The central properties of stem cells are the pluripotency and the capacity of self-renewal. Hematopoietic stem cells (HSCs) posses such common features that allows them to generate all the cells of the hematopoietic compartments, maintaining in the same time the HSC pool. We develop approaches focused on ex vivo HSC expansion through activation by exogenous HOXB4 (human HSCs) or Notch/Dll-4 ligand (murine HSCs). Two independent transcriptomic analyses surprisingly converged toward an increased expression of two genes never identified sofar as crucial for HSC functions: Pumilio1 (Pum1) and Pumilio2 (Pum2). Pum1 and Pum2 are posttranscriptional regulators belonging to the Pumilio-FBF (PUF) family of RNA-binding proteins. Although it was established that the primordial role of PUF proteins is to sustain mitotic proliferation of stem cells in Invertebrates, so far nothing is known about the role of Pum1 and Pum2 in human and murine HSCs.For these reasons, we have investigated the roles and mechanisms of action of Pum1 and Pum2 in murine and human HSCs through shRNA strategy. Pum1 and Pum2 knockdown (KD) in murine HSCs led to a decreased HSC expansion and clonogenic potential ex vivo, associated with an increased apoptosis and a cell cycle arrest in G0/G1 phase. KD of both Pum1 and Pum2 enhanced these effects, suggesting a cooperative effect. Expansion and clonogenic potential of KD Pum1 HSCs were rescued by enforced expression of Pum1 (insensitive to our shRNA), thus validating the specificity of our shRNA. Enforced expression of Pum1 could not rescue the functions of Pum2 KD HSCs, highlighting the non-redundant role of these proteins. Furthermore, when Pum1 or Pum2 KD HSCs were inoculated into lethally irradiated mice to follow the long-term hematopoietic potential, only rare bone marrow cells derived from Pum1 and Pum2 KD HSCs were evidenced after 4 months, contrary to control HSCs. Identical results were obtained with human Pum1 or Pum2 KD HSCs.In conclusion, our results demonstrate the involvement of Pumilio factors in stemness maintenance, expansion and survival of murine and human HSCs. Identification of Pumilio factors and their targets as new regulators of HSCs expansion will allow consider them as new tools for therapeutic perspectives.

Osteoarthritis (OA) ist eine degenerative Erkrankung des hyalinen Knorpels. Knorpel ist ein avaskuläres Gewebe. Wenn dieser beschädigt wird, ist es schwierig, ihn zu reparieren. Der Gelenkknorpel ist verantwortlich für die glatte, reibungs- und schmerzlose Bewegung des Kniegelenks. Schwere Verluste oder die komplette Zerstörung des Gelenkknorpels führen zu hoher Reibung und Schmerzen bei der Bewegung des Kniegelenks, wie es oft in den späten Stadien der OA der Fall ist. Der komplette Gelenkersatz bleibt die ultimative Lösung. Jedoch gibt es viele andere Möglichkeitenden Knorpel über die Implantation von Stammzellen zu reparieren oder zu regenerieren, jedoch oft mit schwerwiegenden Folgen. Die Transplantation embryonaler Stammzellen kann beispielsweise zu Teratombildung führen. Die Nutzung von induzierten pluripotenten Stammzellen ermöglicht die Virusintegration in das Genom. Alternativ entstand das Konzept der Vorläufer- oder Reparaturzellen in situ. Beispielsweise fand man in späten Stadien der Osteoarthritis im menschlichen Knorpel chondrogene Vorläuferzellen mit migratorischen Fähigkeiten (CPCs). Bei Knorpelregeneration mit diesen Zellen sind bisher keine Risokofaktoren bekannt. Sie haben eine enorme Fähigkeit für die Knorpelreparatur ohne das schwerwiegende Risikofaktoren bisher bekannt waren. Allerdings bestehen noch Fragen zum Beispiel wie man CPCs in situ induziert, um das Gewebe auf physiologische Weise zu reparieren. Zweitens haben CPCs eine begrenzte Lebensdauer, zumindest in vitro. Darüber hinaus gibt es keine verfügbare optimierte Methode, um eine vollständige chondrogene Differenzierung von Stammzellen zu erreichen. Vor kurzem wurden primäre Zilien gefunden, die hilfreich für die Stammzelldifferenzierung sein könnten. Diese Zilien arbeiten als Dual-Sensor für mechanochemische Signale. Dieser Sensor wurde auch auf CPCs gefunden, bei Chondrozyten gewonnen aus Kiefergelenken (TMJ) von Discoidin-Domänen- Rezeptor-1- Knockout- Mäusen (DDR- 1 KO). OA ist nicht nur auf die großen Gelenke beschränkt, sondern wirkt sich auch auf die kleinen Gelenke wie das Kiefergelenk aus. Es ist gut bekannt, dass Chondrozyten im Gelenkknorpel keinen direkten Zell-zu-Zell-Kontakt besitzen vielmehr beruht die Kommunikation auf Zell-Matrix - Wechselwirkungen über Zellrezeptoren z.B Integrine oder DDRs. DDR -1- KO-Mäuse zeigen typische Symptome der Arthrose des Kiefergelenkknorpels. Die aus dem Kiefergelenknorpel der DDR - 1 KO Mäuse abgeleiteten Chondrozyten behielten ihre Arthroseeigenschaften. Einerseits wiesen sie eine hohe Expression von runx2 und Kollagen Typ I als typische osteogene Signaturen auf sowie andererseits eine geringe Expression von sox9, Kollagen Typ II und Aggrecan, welche relevant für die chondrogene Differenzierung sind. Die osteoarthritischen Charakteristika könnten zu einem normalen Chondrozyten- Typ umgekehrt werden über den Knockdown von runx2 oder der Exposition dieser Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung und in Gegenwart von extrazellulärer Matrix (ECM) -Komponenten wie Laminin und Nidogen. Die Umkehr in Richtung des chondrogenen Phänotyps ist auch für die Pathogenese der Meniskusdegeneration von großer Bedeutung. Der Meniskus ist in den meisten Fällen der Ausgangspunkt für die Entwicklung von OA des Kniegelenks. Der Meniskus ist ein Bindegewebsknorpel, der als Stoßdämpfer wirkt. Hierbei verschlimmert eine Menikusschädigung die OA Pathogenese durch verstärkten Knorpelabbau. Der innere Teil des Meniskus ist avaskulärer Natur und hat eine sehr begrenzte Eigenreparaturfähigkeit. Es gibt jedoch andere Möglichkeiten, wie die teilweise Entfernung des Meniskus, die zu einer kurzfristigen Entlastung führt. Dies verhindert jedoch nicht die langfristigen Folgen, die letztlich zur Entwicklung von OA führen. Der innere Teil des menschlichen Meniskus birgt einzigartige Vorläuferzellen (MPC) und kann zur Meniskus-Regeneration über den TGFß -Signalweg aktiviert werden. Darüber hinaus wurden Maus-Meniskus-Progenitorzellen (MMPCs) in gesundem Meniskusgewebe untersucht. Diese Zellen wurden mittels immunohistochemischen Techniken ex vivo charakterisiert und behielten ihre Stammzelleigenschaften auch in vitro. Mit der Anwendung verschiedener Stammzellen zur Therapie der Knorpelregeneration sind viele kritische Konsequenzen assoziiert. Im Fokus standen deshalb gewebespezifische Zellen auch in situ Vorläuferzellen genannt, die bereits in erkranktem Knorpel vorhanden sind. Diese Zellen können sich in chondrogener Richtung entwickeln. Hierfür benötigen sie möglicherweise nur geringe Manipulationen, um daraufhin hyalinen Knorpel zu produzieren.

Our objective was to address current cell source limitations in engineering pancreatic â-cells for the treatment of type 1 diabetes by investigating retroviral genetic modification of murine embryonic stem cells (mESC) with a murine stem cell virus (MSCV) encoding proendocrine transcription factor Neurogenin 3 (Ngn3). We found that expression of Ngn3 and the enhanced green fluorescent protein (eGFP) reporter gene were both significantly silenced in genetically modified mESCs. To overcome this obstacle and enhance the efficiency of retroviral gene transfer to mESCs in general, we employed a virus-polymer complexation method to deliver more transgenes to mESCs. Despite increased transgene delivery and integration in mESCs, transgene expression did not increase. Results suggest mESCs may be restricted in several steps of retrovirus transduction. We then investigated which steps of the virus lifecycle restrict efficient transduction of mESCs by using a recombinant MMuLV-derived retrovirus and a recombinant HIV-1-derived lentivirus to compare three major steps in the transduction of mESCs and NIH 3T3 cells - virus binding, virus integration, and transgene expression. We found that retroviruses and lentiviruses similarly bind 3 or 4-fold less efficiently to R1 mES cells than to NIH 3T3 fibroblasts. We also detected 3-fold fewer integrated retrovirus transgenes and 11-fold lower expression levels in NIH 3T3 cells, suggesting the primary limitation to retrovirus transduction may be low levels of transgene expression. In contrast we detected 10-fold fewer integrated lentivirus transgenes and 8-fold lower expression levels, suggesting lentivirus transduction may be limited by inefficient intracellular post-binding steps of transduction. We then investigated whether depletion of linker histone 1 in mESCs would alleviate silencing of retrovirus transgenes and improve gene transfer by transducing histone H1c, H1d, H1e triple null mESCs with different recombinant vectors. We found this did not improve viral gene transfer. This research is significant for improving protocols for gene transfer to ES cells and facilitating the use of modified ES cells in regenerative medicine.

Liver progenitor cells (LPCs) play a major role in the regeneration process following chronic liver damage. LPCs can differentiate into hepatocytes and cholangiocytes and thus are capable of replenishing the damaged liver. Due to their plasticity and robust nature in culture systems, they are promising candidates for use in cell therapy. However, to be able to use LPCs as tissue regenerating stem cell-like cells in the clinic, we need to fully understand how they are controlled. Although a strong association between LPCs and inflammation has been shown in many chronic liver diseases, the role of the immune system in LPC-mediated hepatic regeneration is poorly understood. We hypothesise that specific immune cells and mediators are needed to induce the LPC compartment, and that these are common to the LPC response in different injury settings. Therefore, the present study focused on the characterisation of the inflammatory environment in the LPC response, which generates this niche. The aims of this study were (i) to identify the immune cells that are important for the LPC response, (ii) to define the cytokine profile and (iii) to determine the role of the cytokine producing cells during liver regeneration. To study hepatic inflammation following liver injury, a diet-induced model of liver injury (choline-deficient, ethionine-supplemented diet, CDE diet) was compared to two transgenic mouse models of immune-mediated hepatitis (Met-Kb, 178.3). Although all three models are characterised by hepatitis, histological analysis revealed that LPCs were only detectable in the CDE and Met-Kb livers. In the 178.3 model, livers regenerated from proliferating hepatocytes. An LPC response could not be induced in these mice even when liver damage was made more severe. In the other two models, LPC numbers increased over time showing the highest numbers one week after the peak of liver injury. LPCs were often found in close proximity to inflammatory cells, in particular macrophages.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2005. / Härtill 6 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Oklahoma. / Bibliography: leaves 137-158.

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2007. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Une nouvelle théorie du cancer s’est récemment imposée dans la communauté scientifique. Selon cette dernière, les cancers se développeraient à partir d’une sous-population bien particulière de cellules cancéreuses, appelées « cellules souches cancéreuses » (CSC). Les partisans de la théorie des CSC soutiennent que les rechutes seraient causées par ces cellules, plus aptes à échapper aux thérapies classiques. En conséquence, ils soutiennent que l’élimination de toutes les CSC, dans un cancer donné, est nécessaire et suffisante pour guérir le patient. Dans cette thèse, je propose d’examiner cette stratégie thérapeutique de ciblage des CSC et je montre que sa capacité à guérir les cancers dépend de la façon dont on envisage la nature de la propriété souche. En effet, les cellules souches cancéreuses sont définies par la possession de la propriété souche, c’est-à-dire par leur capacité à s’auto-renouveler et à se différencier. Cependant, cette propriété elle-même reste obscure quant à sa nature. S’agit-il d’une propriété catégorique ou d’une disposition ? Une cellule non-souche (cancéreuse ou non) peut-elle acquérir la propriété souche et sous quelle condition ? En me basant sur une analyse de la littérature scientifique, je montre que quatre conceptions distinctes de la nature de la propriété souche sont aujourd’hui possibles et que, si la théorie des CSC est vraie, déterminer la nature exacte de la propriété souche est capital pour le traitement des cancers. / A new theory of cancer has recently gained importance in the scientific community. According to this theory, cancers develop from a particular sub-population of cancer cells, named “cancer stem cells” (CSCs). The proponents of the CSC theory argue that relapses are caused by CSCs because they escape classical therapies. Consequently, they claim that eliminating all the CSCs of a given cancer is a necessary and sufficient condition to cure the patient. In this dissertation, I scrutinize this therapeutic strategy and I argue that its ability to cure cancers will depend on our understanding of the nature of stemness. Indeed, cancer stem cells are characterized by this property, that is, the capacity to self-renew and to differentiate. However, the nature of stemness is rather obscure. Is it a categorical property or a disposition? Can a non-stem cell (cancerous or not) acquire stemness, and under which conditions? On the basis of analysis survey of the scientific literature, I distinguish four possible concepts of the nature of stemness. I contend that if the CSC theory is true, determining the exact nature of stemness is essential for cancers treatments.