estatística foi realizada utilizando-se análise de variância (ANOVA), sendo as médias comparadas pelo LSD test, SAS versão 9.3 (2010). A adição de pentoxifilina não exerceu efeito sobre a motilidade progressiva, porém, a pentoxifilina aumentou velocidade de trajeto, velocidade progressiva e velocidade curvilinear quando comparada ao controle. Não houve diferença significativa na porcentagem de células apresentando membrana plasmática intacta, acrossoma intacto e alto potencial mitocondrial (PIAIC). Nenhuma diferença estatística foi encontrada no fluxo sanguíneo uterino de éguas após os tratamentos. Porém, a citologia endometrial demonstrou maior resposta inflamatória em grupos contendo pentoxifilina quando comparado aos controles. Concluiu-se que a pentoxifilina exerce efeito positivo sobre parâmetros de velocidade, mas não influencia as membranas celulares e a cromatina. No entanto, quando as éguas são inseminadas com sêmen contendo pentoxifilina, uma resposta inflamatória mais intensa é observada. / The post breeding uterine inflammatory response occurs due to remove spermatozoa and contaminants; however, delayed uterine clearance has been identified, in equines, as the underlying cause of persistent post breeding endometritis. Pentoxifylline acts as a phosphodiesterase inhibitor and increases sperm motion characteristics, and it has been reported to participate as a rheologic agent, improving blood flow to compromised tissues, and as an immunomodulatory agent. The purpose of this study was to examine the effects of pentoxifylline added to the seminal extender after thawing, on sperm motion, plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes and chromatin integrities, as well as the uterine inflammatory response on mares after artificial insemination. Ten batches of a unique stallion were cryopreserved (100x106 spermatozoa/0.5 mL straws), in an automated system (TK 3000) and storaged in cryogenic cylinder for posterior use for laboratory analysis and artificial insemination. For laboratory analysis two semen straws of each batch were thawed (37°C/30 seconds) and diluted in skim milk based extender (control) or diluted in skim milk extender containing pentoxifylline (7.18 mM). Aliquots of each treatment were maintained in dry water bath (37°C) and analyzed at four moments: 5 (T0), 30 (T30), 60 (T60) and 120 minutes (T120) post dilution and incubation. Samples were analyzed for sperm motion characteristics, through Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes through fluorescent probes association (PI, H342, FITC-PSA and JC-1), spermatic morphology through differential interference contrast and chromatin integrity through Toluidine blue. To examine the effect of extender containing or not pentoxifylline on uterine inflammatory response 15 mares were divided into 5 groups: Group Ccontrol (control): no uterine deposition of semen, or extender, just mimicking the AI procedure; Group SM Extender: deposition of skim milk based extender (Botusemen®, Botupharma); Group SM Extender + PTX: deposition of skim milk based extender containing Pentoxifylline; Group Semen: deposition of semen diluted with extender only; Group Semen + PTX: deposition of semen diluted with extender containing Pentoxifylline (7,18 mM). Uterine hemodynamics were examined through color and spectral mode ultrasonography on moments: immediately before ovulation induction (approximately 30 hours before AI, T-30), immediately before artificial insemination (TAI) and 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) and 48 (T48) hours after artificial insemination. Samples for endometrial cytology were collected, through cytobrush at T6 moment. Statistical analysis was performed using the analysis of variance (ANOVA), and the range was compared by LSD test, SAS 9.3 version (2010). Pentoxifylline addition did not exert effect on progressive motility, however, pentoxifylline increased path velocity, progressive velocity and curvilinear velocity when compared to controls. There were no significant differences on the percentage of cells presenting intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential (IPIAH). No statistical difference was found on uterine blood flow of mares after treatments. However, endometrial cytology showed a major inflammatory response on groups containing Pentoxifylline when compared to controls. In conclusion, pentoxifylline exerted a positive effect on velocity parameters, but do not influence cellular membranes and chromatin. Furthermore, when mares were inseminated with semen containing pentoxifylline, an intense inflammatory response was observed.

Os répteis compõem hoje uma classe com mais de 8.000 espécies e em razão das restrições na importação desses animais, o risco na introdução de doenças exóticas, o crescente número de espécies ameaçadas no mundo, entre outros, a reprodução e a manutenção em cativeiro desses animais é muito importante. No Sul da Califórnia, que é considerado um Hotspot para a biodiversidade, a Zoological Society of San Diego mantém uma reserva ecológica com aproximadamente 400 hectares e formada por vegetação tipo Chaparral, Coastal Sage Scrub e áreas cobertas por cactos (Opuntia sp.). Durante o período de junho de 2005 a julho de 2006 foram capturadas 96 cascavéis das espécies Crotalus ruber ruber, C. oreganus helleri e C. mitchellii phyrrus, durante os trabalhos de campo pela procura visual limitada por tempo. Foram realizadas avaliações morfológicas e reprodutivas em todas essas serpentes capturadas. Nos machos realizou-se a colheita e avaliação de sêmen, incluindo duas colorações específicas para avaliar integridade de membrana espermática e do acrossoma. Nas fêmeas foi realizada a avaliação ultra-sonográfica dos ovários, com mensuração e contagem de folículos, além do diagnóstico de gestação. Para a C. ruber ruber, a serpente mais abundante neste estudo, foram observadas fêmeas prenhes no verão e vitelogênicas na primavera, outono e inverno. Apenas as fêmeas desta espécie com condição corporal boa ou muito boa apresentaram-se vitelogênicas ou prenhes. Nos machos dentre as características seminais avaliadas, não foi observada a diferença estatisticamente significante ao longo das estações do ano. Em paralelo a este estudo, também foram testados protocolos para a congelação de sêmen de serpentes, com a obtenção de resultados promissores, discutidos em capítulo específico. As informações obtidas neste estudo visam contribuir para a compreensão da biologia reprodutiva e conservação das serpentes, em cativeiro ou vida-livre. / There are more than 8,000 reptile species in world. Today´s restrictions to importation of these species around world, the risk of introduction of exotic diseases, the growing number of endangered reptiles, among other reasons, emphasize the importance of reproduction in captivity and ex-situ conservation. South California is a Hotspot for biodiversity and the Zoological Society of San Diego maintains a nature preserve in Escondido City. In an area of about 400 hectares, composed by vegetation types like Chaparral and Coastal Sage Scrub, it has been found the greatest diversity of snake in region. Between May 2005 and July 2006, 96 rattlesnakes of species Crotalus ruber ruber, C. oreganus helleri and C. mitchellii phyrrus were captured by active searching during field work. In the Laboratory of Reproductive Physiology the snakes were measured, weighted, and marked the captured snakes. We evaluated their body condition, collected and evaluated semen from males and performed ultrasound exams in females. Snakes were released up to 24 hours after capture. The Crotalus ruber ruber studied initiated vitellogenesis in fall, courtship and mating occurred in spring and gravid snake were observed in spring and summer. Only females with a good or very good body condition were in secondary vitellogenesis or gravid. There were no statistical differences in seminal parameters among season in males of the Crotalus ruber ruber. Protocols to freeze snake´s semen were tested in this study, with positive results that are discussed in specific chapter. This study results contribute to understand of snake´s biology of reproduction and in or ex-situ conservation.

Foi conduzida uma série de experimentos onde se buscou definir: 1) o limite de tolerância do espermatozóide caprino a soluções hiperosmóticas de sacarose; 2) um diluente para criopreservação de sêmen que minimizasse as flutuações de volume celular. O limite de tolerância da membrana, avaliado pelo corante eosina-nigrosina, foi de 930 mOsm em soluções de sacarose em Ringer-lactato a 38oC. Os danos à integridade de membrana (IM), em osmolalidades acima deste valor, se estabeleceram no primeiro minuto de exposição e não se agravaram até 10 minutos depois. A motilidade (MOT) foi mais afetada que a IM. A rediluição abrupta em meio isosmótico causou dano extenso e proporcional ao grau de desidratação prévia. Nos experimentos seguintes, adição de 375 mM de sacarose ao diluidor TRIS-gema com 6,8% de glicerol (TGG), 5 minutos antes da congelação, resultou em MOT e IM similares ao controle TGG sem sacarose. Descongelação e rediluição a 4oC favoreceram a MOT e, a 38oC, favoreceram a IM. O diluente TRIS-gema com 375 mM de sacarose e concentração de glicerol reduzida para 1,7% apresentou melhor MOT e IM que o controle (65% e 187% vs 52% e 100%, respectivamente). A MOT após 2 h e o vigor após 6 h foram maiores quando a rediluição pós-descongelação foi em 5 passos se comparado a 3 passos (28% e 9% vs 19% e 2%, respectivamente). Na fase seguinte do trabalho, diluentes elaborados com 300 mM após 6 h a 38oC, melhor MOT e vigor que o controle (33% e 26% vs 15% e 10%, respectivamente). A descongelação a 20oC favoreceu a MOT e o vigor nos tempos zero, 2 h e 6 h pós-descongelação em todos os grupos contendo sacarose. O etilenoglicol não diferiu do glicerol na concentração de 3,4% quando adicionado a diluente contendo 300 mM de sacarose. Nestes diluentes, a rediluição em 5 passos a 20oC não diferiu em MOT e IM da feita em 1 passo a 38oC. No último experimento, sêmen congelado em diluente contendo 300 mM de trealose e zero% de glicerol mostrou melhor IM após descongelação em um passo a 38oC (320% vs 100% no controle) e maior MOT às 6 h após descongelação e rediluição em 5 passos a 20oC (56% vs 26% no controle). Conclui-se que o sêmen caprino tolera soluções de sacarose até o limite de 930 mOsm, mas a rediluição deve ser progressiva. A desidratação parcial, causada por soluções concentradas de sacarose ou trealose, permite a congelação de sêmen sem adição de crioprotetores permeantes. Os melhores resultados foram obtidos em diluente TRIS-gema sem glicerol e adicionado de 300 mM de trealose. / The objective of this study was to: 1) define the tolerance limits of goat sperm to hyperosmotic sucrose solutions; 2) establish an extender that minimizes cell volume variations during the processes of freezing and thawing. Boer goat semen was diluted with Ringer-lactate-Sucrose solutions at 38oC. The hyperosmotic tolerance limit was 930 mOsm evaluated with eosin-nigrosin stain. At osmolalities above this value, damage was evident after 1 min and was not affected by further exposure. Redilution in a single step resulted in massive membrane damage that was nearly proportional to the dehydration intensity previously undergone. Motility (MOT) was more distinctly impaired than membrane integrity (MI). In the next experiments, addition of 375 mM sucrose (Suc) 5 min previous to freezing to TRIS-egg yolk extender containing 6.8% glycerin (TYG) resulted in sperm motility (MOT) and MI similar to control extender TYG without sucrose. Thawing and redilution at 4oC affected favorably the MOT, and at 38oC, was favorable to MI. When freezing in TRIS-egg yolk-Suc extenders with low glycerin concentration (1.7%) MOT and MI were significantly higher than in the control TYG (65% and 187% vs 52% and 100%, respectively). MOT 2 h after thawing and intensity of motility (INTMOT) after 6 h after thawing were better preserved after a redilution of 5 increasing volume-steps than after redilution of 3 steps (28% and 9% vs 19% and 2%, respectively). In sequence, extenders containing 300 mM sucrose and thawed-rediluted 5 steps at 20oC improved MOT and INTMOT after 6 h (33% and 26% vs 15% and 10% in the control Group). The thawing-redilution at 20oC improved the results in all groups containing sucrose. At a concentration of 3.4% added to TRIS-yolk extender with 300 mM sucrose, the cryoprotectant ethylene glycol gave similar results as glycerin. MOT and INTMOT in the different time intervals were not influenced by redilution in 5 steps at 20oC or in one step at 38<SUPoC. In the last experiment made, semen frozen in a TRIS-yolk extender with 300 mM trehalose and devoid of glycerin showed the best MI after thawing-redilution in 1 step at 38oC (320% vs 100% in the control Group). The highest MOT after 6 h incubation was observed when this group was thawed-rediluted at 20oC in 5 steps (56% vs 26% in the control). From the results obtained it may be concluded that the upper tolerance limit of goat spermatozoa to hyperosmotic sucrose solutions is 930 mOsm. The redilution and return to isosmolality should be stepwise made. Goat semen can be frozen in extenders devoid of permeant cryoprotectants like glycerin when, previous to freezing, the cells are partially dehydrated by concentrated sucrose or trehalose solutions. The best survival rate was obtained when freezing goat spermatozoa in a glycerin-free TRIS-yolk-extender containing 300 mM of trehalose.

A jararaca-ilhoa (Bothrops insularis) é uma serpente endêmica e criticamente ameaçada de extinção que atualmente possui uma população estimada de 2.100 indivíduos restritos a uma única ilha no Estado de São Paulo, a Ilha da Queimada Grande. Esta vulnerabilidade levou à criação de um programa de reprodução em cativeiro para a espécie que, entre outras ações, propõe o desenvolvimento e aplicação de biotécnicas reprodutivas, tais como avaliação e preservação seminal e inseminação artificial. Este trabalho teve como objetivos: (1) avaliar três diluidores (HAM F-10, ACP-120&reg; e BWW) em três diluições diferentes (1:100, 1:200 e 1:500 &micro;L) e determinar qual o melhor protocolo de incubação para o sêmen de B. insularis; (2) avaliar um protocolo de inseminação artificial na espécie e (3) avaliar três diferentes sistemas de refrigeração (geladeira, banho-maria em geladeira e isopor tipo BotuFLEX&reg; )a fim de determinar qual deles é capaz de preservar melhor a motilidade do sêmen da jararaca-ilhoa por um período de até 48 h. Verificamos que as amostras de sêmen diluídas com o meio HAM F-10 na diluição 1:100 &micro;L apresentaram os melhores resultados para motilidade e motilidade progressiva e, desta forma, foi o protocolo de diluição seminal eleito para a inseminação artificial realizada. O protocolo de inseminação artificial foi realizando de maneira segura e minimamente invasiva nos animais, no entanto, até o momento não houve detecção de prenhez nas fêmeas inseminadas. A refrigeração se mostrou um método eficiente para a manutenção da motilidade e motilidade progressiva do sêmen de B. insularis por até 48 h pois, no período de duração do experimento, não foi verificada queda significativa nos parâmetros avaliados em nenhum dos sistemas de refrigeração. Foi observada, ao longo deste trabalho, uma alta incidência de decapitações nos espermatozoides de boa parte dos machos, o que pode comprometer seriamente a fertilidade do plantel estudado. Acreditamos, com os resultados deste projeto, ter elucidado questões fundamentais acerca do melhor diluidor e diluição a ser utilizada na manipulação do sêmen de B. insularis, assim como ter demonstrado que protocolos de refrigeração seguros e versáteis são capazes de manter a motilidade seminal por até 48 h, permitindo a troca de material genético entre diferentes plantéis no Brasil ou até mesmo com a população nativa da Ilha da Queimada Grande. O conhecimento gerado a partir deste estudo também servirá como base para estudos que visem o estabelecimento e aprimoramento de outras biotécnicas reprodutivas e a criação, em um futuro breve, de um banco de germoplasma da espécie. / The golden lancehead (Bothrops insularis) is a venomous pitviper endemic from Ilha da Queimada Grande, a small island located 40 miles off the coast of southeastern Brazil. Due to its small population (about 2000 individuals), highly restricted range, continuous decrease in habitat quality and illegal trading, B. insularis is currently listed as critically endangered in the IUCN Red List. As a consequence, efforts have been directed towards the development of a captive breeding program that involves both natural and assisted reproduction. Nonetheless, successful application of assisted reproductive technologies such as artificial insemination and semen cryopreservation in B. insularis requires a clear understanding of the reproductive physiology of this species, particularly aspects of sperm quality and production, and conservation. Thus, this study aims on: (1) determining which extenders (ACP-120, BWW and HAM-F10) and dilutions are better suited for maintenance of sperm motility; (2) testing an artificial insemination protocol in B. insularis maintained in captivity; (3) evaluating three different cooling systems (refrigerator, water bath on refrigerator and BotuFLEX&reg;) to determine which one is able to preserve the semen motility of the golden lancehead for a period up to 48 hours. We found that semen samples diluted with HAM F-10 medium at a 1: 100&micro;L dilution had the best motility and progressive motility results. To date, no pregnancies have been detected in inseminated females. Therefore, further studies and the improvement of this protocol for the species are required. We observed that all three cooling methods work successfully, maintaining the motility and progressive semen motility without significant changes for 48h, which demonstrates versatility in the preservation and transportation of this material, including from field work. With our results, we have elucidated fundamental questions about both the best diluent and dilution to be used, as well as refrigeration systems that ensure the maintenance of semen motility up to 48 hours. This is crucial for allowing the exchange of genetic material between different Brazilian Institutions and the income of material from Ilha da Queimada Grande, what may minimize problems due to consanguinity, besides serving as a basis for future studies on seminal cryopreservation protocols and the creation of germplasm banks.

Le sperme est le principal vecteur de dissémination du VIH. La muqueuse colorectale exposée au sperme infecté lors de rapports anaux, aussi bien chez l’homme que chez la femme, représente le plus fort risque d’infection parmi toutes les voies de transmission sexuelle. Un nombre croissant d’études suggèrent que la transmission sexuelle du VIH via les cellules infectées présentes dans les sécrétions génitales du donneur serait plus efficace que par les particules virales libres. A ce jour, le rôle et les mécanismes de transmission des cellules infectées du sperme ont été peu étudiés. De plus, l’effet potentiel du liquide séminal (LS) sur cette transmission est mal connu. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de démontrer une transmigration active et rapide: (i) de leucocytes sanguins à travers la barrière colorectale, et un effet inhibiteur du LS sur cephénomène, sans altération de la barrière épithéliale. (ii) de leucocytes séminaux. Des analyses par cytométrie de flux ont permis de mettre évidence à la fois des particularités et des similitudes quant à l’équipement protéique des cellules séminales et de leurs équivalents sanguins. Ce travail fournit de nouvelles données sur la transmission du VIH par les cellules infectées du sperme, et sur l’effet du sperme sur la transmission colorectale. La démonstration de la transmigration de leucocytes séminaux suggère que ces cellules jouent un rôle dans la transmission du VIH au niveau colorectale qui nécessite d’être pris en compte dans les stratégies de prévention. Les mécanismes en jeu et ceux responsables de l’effet du LS restent à élucider et devrait permettre à terme de dégager de nouvelles cibles thérapeutiques. / Semen is the main vector of HIV dissemination. The colorectal mucosa exposed to semen infected cells during anal intercourse, in both men and women, represents the highest risk of infection among all sexual transmission routes. An increasing number of studies suggest that sexual transmission of HIV via infected cells present in the donor's genital secretions would be more effective than free viral particles. To date, the role and transmission mechanisms of infected sperm cells have been poorly studied. Moreover, the potential effect of seminal fluid (SF) on this transmission is poorly understood. In this context, my thesis work has demonstrated an active and rapid transmigration: (i) of blood leukocytes across the colorectal barrier, and an inhibitory effect of SF on this phenomenon, without altering the epithelial barrier. (ii) of seminal leucocytes. Flow cytometry analyzes have revealed both features and similarities in the protein equipment of seminal cells and their blood equivalents. This work provides new data on HIV transmission by infected sperm cells, and on the effect of semen on colorectal transmission. Demonstration of transmigration of seminal leukocytes suggests that these cells play a rôle in colorectal HIV transmission that needs to be considered in prevention strategies. The mechanisms involved and those responsible for the effect of SF remain to be elucidated and should eventually lead to new therapeutic targets.

Amelioration of orchid seed sown with fungal inoculum was tested in in situ experiment in White Carpathian Mountains. The thesis evaluated reintroduction potential of four meadow orchids (Orchis mascula, Anacamptis pyramidalis, Platanthera bifolia and Gymnadenia conopsea) to restored grasslands.