Les études sur modèle animal sont essentielles pour l'élaboration de nouveaux antidépresseurs, à la compréhension de leurs mécanismes d'action et aux mécanismes de la physiopathologie de la dépression. Des facteurs génétiques jouent un rôle important dans l'étiologie des troubles de l'humeur. Notre équipe de recherche a créé un modèle basé sur la reproduction dirigée de souris présentant un trait comportemental relatif à la symptomatologie dépressive en se basant sur les performances obtenues dans l'épreuve de suspension par la queue, obtenant ainsi une lignée résignée et une lignée non résignée . Au cours de ces travaux, nous avons validé un protocole de résignation apprise (RA) chez la souris CD1. Cette épreuve consiste en i) une période de conditionnement, ii) une période de test. Il a été montré que 4 périodes de conditionnement avec des chocs à 0,3 mA sont nécessaires à l'obtention d'une résignation. Un second protocole de RA, sur 3 semaines, a également été validé chez la souris CD1 consistant en 4 périodes de conditionnement suivies de tests à J5, J10, J15 et J20. L'introduction d'un « rappel » de choc en J8 a permis d'entretenir la résignation jusqu'en J20 contrairement à un protocole identique sans rappel. Ce nouveau protocole s'avère être particulièrement adapté pour étudier les effets de traitements chroniques. Deux autres modèles animaux de dépression (issues de 8 souches de souris différentes) ont été également crées dans le laboratoire sur la base de performances dans l'épreuve de suspension par la queue (TST) ou l'épreuve de nage forcée (FST). Les résultats révèlent que les modèles issus de 8 souches criblés au TST ou au FST présentent des caractéristiques neurochimiques différentes, qui en plus d'un comportement différent dans l'épreuve de résignation apprise, confirment que ceux sont bien deux modèles animaux distincts / Studies on animal models are essential to the development of new antidepressants, to the understanding of their mechanisms of action and to the mechanisms underlying depressive disorders. Genetics factors play an important role in the etiology of mood disorders. Our research team elaborated a model based on the selective breeding of mice displaying a behavioural trait of the depression symptomatology. On the basis of the behaviour in the TST, two strains of mice with “helpless” or “non helpless” phenotype were developed. During this work, we validated a learned helplessness protocol in CD1 mice. This paradigm consists in i) a conditioning period. ii) an escape test. It has been found that 4 conditioning periods with 0.3 mA shocks were necessary to induce helplessness. A second learned helplessness protocol was developed in CD1 mice, consisting in 4 conditioning periods followed by escape test in D5, D10, D15 and D20. A “shock reminder” at D8 allowed to maintain helplessness up to D20. This new protocol is particularly appropriate for investigating effects of chronic treatments. The selective breeding lines (from 8 strains of mice) were based on their performance in either the tail suspension test or the forced swimmed test. The results confirmed that lines models (bred from 8 lines) have not only behavioural differences but also display different biochemical characteristics

Les effets négatifs des produits pharmaceutiques (PPs) sur les écosystèmes aquatiques est une préoccupation de plus en plus sensible. Nous avons analysé les effets du 17α-éthinylestradiol (EE2), composant des pilules contraceptives, et de la fluoxétine (FLX), l'antidépresseur le plus vendu au monde, sur deux poissons. Le pejerrey (Odontesthes bonariensis) vit dans des lagunes qui sont des réservoirs d'eaux usées, où la présence d'EE2 est détectée. En utilisant l'expression des gènes cyp19a1b (aromatase cérébrale) et cyp19a1a (aromatase gonadique) comment marqueurs biologiques nous avons constaté que l'exposition à EE2 n'affectait pas l'expression du gène cyp19a1b. Cependant, augmente significativement l'expression du cyp19a1a, liée à la différenciation ovarienne, et diminue l'expression de hsd11b2, liée a la différenciation testiculaire, chez les larves et mâles juvéniles. Aussi, produit une déviation des ratios male/femelles en faveur des femelles chez les larves et l'apparition de caractéristiques typique du développement ovarien dans les testicules de mâles juvéniles. Chez le poisson zèbre (Danio rerio) nous avons évalué le rôle de la sérotonine (5-HT) comme modulateur de la prolifération; et l'effet de la FLX, inhibiteur sélectif de sa recapture. Tout d'abord, nous avons montré que les neurones sérotoninergiques de l'hypothalamus sont générés à partir de cellules gliales radiaires présente dans cette région. Ensuite, nous avons constaté une réduction significative du nombre de cellules en prolifération dans le noyau du recessus lateral (NRL) et posterior (NRP) de l'hypothalamus, après de l'inhibition de la synthèse de 5-HT ; et dans le NRL, après d'exposition a FLX. / Over the last 10-15 years risks of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in the environment have acquired significant relevance. In the present work we studied the effects of 17α-ethinylestradiol (EE2), component of contraceptive pills, and fluoxetine (FLX), the world’s most widely prescribed antidepressant, in fishes. Pejerrey (Odontesthes bonariensis) a south American teleost fish that inhabit aquatic ecosystems where EE2 has been reported. Exposure to EE2 did not alter the expression of cyp19a1b (brain aromatase). In contrast, expression of cyp19a1a (gonadal aromatase), involved in ovarian differentiation, was up-regulated; while expression of hsd11b2, associated with testicular differentiation, was down-regulated in larvae or juvenile males. Also, EE2 was able to shift sex ratios toward the female in larvae and alter the gonadal morphology of testicles of juvenile males. In zebrafish, a model organism considered as a useful tool in EDs screening, we investigated the potential role of serotonin (5-HT) as modulators of brain cell proliferation; in particular, we also analyzed the effects of FLX, a selective 5-HT reuptake inhibitor. We showed that 5-HT neurons of the hypothalamus originate from proliferative radial glial cells presents in this area. Treatment 5-HT synthesis inhibitor and exposure to environmentally relevant concentrations of FLX caused a significant decrease in the number of proliferating cells in the hypothalamus, resulting in a further decline in the number of own 5-HT neurons. These results provide evidence for the detrimental effect in teleost fish induced by the exposure to two pharmaceuticals considered as endocrine disruptors.

Estudos prévios demonstram projeções dos núcleos da rafe para áreas clássicas relacionadas ao controle do sistema cardiovascular, como locus coeruleus, núcleo do trato solitário, coluna intermédio lateral da medula espinal, núcleos motor dorsal do vago e ambíguo. Baseado nesta informação este estudo investigou a participação dos núcleos da rafe nas respostas adaptativas a estímulos de hipervolemia e hipovolemia. Foram utilizados ratos machos (Wistar), adultos, mantidos em biotério sob condições controladas, divididos em cinco grupos: hipovolemia (Hipo, submetidos à punção cardíaca com remoção sangüínea), controle da hipovolemia (C hipo, submetidos à punção cardíaca sem remoção sangüínea), hipervolemia (Hiper, submetidos à cirurgia para canulação da veia jugular externa e adição de solução salina no sexto dia pós-cirúrgico), controle da hipervolemia (C hiper, submetidos à cirurgia para canulação da veia jugular externa sem adição de solução salina) e basal (BS). Após 90 minutos do estímulo, os animais foram profundamente anestesiados e perfundidos transcardiacamente com salina seguida de fixador Paraformaldeído + Bórax 4%, 4ºC, pH 9,5. Os encéfalos foram removidos pós-fixados, crioprotegidos e seccionados em cortes coronais de 40 µm e processados com técnicas de imunohistoquímica contra Fos e 5-HT. Os estímulos de hipo e hipervolemia não causaram aumento significativo dos neurônios Fos-imunoreativos ou 5HT/Fos-imunoreativos. Nos núcleos Li, DR, MnR, RMg e ROb o grupo C hipo apresentou maior número de neurônios Fos-IR e 5HT/Fos-IR em relação ao grupo C hiper. Os resultados sugerem que os núcleos da rafe não participam nas repostas adaptativas aos estímulos aplicados. Entretanto, os mesmos parecem estar envolvidos em processos de nocicepção, seja através da 5-HT ou de outras substâncias neuroativas, presentes nestes núcleos. / Previous studies presented projections from the raphe nuclei to areas related to the cardiovascular control, like the locus coeruleus, nucleus of the solitary tract, spinal cord intermedium lateral column, dorsal motor vagus and ambiguus nuclei. Based in this information, the present work analyzed the participation of the raphe nuclei in the adaptative responses to hypovolaemia and hypervolaemia. Were used wistar rats, kept in controlled conditions, divided in 5 groups: hypovolaemia (Hypo, cardiac puncture and blood extraction), hypovolaemia control (C Hypo, cardiac puncture without blood extraction), hypervolaemia (Hyper, external jugular vein canulation surgery and saline addition), hypervolaemia control (C Hyper, external jugular vein canulation surgery and no saline addition) and basal condition (BS). Ninety minutes after the stimulus, the animals were anesthetized and perfused with saline followed by 4% paraformaldehyde plus borax, pH 9.5 at 4ºC. The brains were removed, pos-fixated, cryoprotected, sectioned in 40µm thickness coronal slices and proceeded with double-labeling immunohistochemistry techniques against Fos protein and serotonin. The Hypo and Hyper stimuli presented no significant increase of Fos-IR and double-labeled neurons. The C Hypo group presented higher number of labeled neurons in the Li, DR, MnR, RMg and ROb nuclei in comparison to the group C Hyper. These results suggest that the raphe nuclei have no participation in the adaptative responses to the volemy stimuli. However, this nuclei seems to be related to the nociception no modulated just by the serotonin but by others neurotransmitters too.

O estudo dos efeitos de neurotransmissores e neuromoduladores em circuitos nervosos tradicionalmente consiste em observar o comportamento de um sistema, ou parte dele, quando exposto a concentrações constantes da droga, ignorando flutuações ou padrões temporais de liberação. Neste trabalho implementamos um protocolo dinâmico e dependente da atividade do próprio sistema nervoso, que permitiu estudar experimentalmente a influência da dinâmica de liberação nos efeitos que glutamato (Glu, 1 mM) e serotonina (5-HT, 10 mM) produzem no padrão emergente de um centro gerador de padrões (CPG). Os experimentos foram realizados no sistema nervoso estomatogástrico de Callinectes sapidus e Callinectes danae (CPG pilórico) durante sua operação normal in vitro, que pode ser caracterizada por sua frequência de burst, número de spikes/burst dos neurônios, duty cycle dos neurônios, etc. A partir da atividade de um dos neurônios do CPG, medida extracelularmente, um algoritmo baseado no protocolo dynamic clamp (interação em tempo real entre tecido nervoso vivo e simulação computacional) identifica em tempo real um padrão de atividade pré-escolhido e dispara um injetor de picolitros semelhante a um picospritzer®, aspergindo uma pequena quantidade de solução com a droga nas vizinhanças dos neurônios e sinapses que compõe o CPG, de onde é retirada por perfusão contínua de solução fisiológica. Assim, podemos comparar o comportamento emergente do CPG quando este é estimulado de maneira síncrona com sua atividade ou de maneira assíncrona, mas de forma que a mesma quantidade média de droga seja aspergida nos dois casos. Nossos resultados demonstram que um mesmo estímulo apresentado de duas maneiras diferentes, para um mesmo circuito nervoso, pode produzir respostas diferentes na mesma célula. O protocolo se mostrou mais eficiente em mostrar diferenças quando a atividade da droga ocorre em uma escala de tempo menor que aquela do comportamento do CPG. Novos estudos devem ser realizados com outros neutrotransmissores e moduladores tanto de ação ionotrópica quanto metabotrópica, para se adequar o protocolo aos diferentes tipos de substâncias. / Studying the effect of neurotransmitters and neuromodulators usually consists in observing the behavior of a system, or part of it, when exposed to stationary concentrations of the drugs that completely lack any time dependency. Here we describe a protocol that we developed to study the changes of the emerging rhythmic pattern of a Central Pattern Generator (CPG) due to the effects of the aplications dynamics of tiny puffs of glutamate (Glu, 1mM) or serotonin (5-HT, 10 mM) to the neurons and their neuropil. We experimented on the stomatogastric nervous system of Callinectes sapidus and Callinectes danae (pyloric CPG) during normal operation in vitro, that was characterized using bursting frequency, neurons number of spikes/burst, their duty cycle, etc. From the extracelular activity of one of the CPG neurons, a dynamic clamp based protocol (real time interaction between living nervous tissue and computer simulation) detected in real time a given pattern of activity present in a burst and triggered a picospritzer to puff a small amount of solution with the drug in the neighborhood of the neurons and synapses of the CPG, from where it was washed through constant perfusion of normal saline. Such arrangement allowed us to address what are the differences on the emerging CPG behavior when the stimuli was activity synchronous or asynchronous, but with the same mean amount of drug delivered in both cases. In general, our results showed that the same stimulus presented in different ways to the same nervous circuit may generate different responses even in a cell level. Finally, the protocol proved to be more efficient when the drug activity time scale is smaller than the time scale of the CPG bursting behavior. In the future we should work with other neuromodulators and neurotransmiters to improve the protocol.

INTRODUÇÃO: Entre os tratamentos existentes para o transtorno obsessivocompulsivo (TOC) os mais eficazes são o farmacológico, com inibidores de recaptura de serotonina (IRS; inibidores seletivos de recaptura de serotonina [ISRS] e clomipramina), e o comportamental, baseado na técnica de exposição com prevenção de resposta (EPR). Ambas apresentam eficácia semelhante para os sintomas obsessivo-compulsivos e estudos demonstram que a EPR produz modificações neurobiológicas semelhantes às provocadas pelo tratamento com ISRS. Essas evidências sugerem que a resposta clínica à EPR está diretamente relacionada a um aumento da biodisponibilidade de 5HT no cérebro. A concentração de 5HT no sangue periférico é uma medida representativa do sistema serotonérgico central, e é utilizada como um marcador biológico indireto. O objetivo deste estudo foi comparar a concentração serotonérgica (basal e variação em 8 semanas) e a resposta à terapia comportamental baseada em EPR. MÉTODOS: Foram incluídos nesse estudo 30 pacientes com diagnóstico operacional de TOC. Destes, 29 iniciaram o tratamento, 27 chegaram até a quarta semana e 24 completaram o protocolo padronizado com 16 sessões (8 semanas) de terapia. As dosagens de 5-HT foram feitas nas semanas 0 e 8 e as avaliações clínicas pelas escalas Y-BOCS e CGI, bem como medidas de sintomas secundários (depressão, ansiedade e incapacidade) nas semanas 0, 4 e 8. RESULTADOS: Encontrou-se correlação positiva entre a concentração basal de 5HT e a resposta clínica em quatro semanas de EPR (p<0,05).Observouse maior concentração basal e maior redução em 8 semanas nos níveis de 5HT em pacientes respondedores comparados aos não respondedores. Entretanto não houve significância estatística. CONCLUSÃO: Na amostra estudada os dados sugerem que a alta concentração basal de 5-HT é um marcador biológico preditor de boa resposta clínica a quatro semanas de EPR. Amostras maiores talvez mostrassem a concentração de 5-HT no plasma rico em plaquetas como um preditor de resposta a 8 semanas de EPR. Protocolos com amostras maiores e com grupos controle são necessários para confirmar esses achados / INTRODUCTION: Both gold standard treatments for obsessive-compulsive disorder (pharmacotherapy with serotonin reuptake inhibitors, and behavioral with exposure and response prevention [ERP]) are equally effective. Studies have demonstrated similar neurobiological changes elicited by these different treatments in OCD patients. These findings are suggestive that the clinical response to ERP is directly related to an increase of the 5-HT concentration in the brain. The platelet 5-HT concentration have been shown as a representative measure of central serotonergic system and used as a biological marker of the synaptic transmition. OBJECTIVE: To compare the platelet 5-HT concentration (basal and variation in 8 weeks) and the clinical response to ERP treatment. METHODS: 30 OCD patients were included and 29 started the treatment. 27 patients compleated at list 4 weeks and 24 completed all 8 weeks (16 sesions) ERP protocol. Patients had the basal and final (after 8 weeks) platelet 5-HT concentrations dosed and the clinical response measured by Y-BOCS, CGI and measures of secondary symptoms as well (depression, anxiety and disability). RESULTS: Data shows a positive correlation between the basal concentration of 5-HT and the 4 week ERP response (p<0,05). There were higher basal concentration and reduction in 8 weeks of platelet 5-HT concentration in the responders group compared with non-responders. Nevertheless, this differences was not significant (p>0,05). CONCLUSION: In the studied sample data suggest that high basal 5-HT platelet concentration is a biologic predictor of fast onset (4 weeks) of clinical response to ERP. Probably larger samples would show the basal 5-HT platelet concentration as a predictor of 8 weeks ERP outcome. Controlled trials are needed to confirm these findings

A artrite reumatoide (AR) é a artropatia inflamatória mais prevalente no mundo, de etiologia multifatorial e fenótipos heterogêneos. Busca-se, além de definir fatores etiológicos, compreender as interações entre mecanismos envolvidos na fisiopatologia da AR. Entre estes, fatores genéticos, tanto genes do antígeno leucocitário humano (HLA), especialmente a presença do epítopo compartilhado (Shared epitope - SE) do HLA-DRB1, como genes não-HLA, e fatores ambientais e epigenéticos têm sido associados à doença. Assim, a identificação de novos fatores relacionados à etiopatogenia da AR e suas possíveis associações com características clínicas motivaram esse estudo. Um estudo caso-controle foi desenhado e dividido em duas etapas. Para a primeira etapa, foi obtido plasma de 18 indivíduos de AR e 18 voluntários saudáveis de Ribeirão Preto, no qual foram identificados quinurenina (Kyn), Trp, serotonina (5-HT) e taxa Kyn/Trp (KTR) por cromatografia líquida de ultra-eficiência (CLUE) acoplada a espectrômetro de massas sequencial (CLUE-DAD-EM/EM). Na segunda etapa, de estudo genético, uma coorte formada por 328 indivíduos com AR e por 234 voluntários saudáveis de Ribeirão Preto e de Porto Alegre foi avaliada quanto ao polimorfismo do gene da enzima indoleamine 2,3-dioxigenase 1 (IDO1). Foram obtidos dados clínicos e epidemiológicos e coletadas amostras de sangue periférico para extração de DNA pelo método de salting-out. Em seguida, tipificação HLA e reação em cadeia de polimerase (RCP) das variantes da IDO1, rs7820268, rs3739319, rs61753677, rs35059413, rs35099072 e rs9298586, foram realizadas. A positividade para fator reumatoide (FR) em indivíduos com AR foi associada ao tabagismo (p= 0.0002) e ao SE (p < 0.0001), e para anticorpo antipeptídeo citrulinado cíclico (anti-CCP), associado ao SE (p < 0.0001). Quando combinadas a presença de SE e a de tabagismo, houve associação estatisticamente significante para FR (p < 0.001) e para anti-CCP (p = 0.03). Foram observadas menores concentrações plasmáticas de 5-HT em indivíduos com AR quando comparados a voluntários saudáveis (p =0.006), mas sem diferença para níveis de Trp, Kyn e KTR. Para estes, diferenças apareceram quando avaliados subgrupos. Em indivíduos com AR sem tratamento com drogas modificadoras do curso da doença (DMCDs), os valores plasmáticos de Trp foram menores quando comparados aos em terapia (p = 0.0016), enquanto em pacientes com AR tabagistas os valores de Kyn e KTR foram menores que em pacientes não tabagistas (p = 0.039 e p = 0.032, respectivamente). Não foram identificadas associações estatisticamente significantes entre as variantes genéticas estudadas e o risco de desenvolver AR, nem entre os polimorfismos da IDO1 estudados e a concentração plasmática de Trp, Kyn e 5-HT e KTR. Este estudo não identificou relação das variantes do gene da IDO1 com suscetibilidade para AR. Assim, novos estudos são necessários para que possam ser explicadas as associações encontradas na via das Kyns e na 5-HT em etiopatogenia da AR. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most prevalent inflammatory arthropathy in the world, with multifactorial etiology and heterogeneous phenotypes. Besides defining etiological factors, it is sought to understand the interactions between mechanisms in RA pathophysiology. About these, genetic factors, both human leucocity antigen (HLA) genes, especially the HLA-DRB1 Shared epitope (SE) presence, and not-HLA genes, and environmental and epigenetics factors have been associated with the disease. Therefore, the aim of this study was to identify new possible associations between RA clinical features and its etiopathogenesis. A case-control study was designed and it was divides in two phases. The first phase, it was obtained plasma of 18 RA patients and 18 healthy controls from Ribeirão Preto to identify the kynurenine (Kyn), Trp and serotonin (5-HT) concentrations and Kyn/Trp ratio (KTR) by ultra-high performance liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometer. The second phase was a genetic study that evaluated a cohort of 328 RA patients and 234 healthy volunteers from Ribeirão Preto and Porto Alegre about the indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) gene polymorphism. Clinical and epidemiological data were obtained and peripheral blood samples were collected to DNA extraction by salting-out method. Then, HLA typification and polymerase chain reaction to identify IDO1 genetic variants rs7820268, rs3739319, rs61753677, rs35059413, rs35099072 and rs9298586 were performed. Rheumatoid factor (RF) positivity was associated to smoking (p = 0.0002) and SE (p < 0.0001), and cyclic citrullinated peptide autoantibodies (anti-CCP) positivity was associated to SE (p < 0.0001). When SE presence and smoking were combined, there was statistically significant association to RF (p < 0.001) and anti-CCP (p = 0.03). We observed lower plasma 5-HT concentrations in RA patients than in healthy volunteers (p = 0.006), but no significant difference to Trp, Kyn and KTR levels. For these, differences were observed when subgroups were evaluated. In RA patients not using disease modifying antirheumatic drugs (DMARDs) the plasma Trp levels were lower than RApatients using DMARDs, while the plasma Kyn concentrations and KTR in smokers RA patients were lower than nonsmokers RA patients (p = 0.039 and p = 0.032 respectively). We did not indetify statistically significant associations neither between studied genetic variants and risk to develop RA nor between IDO1 polymorphisms and plasma Trp, Kyn, 5HT concentrations and KTR. This study did not identify relation between IDO1 genetic variants with susceptibility to RA. Therefore, new studies are necessary to explain the searched associations between Kyns pathway and 5-HT in RA etiopathogenenesis.

O núcleo dorsal da rafe (NDR) é a principal fonte de projeções serotonérgicas que inervam o sistema límbico. Estudos mostram que o NDR é uma estrutura complexa, formada por distintas sub-regiões topograficamente organizadas e que apresentam diferentes propriedades neuroquímicas e funcionais. Tem sido proposto que duas vias serotonérgicas oriundas do NDR, o trato prosencefálico e o trato periventricular, modulam diferentemente a expressão de comportamentos defensivos associados aos transtornos de ansiedade generalizada e de pânico. O presente trabalho investigou se as respostas defensivas de esquiva e de fuga evocadas no modelo do labirinto em T elevado (LTE), relacionadas à ansiedade generalizada e ao pânico, respectivamente, recrutam diferentes sub-regiões do NDR. Na primeira etapa do trabalho, usando a técnica de imunoistoquímica para detecção da proteína Fos e da enzima triptofano hidroxilase, avaliamos a expressão da proteína Fos por neurônios serotonérgicos e não-serotonérgicos em diferentes sub-regiões do NDR, bem como em estruturas mesencefálicas vizinhas ao NDR, ou seja, o núcleo mediano da rafe (NMR) e substância cinzenta periaquedutal (SCP) de ratos em decorrência da expressão dos comportamento de esquiva inibitória ou fuga no LTE. Nossos resultados mostraram que os comportamentos de fuga e de esquiva evocados no LTE recrutam distintas populações neuronais do NDR, do NMR, bem como da SCP. Enquanto neurônios serotonérgicos localizados no nível médio e caudal do NDR, mais precisamente, nas sub-regiões dorsal (DRD), caudal (DRC) e interfascicular (DRI), bem como do NMR, estão envolvidos com a aquisição do comportamento de esquiva inibitória, neurônios não serotonérgicos das asas laterais do NDR/SCP ventrolateral, bem como das colunas, dorsomedial e dorsolateral da SCP participam da expressão da fuga. Na segunda parte deste trabalho, avaliamos os efeitos da administração do agonista de receptores AMPA/cainato, ácido caínico, no DRD, DRC e asas laterais do NDR sobre os comportamentos defensivos avaliados no LTE. Os resultados mostraram que a injeção de ácido caínico, tanto no DRD, quanto no DRC, facilita a aquisição da esquiva inibitória e também prejudica a expressão do comportamento de fuga. Já, a estimulação das asas laterais do NDR com ácido caínico induz a expressão do comportamento de fuga, sem alterar o comportamento de esquiva. Efeito oposto sobre o comportamento de fuga foi observado com a administração nesta região de cloreto de cobalto, um inibidor da transmissão sináptica. Nossos resultados mostraram ainda que a administração de ácido caínico nas asas laterais aumenta a distância percorrida pelos animais em uma arena circular, resultado indicativo da evocação da resposta de fuga. Por fim, avaliamos a o envolvimento da neurotransmissão mediada por receptores GABAA e por receptores CRF1 nas asas laterais do NDR, na expressão do comportamento de fuga expressa no LTE. Os resultados mostram que o bloqueio dos receptores GABAA nas asas laterais facilitou a expressão da fuga. Por outro lado a administração de antalarmina, antagonista de receptores CRF1 não alterou a expressão da resposta de fuga, porém prejudicou a aquisição da esquiva inibitória. Em conjunto, os resultados da primeira etapa indicam o envolvimento de diferentes sub-populações neuronais do NDR na expressão dos comportamentos de esquiva e fuga avaliados no LTE. Nossos resultados também apontam o envolvimento de neurônios serotonérgicos do NMR na expressão da esquiva inibitória, bem como a participação da SCP na resposta de fuga. Os resultados da segunda etapa indicam que neurônios serotonérgicos localizados no DRD e DRC possam dar origem aos tratos prosencefálico e periventricular abordados pela teoria de Deakin & Graeff (1991). Embora as asas laterais do NDR estejam marcantemente envolvidas na expressão/regulação da resposta de fuga, populações neuronais específicas dessa região também estão envolvidas na modulação do comportamento de esquiva inibitória. / The dorsal raphe nucleus (DRN) is the main source of serotonergic projections that innervate the limbic system. A wealth of evidence indicates that the DRN is a complex structure composed by topographically organized sub-regions with distinct functional and neurochemical properties. It have been proposed that two serotonergic pathways originating in the DRN, the forebrain and periventricular tracts, distinctly modulate defensive behaviors associated with generalized anxiety disorder and panic disorder. The present study addressed the hypothesis that the two defensive responses evoked by the elevated T maze (ETM), i.e. escape and inhibitory avoidance which have been related to generalized anxiety and panic disorders, respectively, would recruit different subregions of the DRN. In the first part of this work, the number of doubly-immunostained cells for Fos protein and tryptophan hydroxylase, a marker of serotonergic neurons, was assessed within the rat DRN, median raphe nucleus (MRN) and PAG following inhibitory avoidance and escape performance in the ETM. Our results showed that these two defensive responses recruited distinct neuronal populations within the DRN, MRN and PAG. While serotonergic neurons located at the middle and caudal level of the DRN, specifically within the sub-regions dorsal (DRD), caudal (DRC) and interfascicular (DRI), and the MRN are implicated in the acquistion of inhibitory avoidance, nonserotonergic neurons in lateral wings (lwDR) of the DRN /ventrolateralPAG and the dorsal columns of PAG are implicated in the escape expression. In the second part of this study, we evaluated the effects caused by the administration of AMPA/kainate receptor agonist, kainic acid, into the DRD, DRC and lwDR of rats tested in the ETM. The results showed that injection of kainic acid into DRD and DRC facilitated inhibitory avoidance acquisition and impaired escape expression. On the other hand, stimulation of the lwDR by kainic acid facilitated escape expression, without interfering with inhibitory avoidance acquisition. Opposite effect on escape behavior was observed in this region followed injection of cobalt chloride, a synaptic transmission inhibitor. Our results also showed that administration of higher doses of kainic acid into the lwDR promptly evoked a vigorous escape reaction in animals tested in a circular arena. Finally, we evaluated the involvement of GABAA and CRF1 receptor-mediated neurotransmission in the lwDR in the regulation of the escape behavior measured by the ETM. Our results showed that the GABAA receptor antagonist bicuculine injected into the lwDR favored escape expression, without affecting inhibitory avoidance acquisition. On the other hand, local microinjection of the CRF1 receptor antagonist antalarmin impaired the acquisition of inhibitory avoidance, without changing escape expression. Together, our immunohistochemical results indicate the involvement of distinct DRN neuronal subpopulations in the regulation of escape and inhibitory avoidance responses. Our results also suggested that, while serotonergic neurons within the DRD, DRC, DRI and MRN are involved in inhibitory avoidance acquisition, non-serotonergic neurons of the vlPAG, dlPAG and dmPAG are involved in escape expression. The behavioral results with kainic acid indicated that the DRC and DRD may be the origin of the forebrain and periventricular tracts addressed by Deakin & Graeffs theory (1991). Although the lwDR are markedly implicated in escape regulation, specific neuronal populations within this region may also modulate inhibitory avoidance behavior.

A perimenopausa representa a transição da vida reprodutiva para não reprodutiva. É geralmente caracterizada por alterações neuroendócrinas, metabólicas e comportamentais, um possível resultado da depleção folicular ovariana e consequente redução do número de folículos ovarianos. É o período em que as mulheres podem apresentar maior susceptibilidade a manifestar transtornos afetivos e de ansiedade. A exposição de roedores ao resíduo químico 4-diepóxido de vinilciclohexeno (VCD) é um modelo bem estabelecido para estudos sobre perimenopausa, pois o VCD acelera o processo natural de atresia folicular. Embora as concentrações plasmáticas de estradiol estejam normais ou elevadas durante a perimenopausa, a terapia com estradiol pode ser benéfica para mulheres sintomáticas na perimenopausa. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar se a depleção folicular gradativa acelerada pelo VCD resulta em alterações na neuroquímica de ratas fêmeas em núcleos cerebrais que controlam o humor, além de avaliar se o estradiol seria capaz de reverter as possíveis alterações. Ratas da linhagem Wistar (28 dias pós-natal) receberam diariamente, durante 15 dias consecutivos, injeções subcutâneas de VCD (160 mg / kg) ou óleo de milho (O). Aproximadamente 55 dias após a primeira injeção, cápsulas de silastic contendo 17?-estradiol (E) ou O foram inseridas subcutaneamente (Grupos O+O; VCD+O; VCD+E). Cerca de 21 dias após o implante das cápsulas, as ratas dos grupos O+O e VCD+O foram decapitadas na manhã do diestro, enquanto que as do grupo VCD+E foram decapitadas exatamente 21 dias após o implante das cápsulas contendo estradiol, entre 0900 h e 1100 h. O sangue foi colhido para avaliação das concentrações plasmáticas de estradiol e progesterona por radioimunoensaio (RIE). Os cérebros foram removidos para microdissecção do hipocampo, amígdala, Locus coeruleus (LC) e Núcleo Dorsal da Rafe (NDR), para posterior análise dos níveis de RNAm para os receptores de progesterona (PR) e estradiol do tipo beta (ER?) por meio de RT/PCR. Este experimento foi replicado para remoção do hipocampo e amígdala para dosagem dos conteúdos de noradrenalina (NA) e serotonina (5-HT) por meio de cromatografia líquida de alta performance, seguida de detecção eletroquímica (HPLC/ED). Outro conjunto de ratas submetidas às mesmas condições10 experimentais foi perfundido para imunohistoquímica para TPH no NDR e TH no LC. Como esperado, na periestropausa (grupo VCD+O) as concentrações plasmáticas de estradiol não foram diferentes daquelas das ratas controles (O+O). As concentrações plasmáticas de progesterona na periestropausa foram menores que as do grupo controle, o que foi revertido pelo estradiol. No LC, a expressão de PR na periestropausa foi igual à das ratas controles, enquanto a expressão do ER? foi menor; a terapia com estradiol não modificou a expressão de nenhum destes receptores. A densidade de neurônios noradrenérgicos (TH+) no LC não foi alterada nem pela depleção folicular nem pela terapia estrogênica. Na periestropausa, o conteúdo de NA foi menor na amígdala, mas não no hipocampo, e o estradiol não alterou este conteúdo em nenhuma das áreas. No NDR, a expressão de PR e de ER? nas ratas na periestropausa foi menor que nas ratas controles; o estradiol preveniu o declínio da expressão de ER?, mas não de PR. O NDR foi analisado separadamente por toda a extensão rostro-caudal em 3 níveis anatômicos: rostral, médio e caudal, cada um dividido em 3 sub-regiões: lateral, dorsal e ventral. O número de neurônios serotonérgicos (TPH+) no NDR foi menor na periestropausa, e o estradiol foi capaz de reverter esse efeito, atuando principalmente na região caudal. A expressão gênica de PR não foi alterada nem pela depleção folicular nem pela terapia estrogênica tanto na amígdala como no hipocampo. A expressão de ER? também não foi diferente na periestropausa, quando comparada ao grupo controle, mas o estradiol aumentou esta expressão no hipocampo. Tanto na amígdala como no hipocampo houve redução no conteúdo de 5-HT na periestropausa e estradiol foi capaz de reestabelecer os níveis deste neurotransmissor aos valores controles apenas no hipocampo. Estes dados elucidam, pelo menos em parte os mecanismos do efeito positivo da terapia estrogênica nos sintomas de mulheres normoestrogênicas na perimenopausa. Estes efeitos parecem não envolver de forma importante o sistema noradrenérgico central, mas resultar do aumento da biossíntese de progesterona periférica em associação com a regulação positiva de ER? no NDR e hipocampo, que parece potencializar a via serotonérgica NDR/HPC. Portanto, o desenvolvimento de novas terapias que ativem os ER? pode ser uma alternativa para obter os efeitos positivos da ação do estradiol, eliminando os efeitos colaterais das terapias de estradiol que normalmente resultam da ativação do ER?. / Perimenopause represents the transition from reproductive to non-reproductive life. It is usually characterized by neuroendocrine, metabolic and behavioural changes, which result from a follicular depletion and reduced number of ovarian follicles. During this period, women are more likely to express mood disorders and anxiety. The exposure of animals to diepoxide 4-vinylcyclohexene (VCD) is a well-established experimental model for perimenopause studies, as VCD induces loss of ovarian small follicles (primary and primordial) in mice and rats by accelerating the natural process of atresia. Although estrogens levels are normal or even high during perimenopause, estrogen therapy can be beneficial for symptomatic perimenopausal women. The aim of this study was to investigate whether gradual follicular depletion induced by VCD results in changes in the neurochemistry of female rats in brain nuclei that control mood and the role of estradiol on these changes. Female rats (28 days) were daily injected with VCD or corn oil (O) for 15 days. Around 55 days after the first injection, pellets of 17?-estradiol (E) or O were inserted s.c (Groups O+O; VCD+O; VCD+E). Around 21 days after, rats O+O and VCD+O were decapitated between 0900 h and 1100 of diestrus while rats VCD+E were decapitated exactly 21 days after the onset of E therapy. Another set of rats followed the same experimental design and were perfused for TH and TPH immunohistochemistry in Locus coeruleus (LC) and Dorsal Raphe Nuclei (DRN), respectively. Blood was collected for estradiol and progesterone measurement by radioimmunoassay (RIA). The brains were removed from decapitated rats to punch out LC, DRN, hippocampus and amygdala to analyse the expression of mRNA for ER? and PR by RT/PCR. This experiment was replicated to punch out the hippocampus and amygdala for the determination of noradrenaline (NE) and serotonin (5-HT) contents by High Performance Liquid Chromatography, followed by Electrochemical Detection (HPLC/ED). As expected, plasma concentrations of estradiol were not different from those of control rats (O + O). Plasma concentrations of progesterone in the periestropause were lower than those in the control group, which was reversed by estradiol. In the LC, the PR expression in the periestropause was similar to that of the control rats, whereas the ER? expression was lower; estradiol therapy did not modify the expression of any of these receptors. The12 density of noradrenergic (TH +) neurons in LC was not altered by either follicular depletion or estrogen therapy. In periestropause, NA content was lower in the amygdala, but not in the hippocampus, and estradiol did not alter this content in any of the areas. In NDR, the expression of PR and ER? in periestropausal rats was lower than in controls; estradiol prevented the decrease of ER? expression, but not PR. The NDR was analyzed separately for the entire rostrocaudal axis in three anatomical levels: rostral, middle and caudal, each divided into three sub-regions: lateral, dorsal and ventral. The number of serotonergic neurons (TPH +) in NDR was lower in the periestropause, and estradiol was able to reverse this effect, acting mainly in the caudal region. PR gene expression was not altered by either follicular depletion or estrogen therapy in either the amygdala or the hippocampus. ER? expression was also no different in periestropause compared to the control group, but estradiol increased this expression in the hippocampus. Both in the amygdala and in the hippocampus there was a reduction in 5-HT content in the periestropause, and estradiol was able to reestablish the levels of this neurotransmitter at the control values only in the hippocampus. These data elucidate, at least in part, the mechanisms of the positive effect of estrogen therapy on the symptoms of normoestrogenic women in perimenopause. These effects do not appear to significantly involve the central noradrenergic system but result from increased peripheral progesterone biosynthesis in association with positive regulation of ER? in the NDR and hippocampus, which appears to potentiate the serotonergic NDR/HPC pathway. Therefore, the development of new therapies that activate ER? may be an alternative to obtain the positive effects of the estradiol action, eliminating the side effects of the estradiol therapies that normally result from the activation of ER?.

O diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica associada a danos, disfunção e insuficiência de diversos órgãos, sendo a fragilidade óssea apontada por estudos recentes como também associada ao DM. Os mecanismos que justificam o maior risco de fraturas em diabéticos tipo 2 não são bem compreendidos. A influência do trato gastrointestinal e seus hormônios no remodelamento ósseo tem sido comprovada em animais e em indivíduos sadios, sendo o Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) e a serotonina hormônios com produção intestinal estimulada pela ingestão de nutrientes, existindo algumas evidências de que os mesmos têm efeitos no metabolismo ósseo. O presente estudo comparou a dinâmica dos marcadores ósseos, da serotonina e do GLP-2 em resposta à refeição mista em mulheres pósmenopausadas diabéticas em relação a controles não diabéticas. Foram incluídas 43 mulheres pós-menopausadas com densidade mineral óssea (DMO) reduzida, 23 com diabetes (grupo DM) e 20 controles (grupo CO). Depois do jejum de 12 horas, essas mulheres foram submetidas ao teste de refeição padrão, e as amostras de sangue foram coletadas nos tempos 0, 30, 60, 120 e 180 minutos para a dosagem de telopeptídeo C-terminal do colágeno tipo I sérico (CTX), osteocalcina (OC), GLP-2 e serotonina. O grupo DM apresentou maior índice de massa corporal, bem como maior densidade mineral óssea (DMO) de colo de fêmur e quadril. Nos tempos basais as mulheres diabéticas apresentaram concentrações plasmáticas de LH e FSH, bem como dos marcadores ósseos osteocalcina e CTX menores que no grupo CO. Em resposta a refeição padrão houve, em ambos os grupos, diminuição na concentração do CTX e da osteocalcina, e aumento na de GLP-2, sem alteração significativa da serotonina. A resposta do CTX à refeição foi menor no grupo DM, e a da serotonina maior no grupo CO em um único tempo do teste. Em relação a OC e ao GLP-2, não houve diferença entre os grupos avaliados ao longo do teste de refeição. As mulheres diabéticas tipo 2 tiveram maior DMO de fêmur. Além disso, os resultados sugerem que o remodelamento ósseo das mulheres diabéticas está alterado, com os marcadores ósseos reduzidos. A influência da ingestão de nutrientes na reabsorção óssea também foi alterada pela DM, não se reconhecendo nesse estudo qualquer papel do GLP-2 ou da serotonina na alteração do metabolismo ósseo em mulheres diabéticas tipo 2 / Type 2 diabetes mellitus is metabolic disease associated with long-term damage, dysfunction, and failure of various organs; recent studies indicate that diabetes itself is associated with bone fragility. The mechanisms underlying the increased fracture risk in type 2 diabetes are not well understood. The influence of the gastrointestinal tract and its hormones in bone remodeling has been demonstrated in animals and in healthy subjects. Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) and serotonin are enteric hormones stimulated by nutrient intake, and there is some evidence that these hormones could have some effects on bone metabolism. We studied the dynamics of bone markers, serotonin and GLP- 2 in response to a mixed meal in diabetic postmenopausal women, in comparison with nondiabetic controls. 43 post-menopausal women with reduced bone mineral density (BMD) were enrolled, 23 with diabetes (DM group) and 20 normal control (CO group). After an overnight fast (12h), subjects were submitted to a standard meal test. Blood samples were drawn for C-terminal crosslinked telopeptide (CTX), osteocalcin (OC), GLP-2 and serotonin at 0, 30, 60, 120 and 180 minutes. The DM group had higher body mass index, and higher BMD of the femoral neck and hip. The basal values of of LH and FSH as well as the bone markers osteocalcin and CTX were lower in the DM group than in the CO group. After the standard meal test, there was a decrease in the concentration of CTX and osteocalcin, and an increase in GLP-2 in both groups. No changes in concentrations of serotonin were observed over the test meal. The response of the CTX meal was lower in the DM group, and the serotonin concentration was greater in the CO group in a single test time. In relation to e OC and GLP-2, there were no differences among the groups throughout the test meal. Type 2 diabetic women had higher bone mineral density (BMD) in the femur. Furthermore, the results suggest that the bone remodeling of diabetic women is altered, with their biochemical bone markers reduced. The influence of nutrient intake on bone resorption was also altered by DM, but in this study we could not recognize the role of GLP- 2 and serotonin in influencing the bone metabolism in type 2 diabetic

Evidências na literatura apontam o núcleo basolateral do complexo amigdalóide como uma estrutura importante na elaboração e controle das respostas defensivas. O sistema serotonérgico é um dos tantos sistemas de neurotransmissão que estão envolvidos nessas respostas. Dentre os diferentes subtipos de receptores serotonérgicos existentes, os do tipo 5-HT2C é um dos mais estudados com relação à mediação dos processos de ansiedade. A estimulação de receptores 5-HT2C tem efeito do tipo ansiogênico em diferentes modelos animais de ansiedade. Porém, não se conhece ainda a real participação desses receptores localizados no núcleo basolateral do complexo amigdalóide sobre as respostas de esquiva e fuga geradas no labirinto em T elevado relacionas, respectivamente, com ansiedade generalizada e pânico. Assim, o presente trabalho teve por objetivo verificar o papel dos receptores serotonérgicos do tipo 5-HT2C do núcleo basolateral do complexo amigdalóide na modulação das respostas defensivas associadas à ansiedade generalizada e ao pânico. Foram realizadas injeções bilaterais intra-núcleo basolateral do agonista endógeno serotonina, do agonista preferencial de receptores 5-HT2C MK-212 ou do antagonista seletivo desses receptores SB242084 em ratos submetidos ao teste do labirinto em T elevado e teste de transição claro-escuro. Os resultados mostram que a administração do agonista endógeno serotonina e do agonista de receptores do tipo 5-HT2C MK-212 promove uma facilitação na aquisição da esquiva inibitória em ratos testados no labirinto em T elevado. A administração dos agonistas também diminui o tempo gasto pelos animais no compartimento claro da caixa claro-escuro, também sugerindo um efeito do tipo ansiogênico. Por outro lado, a administração local do antagonista dos receptores 5-HT2C SB-242084 prejudica tal resposta. Esse mesmo tratamento não altera a resposta no teste de transição claro-escuro. A administração prévia de SB-242084 é capaz de bloquear o efeito ansiogênico promovido pela serotonina. Nem a ativação nem o bloqueio desses receptores exerceu efeito sobre a resposta de fuga. Em suma, nossos resultados sugerem que os receptores 5-HT2C do núcleo basolateral do complexo amigdalóide têm papel regulatório sobre a resposta de esquiva inibitória, mas não sobre a resposta de fuga gerada no labirinto em T elevado. / A wealth of evidence highlights the importance of serotonergic mechanisms within the basolateral nucleus of the amygdala for the regulation of defensive responses. However, conflicting evidence exists on the role of played by different 5-HT receptor subtypes such as 5-HT1A, 5-HT2A and 5-HT2C receptors in this process. For instance, previous studies show that whereas activation of the former two subtypes causes anxiolytic-like effect in the elevated T-maze, stimulation of 5-HT2C receptors has anxiogenic consequences in different animal models of anxiety. In this study we further explored the role played by 5-HT2C receptors of the basolateral nucleus of the amygdala in the regulation of defensive behaviors that have been associated with generalized anxiety and panic. The results showed that bilateral injection of the endogenous agonist serotonin or the 5-HT2C receptor agonist MK-212 facilitates inhibitory avoidance acquisition in rats tested in the elevated T-maze. Both drugs decreased the time spent by the animals in the light compartment of a light-dark box, also suggesting an anxiogenic-like effect. On the other hand, local administration of the 5-HT2C receptor antagonist SB-242084 impaired inhibitory avoidance acquisition in the elevated T-maze, but was without effect upon the behaviors measured in the light-dark transition test. Previous administration of SB-242084 blocked the anxiogenic effect of serotonin on inhibitory avoidance acquisition in the T-maze. Neither the blockade nor the activation of 5-HT2C receptors of the basolateral nucleus of the amygdala affected escape performance in the elevated T-maze. In summary, the results obtained in the present study are indicative that 5-HT2C receptors in the basolateral nucleus of the amygdala are selectively involved in the regulation of defensive behaviors that are associated with generalized anxiety but not panic disorder.