Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène d’importance pouvant causer une multitude d’infections allant d’infections cutanées à des infections systémiques mortelles. Ce pathogène infecte l’homme ainsi que les animaux comme les porcs, bovins, volailles, etc. Chez les animaux, cette bactérie cause, entre autres, la mammite bovine. Il existe des souches de S. aureus qui sont résistantes à la méthicilline (SARM). Le nombre d’infections reliées aux SARMs est en constante évolution, car en plus de leur forte présence dans les hôpitaux, ces bactéries sont aussi présentes dans la communauté et auprès des animaux d’élevage. En plus de la résistance à la classe antibiotique des ß-lactamines, dont la méthicilline fait partie, plusieurs souches de SARMs sont résistantes à d’autres classes d’antibiotiques (macrolides, fluoroquinolones, aminoglycosides). De plus, plusieurs souches de S. aureus produisent des biofilms, soit des structures qui protègent les bactéries contre plusieurs facteurs de leur environnement. La plupart des antibiotiques sont moins efficaces pour tuer les bactéries se retrouvant dans cette structure. L’inefficacité de la plupart des antibiotiques existants envers ce pathogène demande la recherche de nouvelles classes d’antibiotiques ayant de nouvelles cibles thérapeutiques ce qui permettrait de cibler ce pathogène et de l’éliminer. De récentes recherches ont permis de découvrir une nouvelle classe d’antibiotiques, soit des pyrimidines modifiées, qui sont des ligands spécifiques du riborégulateur guanine, compris dans la classe des riborégulateurs purines. Ces molécules antibiotiques ont une cible très spécifique : elles sont efficaces lorsque le riborégulateur guanine contrôle spécifiquement la transcription du gène guaA, qui code pour la GMP synthétase. La position activée du riborégulateur résulte en la pleine transcription du gène guaA et subséquemment en la synthèse du GMP. Lorsqu’il y a un excès de guanine intracellulaire, ce ligand se lie spécifiquement à l’aptamère en 5’ du riborégulateur provoquant ainsi la formation d’une tige de terminaison qui empêche la transcription de guaA. En fait, chez S. aureus, le riborégulateur guanine contrôle tout l’opéron xpt-pbuX-guaB-guaA. Il a été démontré que la molécule 2,5,6-triaminopyrimidine-4-un (PC1), une pyrimidine modifiée, favorise la conformation terminatrice du riborégulateur guanine et ainsi, l’arrêt artificiel de la transcription de guaA. Par contre, cette molécule n’est pas encore parfaite. Il y a dimérisation en un composé inactif en présence d’oxygène. La suite des efforts de recherche a consisté à produire et identifier de nouvelles molécules de type pyrimidine dérivées de PC1 ou autres analogues de guanine et qui agissent comme antibiotiques en liant le riborégulateur guanine retrouvé chez les staphylocoques. En particulier, nous avons démontré l’efficacité in vitro et in vivo de la molécule GRL-206 contre les infections causées par les SARMs et les souches bovines de S. aureus. En parallèle, l’efficacité de GRL-206 a aussi été testée contre Staphylococcus epidermidis, un staphylocoque à coagulase négative (SCN) produisant des biofilms.

Dissertation submitted in partial compliance with the requirements for the Masters Diploma in Technology: Homoeopathy, Technikon Natal, 1995. / The purpose of this study was to investigate the action of the homoeopathic remedy, Staphylococcinum and the antibiotic Penicillin G, on Staphylococcus aureus, with respect to its growth parameters and enzyme producing ability, in order to determine the effectiveness of homoeopathic remedies on living organisms and to attempt a better understanding of how these remedies work. The hypothesis put forward was that the homoeopathic remedy would have an effect on the growth parameters and enzyme producing ability of the organism, but that the effect would be more subtle than that of Penicillin G. / M

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:02:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8559_1.pdf: 3687024 bytes, checksum: 53fb31d406d0f0aeeb423e204503ef60 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / A mastite bovina, inflamação da glândula mamária, é uma das principais doenças que acomete o rebanho leiteiro em todo o mundo. O principal agente infeccioso responsável por esta enfermidade é o Staphylococcus aureus (S. aureus), bactéria de interesse na microbiologia dos alimentos como agente causador de intoxicações alimentares. Outro importante fato que envolve este microrganismo é a resistência aos antibióticos usados na terapêutica humana e veterinária. Como o leite e derivados são amplamente consumidos e podem conter S. aureus enterotoxigênicos e resistentes, objetivou-se com este estudo caracterizar feno e genotipicamente Staphylococcus spp. isolados de amostras de leite de vacas com mastite e queijos de coalho no Estado de Pernambuco. Para o diagnóstico da mastite bovina foram realizados os testes da caneca telada e o California Mastitis Test. As amostras de queijos de coalho foram submetidas ao isolamento e contagem de Staphylococcus coagulase positiva (SCP) em Ágar Baird-Parker. As cepas de Staphylococcus spp. obtidas tanto do leite quanto dos queijos foram caracterizadas fenotipicamente em S. aureus, SCP e Staphylococcus coagulase negativa (SCN), através da técnica de coloração de gram, características morfo-tintoriais das colônias e produção de hemólise em Ágar sangue, além de provas bioquímicas como fermentação da glicose em anaerobiose, fermentação do manitol em aerobiose e anaerobiose, produção de termonuclease, acetoína e coagulase. A caracterização genotípica foi realizada através da utilização da técnica de PCR-RFLP do gene coa, PCR-Uniplex e Multiplex para investigação dos genes toxigênicos, além de clivagem e seqüenciamento para confirmação da presença dos genes se. Para traçar o perfil de resistência dos isolados, foi empregada a técnica de difusão em ágar, utilizando diferentes antibióticos. Foram analisados 246 animais, totalizando 984 quartos mamários, dos quais, 562 (57,1%) apresentaram mastite subclínica, sendo os microrganismos mais prevalentes Staphylococcus spp. (36%), Corynebacterium spp. (34,8%) e S. aureus (13,6%). O perfil de sensibilidade antimicrobiana demonstrou que das 59 cepas de SCP isoladas de leite, 28,5% foram resistentes, sendo os antibióticos menos eficazes a penicilina e a amoxicilina. A caracterização das cepas de S. aureus de casos de mastite bovina pela técnica de PCR-RFLP revelou a presença de dois perfis genotípicos, P1=750pb e P2=1000pb. Das 81 cepas de Staphylococcus spp. isoladas de leite de vacas com mastite, 65 (80,2%) comportavam genes toxigênicos, sendo os genes se encontrados (seg, seh, sei e sej). Com relação aos queijos de coalho, das 10 amostras avaliadas, 90% estavam fora dos padrões permitidos pela legislação para SCP. 18/20 das cepas de Staphylococcus spp. apresentaram os genes tst, sec, sed, seg, seh, sei e sej. O percentual de resistência entre as cepas isoladas de queijo foi baixo. A análise de restrição e o seqüenciamento confirmaram a presença dos genes se nos isolados de leite e queijo. A tipagem molecular permitiu compreender o padrão de dispersão dos S. aureus nas propriedades estudadas. A presença de cepas de Staphylococcus spp. resistentes a antibióticos e portadoras de genes toxigênicos isoladas de amostras de leite de vacas com mastite e queijos de coalho no Estado de Pernambuco, é preocupante para a saúde do consumidor, por tornarem estes alimentos possíveis veículos de intoxicações alimentares

Members of the Staphylococcus genus are a major health issue in the clinical environment and can cause a wide range of disease in humans. However, this genus is also found as a part of the normal flora in humans, usually on the skin, nasal cavities, or on the linings of the throat. Normal flora members of the Staphylococcus genus become an opportunistic infection when there is breach in the physical barriers or the immune status of the human host. Another challenge with the Staphylococcus genus is the increase in drug resistant strains, such as Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), making simple infections difficult to treat and leading to severe toxic shock or even death. Recently, there have been numerous studies demonstrating normal flora bacterial interactions inhibiting bacteria that are potentially harmful to humans. Our research lab has previously demonstrated that the benign bacterium Alcaligenes faecalis has inhibitory effects against Staphylococcus aureus. In the present study, we wanted to explore: 1) if the inhibitory effect of A. faecalis would translate to other Staphylococcus species (S. capitis, S. saprophyticus, and S. epidermidis); 2) if this inhibitory effect was found in other Alcaligenes species (A. viscolactis). To determine this possible interactions, two parallel experimental projects were undertaken. A. faecalis and A. viscolactis were tested for their interactions with Staphylococcus species on both agar and liquid medium. For agar medium analysis, Staphylococcus lawns were grown on agar plates and either Alcaligenes cells, heat killed Alcaligenes, or Alcaligenes cell free supernatant were spotted onto the lawns and observed and scored for zones of inhibition (ZOI). It was demonstrated live cells of both A. faecalis and A. viscolactis were needed to produce ZOI on Staphylococcus lawns and that all Staphylococcus species were inhibited. For liquid medium analysis, Staphylococcus species were either inoculated alone (control) or in a co-culture with Alcaligenes, serially diluted, and colony forming units (CFU) were enumerated. Both A. faecalis and A. viscolactis inhibited all Staphylococcus species in liquid culture. Based on the results from these experiments, it is our conclusion that: 1) Alcaligenes faecalis and Alcaligenes viscolactis both possess the ability to inhibit Staphylococcus growth; 2) all Staphylococcus species are inhibited by Alcaligenes, but at varying levels. The exact mechanism of how Alcaligenes can inhibit Staphylococcus species is unknown, which will require further studies to analyze and understand the exact mechanism in order to create effective therapeutic targets to combat these increasingly resistant strains of Staphylococcus.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Farmacología / En abril del año 2015, la organización mundial de la salud (OMS), presentó un informe que reveló la situación actual en torno a la resistencia a antimicrobianos de 114 países, lo que dejó en evidencia un preocupante escenario: el fenómeno de la resistencia se encuentra diseminado en todo el orbe y está presente en una gran variedad de patógenos responsables de infecciones comunes, tales como: las del tracto urinario, la gonorrea, la diarrea, la neumonía y la sepsis. Dentro de estos agentes se encuentran diversos bacilos Gram negativos, Staphylococcus aureus resistente a meticilina y Enterococcus spp. resistente a vancomicina, siendo estos últimos responsables de enfermedades con altos índices de mortalidad, como son la sepsis y la endocarditis. A este escenario se suma el escaso avance e inversión por parte de las grandes industrias farmacéutica en el desarrollo de nuevos antimicrobianos. Frente a esto, el año 2010, la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas (IDSA) en conjunto a otras entidades, lanzaron el programa “The 10x‘20 Initiative: Pursuing a Global Commitment to Develop 10 New Antibacterial Drugs by 2020”, una iniciativa que busca hacer un llamado a los diferentes actores de la salud pública mundial, a incentivar el desarrollo de nuevas entidades moleculares (NEMs) con actividad antimicrobiana para el año 2020. El Laboratorio de Desarrollo de Fármacos de la Universidad de Chile ha trabajado en la desarrollo de compuestos arilmercaptoquinonicos diseñados racionalmente a partir de la estructura de la ubiquinona, buscando intervenir la cadena de transportadora de electrones bacteriana (CTeB). Resultados previos han demostrado que los compuestos obtenidos poseen una interesante actividad sobre bacterias Gram positivas tales como S. aureus resistente a meticilina, S. aureus sensible a meticilina y E. faecalis. De la serie de compuestos sintetizados destacaron; DFUCh-O5 y DFUCh-P4. En la presente investigación se buscó determinar el potencial de aplicación terapéutica de los derivados sintetizados y con ello discernir cuál es el mejor candidato para poder avanzar a fases preclínicas que consideren la utilización de modelos animales. En primer término, se estudió la toxicidad de los compuestos sobre células humanas y murinas a través del método 15 de MTT. Además, se determinaron los valores Concentración Inhibitoria Mínima90 (CIM90) y Concentración Bactericida Minima90 (CBM90) para los derivados en estudio de acuerdo a las normas de CLSI, sobre población de aislamientos clínicos de S. aureus y E. faecium multirresistentes, obtenidos desde distintos sitios estériles (sangre, huesos, etc.) y diferentes centros hospitalarias de todo Chile durante el año 2014, provistos por el Instituto de Salud Pública de Chile. Se caracterizó la actividad antibacteriana de los derivados, a través de la cuantificación del efecto post-antibiótico, el estudios de las curvas de muerte de los derivados, el potencial de inducción de mutaciones de los derivados sobre cultivos expuesto en forma aguda y crónica a estos. Por otra parte, se evaluó la actividad de los compuestos en asociación con linezolid, vancomicina y daptomicina, por determinación del índice de CFI (Concentración Fraccionaria Inhibitoria). Adicionalmente, se determinó el porcentaje de unión a albumina de los derivados y se estudió cómo influye esta proteína en la actividad de los compuestos in vitro. Por último, se estudió la efectividad in vivo utilizando un modelo de infección en larvas de Galleria mellonella. Se evidenció que DFUCh-O5 y DFUCh-P4 no afectan la viabilidad de células mamíferas; HeLa, SH-SY5Y y H4-II-E-C3, a las concentraciones en que son activos como antibacterianos. Los compuestos poseen CIM90 similar a la exhibida por vancomicina sobre los aislamientos clínicos de S. aureus resistentes a meticilina. Frente a los aislamientos de E. faecium resistentes a vancomicina estudiados, DFUCh-P4 resultó 64 veces más activo que vancomicina y DFUCh-O5 128 veces más activo que esté fármaco. Los derivados son bactericidas en todos los aislamientos estudiados. En los estudios de cinética de muerte, los compuesto tardaron menos de 2 horas en reducir el 99,9% de la población bacteriana ensayada. Los derivados no tienen efecto post antibiótico significativo sobre las especies S. aureus y Enterococcus sp. prototipo. Ambos derivados tienen potencial de inducir mutaciones frente a una exposición aguda y cronica en S. aureus resistente a meticilina, pero estas mutaciones no se mantienen en la generaciones sucesivas de la población bacteriana. DFUCh-P4 y DFUCh-O5 poseen la misma 16 efectividad que vancomicina sobre los modelos de infección en G. mellonela provocado por S. aureus sensible a meticilina o E. faecalis. En este trabajo se demostró, que los derivados poseen potencial terapéuticos como compuestos antibacterianos de uso humano, ya que poseen una alta actividad sobre bacterias Gram positivas multirresistentes y no afectan la viabilidad de células mamíferas / In April 2015, the World Health Organization (WHO) presented a report that revealed the current situation regarding antimicrobial resistance in 114 countries, which revealed a dangerous scenario: the phenomenon of resistance It is disseminated throughout the world and is present in a wide variety of pathogens responsible for common infections, such as those of the urinary tract, gonorrhea, diarrhea, pneumonia and sepsis. Among these agents are Gram-negative bacilli, methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Enterococcus sp. Resistant to vancomycin (ERV), are the last responsible for diseases with high mortality rates, such as child sepsis and endocarditis. Added to this scenario is the scarce advancement and investment by large pharmaceutical companies in the development of new antimicrobials. In response to this, in 2010, the American Society for Infectious Diseases (IDSA), together with other entities, launched the program "The 10x'20 Initiative: Looking for a global commitment to develop 10 new antibacterial drugs by 2020", an initiative that. The Drug Development Laboratory of the University of Chile has worked on the development of new resources for the development of new molecular entities (NEMs) with antimicrobial activity for the year 2020. Arilmercaptoquinonics compounds rationally designed from the structure of ubiquinone, looking to block the bacterial electron transport chain (CTeB). Previous results have shown that the compounds obtained have an interesting activity on Gram-positive bacteria such as S. aureus susceptible to methicillin, MRSA and Enterococcus faecalis. From the series of synthesized compounds, it highlighted; DFUCh-O5 and DFUCh-P4. In the present investigation, we sought to determine the potential of therapeutic application of the synthesized derivatives and thereby discern which is the best candidate to be able to advance to preclinical phases that consider the use of animal models. First, the toxicity of the compounds was studied on human and murine cells through the MTT method. The values MIC90 and MBC90 were determined for the derivatives under study according to CLSI standards, on population of clinical isolates of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium multiresistant, isolated from different sterile sites (blood, bones, etc.) and different 18 hospital centers of Chile during 2014, provided by the Institute of Public Health of Chile. The antibacterial activity of the derivatives was characterized, through the quantification of the post-antibiotic effect, the studies of the time-kill curves of the derivatives, the potential for the induction of mutations of the derivatives on cultures exposed in acute and chronic form to these. On the other hand, the activity of the compounds in association with linezolid, vancomycin and daptomycin was evaluated by determining the CFI index (Fractional Inhibitory Concentration) In addition, the albumin binding percentage of the derivatives was determined and this protein was studied. in the activity of the compounds in vitro Finally, effectiveness was studied in vivo using a model of infection in larvae of Galleria mellonella. Evidence of DFUCh-O5 and DFUCh-P4 does not affect the viability of mammalian cells; HeLa, SH-SY5Y and H4-II-E-C3, at concentrations that are active as antibacterial drugs. The compounds possess a vancomycin-like activity on the clinical isolates of S. aureus resistant to methicillin. Faced with the isolates of vancomycin-resistant E. faecium studied, DFUCh-P4 was 64 times more active than vancomycin and DFUCh-O5 was 128 times more active than the drug. The activity exhibited is bactericidal in all isolates studied. In studies of death kinetics, isolation took less than hours to reduce 99.9% of the bacterial population tested. The compounds have no significant post-antibiotic effect on S. aureus and Enterococcus spp. prototype. Both derivatives have the potential to induce mutations in the face of acute and chronic MRSA exposure, but these mutations are not maintained in successive generations of the bacterial population. DFUCh-P4 and DFUCh-O5 have the same effectiveness than vancomycin on G. mellonela model infection by S. aureus or E. faecalis. In this study it was demonstrated that the derivatives have therapeutic potential as antibacterial compounds for human use, since they have a high activity on multiresistant Gram positive bacteria and do not affect the viability of mammalian cells

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En la actualidad, y en los últimos diez años, la nanotecnología ha entrado en auge, dada su capacidad para resolver problemáticas de distinta índole. En particular, la nanomedicina permite generar distintas plataformas de entrega de fármacos, los cuales pueden ser protegidos y guiados a distintos tejidos y órganos. El objetivo del presente trabajo es desarrollar nanopartículas de óxido de zinc (ZnO) dopadas con magnesio, que permitan la conjugación a drogas y puedan disolverse a pH tumoral (pH 4.0 – 5.5). Las nanopartículas de ZnO poseen la particularidad de disolverse en condiciones ácidas. De esta forma, al ingresar a la célula por medio de endocitosis, las nanopartículas pueden componer un sistema de entrega de fármaco antitumoral controlado, con disolución de las mismas, liberando Zn+2 al medio intracelular de la célula en conjunto con la droga transportada, y con un potencial efecto sinérgico. Para explorar este sistema de entrega de fármacos, la primera parte del trabajo correspondió a la síntesis de las nanopartículas. Para lo cual se empleó el método de precipitación, el que consiste en la reacción de sales de zinc y magnesio con hidróxido de potasio. En la segunda parte del trabajo se evaluó el perfil toxicológico de las nanopartículas de ZnO en embriones de Danio rerio para corroborar su potencial toxicidad. Luego, las nanopartículas fueron funcionalizadas con dos polímeros, polialilamina y poliestirensulfonato, y un aminosilano APTES, con el objeto de obtener nanopartículas que puedan conjugarse con distintas drogas. Finalmente, se utilizó curcumina, como droga modelo, conjugada con la nanopartícula desnuda y funcionalizada, con el objeto de evaluar la capacidad de asociación de la droga a la nanopartícula. Se lograron desarrollar nanopartículas de ZnO dopadas con magnesio, las cuales tienen gran capacidad de adhesión a drogas que tengan estructura de tipo carbonilo-hidroxilo (por ejemplo, curcumina, doxorubicina y daunorubicina), posiblemente por medio de la formación de compuestos coordinados. En embriones de Danio rerio, son tóxicas, sin embargo, el recubrimiento del conjunto nanopartícula-droga, podría disminuir la toxicidad de estas. Así, próximos estudios biológicos podrán explorar estos aspectos en mayor detalle y la mejora del nanosistema / Currently, and in the last ten years, nanotechnology has boomed, given its ability to solve problems of various kinds. In particular, nanomedicine allows generating different drug delivery platforms, which can be protected and guided to different tissues and organs. The objective of this work was to develop zinc oxide nanoparticles (ZnO) doped with magnesium, which allows conjugation to drugs and can dissolve at tumoral pH (pH 4.0 - 5.5). The ZnO nanoparticles have the particularity of dissolving in acidic conditions. In this way, upon entering the cell by means of endocytosis, the nanoparticles can compose a controlled antitumor drug delivery system, with their dissolution, releasing Zn+2 in the intracellular medium of the cell in conjunction with the transported drug, and with a potential synergistic effect. To explore this drug delivery system, the first part of the work corresponded to the synthesis of nanoparticles. For this, the precipitation method was used, which consists of the reaction of zinc and magnesium salts with potassium hydroxide. In the second part of the work, the toxicological profile of the ZnO nanoparticles in Danio rerio embryos was evaluated to corroborate its potential toxicity. Then, nanoparticles were functionalized with two polymers, polyalylamine and polystyrene sulfonate, and an aminosilane APTES, in order to obtain nanoparticles that could be conjugated with different drugs. Finally, curcumin was used, as a model drug, conjugated with the nude and functionalized nanoparticle, in order to evaluate the association of the drug to the nanoparticle. ZnO nanoparticles doped with magnesium were developed and have great capacity of adhesion to drugs that have carbonyl-hydroxyl groups in their structure (for example, curcumin, doxorubicin and daunorubicin), possibly through the formation of coordinated compounds. In Danio rerio embryos, they are toxic, however, the coating of the nanoparticle-drug set, could diminish the toxicity of these. Thus, next biological studies will be able to explore these aspects in greater detail and the improvement of the nanosystem

Memoria-para-optar-al-Título-Profesional-de-Médico-Veterinario / La resistencia antimicrobiana corresponde a uno de los principales desafíos que presenta actualmente la salud pública. La incidencia de bacterias multirresistentes se ha incrementado rápidamente a nivel mundial en la última década, particularmente la resistencia a meticilina en cepas de Staphylococcus coagulasa positivas (SCP) tanto de origen humano como animal. Si bien en Chile existe una vigilancia activa de Staphylococcus spp. resistente a meticilina en humanos, en medicina veterinaria no ocurre lo mismo, aun reconociendo que este patógeno en particular es zoonótico, donde las mascotas podrían jugar un rol importante como reservorios. El objetivo de este estudio fue cuantificar la resistencia a meticilina en cepas SCP aisladas desde perros sanos y con patología dermatológica. Para esto, se utilizaron 106 cepas obtenidas en un estudio previo, a las cuales se les determinó su resistencia a meticilina por Kirby-Bauer (K-B) y mediante concentración mínima inhibitoria (CIM). Se realizó un análisis de concordancia entre ambos métodos. La prueba de K-B detectó un 7,5% de cepas resistentes a meticilina (8 cepas), mientras que CIM reveló un 30,2% de cepas meticilino resistentes (32 cepas), tanto en perros sanos (18,8% de ellos) como en dermópatas (50% de ellos). De las 32 cepas resistentes, un 71,9% presentaron valores de CIM denominados border line (0,5 – 4 μg/mL) y un 28,1% revelaron elevados niveles de resistencia (≥ 8 μg/mL) asociados a la presencia del gen mecA. La mayoría de las cepas correspondieron a S. pseudointermedius resistente a meticilina y ninguna de las cinco cepas de S. aureus fue resistente. La concordancia entre ambos métodos fue de “moderada” a “aceptable”, en las cepas provenientes de ambos grupos de perros. El presente estudio da cuenta de una elevada frecuencia de resistencia a meticilina revelando la importancia de cuantificar, mediante el método de CIM, la resistencia en cepas de Staphylococcus spp. aisladas desde perros. Por lo anterior, se sugiere incorporar a esta especie animal en los sistemas de vigilancia de salud pública, abordando el problema desde la perspectiva de Una Salud. / Antimicrobial resistance represents one of the main challenges for public health today. The emergence of multiresistant bacteria has increased rapidly worldwide in the last decade, particularly the resistance to methicillin in coagulase positive Staphylococcus (CoPS) isolated from both human and animal origin. Although in Chile there is an active monitoring of Staphylococcus spp. resistant to methicillin in humans, this is not the case in animals, notoriously in pets, which are considered reservoirs of this zoonotic pathogen. The objective of this study was to quantify the resistance to methicillin in SCP strains isolated from healthy dogs and from dogs with dermatological pathology. For this purpose, 106 strains obtained in a previous study were used, to which their resistance to methicillin was determined through Kirby-Bauer (K-B) and the minimum inhibitory concentration (MIC). A concordance analysis between both methods was carried out. While the K-B test detected 7.5% of methicillin-resistant strains (8 strains), the MIC revealed 30.2% of methicillin-resistant strains (32 strains), both in healthy (18.8%) and in dermopath (50%) dogs. Of the 32 resistant strains, 71.9% presented MIC values considered as “borderline” (0.5 – 4 μg/mL), and 28.1% revealed high levels of resistance (≥ 8 μg/mL) associated with the presence of the mecA gene. The majority of the strains corresponded to methicillin resistant S. pseudintermedius, and none of the five strains of S. aureus was resistant. The agreement between both methods was between "moderate" to "acceptable" in the strains from both groups of dogs. This study shows a high frequency in the resistance to methicillin, revealing the importance of quantifying, through the MIC method, the resistance in strains of Staphylococcus spp. isolated from dogs. Therefore, it is suggested to incorporate this animal species into the public health surveillance systems, addressing the problem from a One Health perspective.

INTRODUCCIÓN: Las infecciones por el género Staphylococcus son un problema de salud a nivel mundial. Debido a su gran capacidad de desarrollar mecanismo de resistencia a los antibióticos de uso común en la práctica clínica. La clindamicina se ha señala en algunos estudios como alternativa de tratamiento contra estas bacterias, sin embargo, los estafilococos, también han desarrollado un mecanismo de resistencia particular contra este antibiótico. Este mecanismo de resistencia conocido como resistencia inducida a clindamicina (RIC), puede ser detectado e identificado con el D-Test. Se ha reportado una gran variabilidad en la frecuencia de RIC en diversas partes del mundo. OBJETIVO: Determinar la frecuencia de resistencia inducida a clindamicina en Staphylococcus aureus y estafilococos coagulasa negativo en el Instituto Nacional de Salud del Niño. MATERIALES Y MÉTODO: Se planteó un estudio observacional, descriptivo, prospectivo y de corte transversal. Se realizó la recuperación de los aislamientos (Staphylococcus) del Laboratorio de Microbiología “Dr. William Flores Sáenz” del INSN. Las bacterias recuperadas fueron evaluadas mediante la prueba de D-Test para identificación de la resistencia inducida a la clindamicina. RESULTADOS: 203 cepas de Staphylococcus fueron estudiadas, 18,7% (38/203) eran S. aureus y 81,3% (165/203) eran estafilococos coagulasa negativo (SCN). La frecuencia de la resistencia inducida a clindamicina fue de 7,9% (16/203). Pero solo en las cepas de S. aureus la frecuencia fue 13,2% (5/38), siendo esta el doble de lo encontrado en los SCN, 6,7% (11/165). El fenotipo de resistencia a clindamicina más frecuente fue el fenotipo R con 44,8%, seguido del fenotipo N con 24,1%, el fenotipo S con 22,7%, fenotipo D+ con 4,4%, fenotipo D con 3,5% y por último el fenotipo HD con 0,5%. Se encontró una p valor significativo, p < 0.047, al comprar la RIC en S. aureus y la procedencia del paciente. CONCLUSIONES: La frecuencia de RIC es mayor en la especie de S. aureus, en comparación con los estudios anteriormente reportada en nuestro país. El fenotipo R el más frecuente, lo que demuestra que existe una alta frecuencia de resistencia constitutiva a clindamicina en cepas de Staphylococcus del INSN. La frecuencia de RIC en el total de muestras estudiadas fue baja. Además, se concluye que la RIC tiene una asociación estadística significativa en relación con la procedencia del paciente, siendo más frecuente en los pacientes de consulta externa. PALABRAS CLAVES: Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativo, D-test, pacientes pediátrico, resistencia a meticilina, iMLSB, resistencia inducida a clindamicina. / Tesis

Staphylococcus aureus is a human bacterial pathogen responsible for a variety of diseases including bacterial pneumonia and sepsis. Recent studies provided an explanation, how S. aureus and its exotoxins contribute to the degradation of endothelial junction proteins and damage lung tissue [4]. Previous findings were indicating an involvement of acid sphingomyelinase (ASM) activity in cell barrier degradation [5]. In the presented study the impact of singular virulence factors, such as staphylococcal α-toxin, on in vitro cell barrier integrity as well as their ability to elicit an activation of ASM were investigated. Experiments with bacterial supernatants performed on human endothelial cells demonstrated a rapid dissociation after treatment, whereas murine endothelial cells were rather resistant against cell barrier degradation. Furthermore, amongst all tested staphylococcal toxins it was found that only α-toxin had a significant impact on endothelial junction proteins and ASM activity. Ablation of this single toxin was sufficient to protect endothelial cells from cell barrier degradation and activation of ASM was absent. In this process it was verified, that α-toxin induces a recruitment of intracellular ASM, which is accompanied by rapid and oscillating changes in cytoplasmic Ca2+ concentration and an increased exposure of Lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP1) on the cell surface. Recruitment of lysosomal ASM is associated, among other aspects, to plasma membrane repair and was previously described to be involved with distinct pathogens as well as other pore forming toxins (PFT). However, with these findings a novel feature for α-toxin has been revealed, indicating that the staphylococcal PFT is able to elicit a similar process to previously described plasma membrane repair mechanisms. Increased exposure and intake of surface membrane markers questioned the involvement of ASM activity in S. aureus internalization by non-professional phagocytes such as endothelial cells. By modifying ASM expression pattern as well as application of inhibitors it was possible to reduce the intracellular bacterial count. Thus, a direct connection between ASM activity and S. aureus infection mechanisms was observed, therefore this study exemplifies how S. aureus is able to exploit the host cell sphingolipid metabolism as well as benefit of it for invasion into non-professional phagocytic cells / Staphylococcus aureus ist ein bakterieller Erreger, der für eine Vielzahl von Erkrankungen des Menschen verantwortlich ist, darunter bakterielle Lungenentzündung und Sepsis. Neuere Studien konnten einen Ansatz dafür liefern, wie S. aureus und seine Exotoxine zur Degradation von endothelialen Verbindungsproteinen beitragen und das Lungengewebe schädigen. Weitere Befunde weisen auf eine Beteiligung der sauren Sphingomyelinase (ASM) bei der Degradation der Zellbarriere hin. In der vorliegenden Studie soll der Einfluss einzelner Virulenzfaktoren, wie z. B. Staphylokokkus α-Toxin, auf die Integrität der Zellbarriere in vitro sowie deren Fähigkeit, eine Aktivierung der ASM hervorzurufen, untersucht werden.Experimente mit bakteriellen Überständen die an humanen Endothelzellen durchgeführt wurden, zeigten eine rasche Dissoziation nach Behandlung, während murine Endothelzellen vorwiegend resistent gegen eine Degradation der Zellbarriere waren. Darüber hinaus wurde unter allen getesteten Staphylokokken-Toxinen festgestellt, dass nur α-Toxin einen signifikanten Einfluss auf endotheliale Verbindungssproteine und ASM-Aktivität hat. Die genetische Ablation des Toxins alleine reichte aus, um Endothelzellen vor einer Degradation der Zellbarriere zu schützen, und die Aktivierung von ASM blieb aus. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass α-Toxin eine Rekrutierung von intrazellulärem ASM induziert, die mit schnellen oszillierenden Veränderungen der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration und einer erhöhten Exposition von Lysosome associated membrane protein 1 (LAMP1) an der Zelloberfläche einhergeht. Die Rekrutierung lysosomaler ASM ist u.a. mit der Reparatur von Plasmamembran assoziiert und wurde bereits im Zusammenhang mit verschiedenen Pathogenen sowie anderer porenbildende Toxine (PFT) beschrieben. Mit diesen Befunden konnte jedoch eine neue Eigenschaft für α-Toxin beschrieben werden, die darauf hindeutet, dass das Staphylokokken-PFT einen ähnlichen Prozess auslösen kann wie zuvor beschriebene Plasmamembran-Reparaturmechanismen. Die vermehrte Exposition und Aufnahme von Oberflächenmembranmerkmalen stellte die Beteiligung der ASM-Aktivität an der Internalisierung von S. aureus durch nicht-professionelle Phagozyten wie Endothelzellen in Frage. Durch Modifikation des ASM-Expressionsmusters sowie Applikation von Inhibitoren war es möglich, die intrazelluläre Keimzahl zu reduzieren. Somit konnte ein direkter Zusammenhang zwischen ASM-Aktivität und den Infektionsmechanismen von S. aureus beobachtet werden. Diese Studie verdeutlicht somit, wie S. aureus den Sphingolipid-Stoffwechsel der Wirtszelle ausnutzen und für die Invasion in nicht-professionelle phagozytische Zellen nutzen kann

Enterotoxin production by Staphylococcus species other than Staphylococcus aureus has been reported. Staphylococcus strains (104 in toto) representing twelve species and subspecies were examined for enterotoxins using a commercial staphylococcal enterotoxin ELISA immunoassay (TECRA, International Bioproducts). Staphylococcus intermedius (24 strains) and S. aureus (7 strains) were positive with this test. Western blots of S. aureus exoproteins demonstrated proteins of ∼30 kD, consistent with known staphylococcal enterotoxins. The major antigen in all S. intermedius strains, a 75 kD protein, was not analogous to previously described staphylococcal enterotoxins. This protein was unique to S. intermedius. Gel filtration data indicate that the protein is a subunit of a larger protein in vivo. The 75 kD protein cross-reacts with several enterotoxin antibodies. It is unclear whether the protein is a toxin, but its homology with S. aureus enterotoxins may indicate a shared toxic region, or this protein may create false positive results in screening for enterotoxin.