Orientador: Fausto Viterbo / Banca: Antonio de Castro Rodrigues / Banca: Jesus Carlos Andreo / Banca: Valéria Paula Sassoli Fazan / Banca: Jayme Adriano Farina Junior / Resumo: As lesões de nervos periféricos representam um grande desafio para a medicina. Inúmeras técnicas visam solucionar a regeneração do nervo periférico. Os protocolos de recuperação funcional destes nervos são diversos e os resultados nem sempre apresentam soluções que promovam a regeneração da via motora e sesitiva. Com o advento da engenharia tecidual, a partir da diferenciação de células-tronco, surgiu uma nova alternativa terapêutica para a regeneração de nervos. O objetivo deste trabalho é estudar a regeneração de nervo mediante tubulização por enxerto de veia autóloga e verificar se o uso da combinação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) e plasma rico em plaquetas (PRP) na tubulização do nervo fibular comum altera a morfologia e fisiologia deste nervo e de músculos inervados por ele. Os animais foram divididos em seis grupos, sendo três controles e três experimentais. O G1 (n=10) representou o controle inicial. Os grupos G2, G3 e G4 (n=20) representaram os Grupos Experimentais e receberam, após ressecção do segmento nervoso, enxerto de veia jugular externa de 20 mm tubulizando os dois cotos do nervo, sendo que G2 não recebeu preenchimento, G3 foi preenchido com PRP, G4 foi preenchido com PRP e células tronco, G5 (n=10) representou o controle final e o G6 (n=20) representou o controle de desnervação. Foram obtidas células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) do mesmo animal, com caracterização fenotípica, utilizando CD90 e CD44 identificando a expressão média de 86,5%. As CTM-TA foram expandidas em cultura e aplicadas na concentração de 5x106 por animal. O índice funcional foi avaliado pela marcha, testes eletrofisiológicos de latência e amplitude e ainda foi realizada a análise morfométrica das fibras nervosas, observando o diâmetro mínimo da fibra, diâmetro mínimo do axônio, área das fibras, área do axônio, área ... / Abstract: Peripheral nerves injuries represent an enormous clinical challenge in medicine. Numerous techniques aim for regeneration of peripheral nerves. Nowadays, there are different protocols concerning to its functional retrieval and the results of current researches do not always show solutions to promote a regeneration of motor and sensory via. With the advent of tissue engineering, from the stem cells differentiation, arise a new therapeutic alternative in nerve regeneration. The aim of this study was to analyze the nerve regeneration by tubulization technique using autologous graft, as well as to verify whether the combination of mesenchymal stem cells from fat tissue (CTM-TA) and platelet-rich plasma (PRP) in tubulization of Commom Peroneal Nerve modify the morphology and physiology of this nerve nor muscles that it innervates. Animals were divided into six groups, consisting in three control and three experimental groups. G1 group (n=10) represented the Inicial Control Group. G2, G3 and G4 group (n=20) corresponded to the experimental groups and also receive, after resection of the nerve, an external jugular vein graft of 20 mm, thereby performing a tubulization of the two nerve stumps, where G2 was not filled; G3 was filled with PRP; G4 was filled with PRP and stem cells; G5 (n = 10) represented the Final Control Group and G6 (n = 20) symbolized the Control Denervation Group. It was obtained mesenchymal stem cells from fat tissue (MSC-FT) from the same animal, with phenotypic characterization using CD90 and CD44, thus identifying the average expression of 86.5%. MSC-FT were expanded in culture and applied at a concentration of 5x106 per animal. The functional index was evaluated by walking tracks analysis, electrophysiological latency test and amplitude, besides the morphometric analysis of nerve fibers (observing the minimum diameter of the fiber), the minimum diameter of the axon, fiber area, axon area, myelin area and myelin sheath ... / Doutor

O avanço da ciência regenerativa está se comprometendo com a busca de novas opções terapêuticas no combate as diversas doenças e disfunções orgânicas. Nessas avançadas linhas de pesquisas, as células-tronco são um símbolo dessa evolução. A variedade da aplicação deste novo e experimental método de tratamento está sendo utilizado, pela bioengenharia, para reparar tecidos e órgãos lesados. Defeitos ósseos extensos ocorrem após diversos tipos de injúrias ao esqueleto facial, como traumas faciais, ressecções por lesões agressivas e malformações congênitas. Essas sequelas são tratadas, preferencialmente, através da reconstrução utilizando enxertos ósseos de origem autógena. Entretanto, às desvantagens proporcionadas pela obtenção do tecido ósseo autógeno, lançaram um dos maiores desafios, da bioengenharia que é a busca pelo aprimoramento dos substitutos ósseos. Nesse caminho do aprimoramento dos biomateriais a adição de células-tronco mesenquimais representam a possibilidade da criação de um sinergismo, entre as células e o arcabouço, para otimizar a osteogênese. Nessa linha, esse estudo propõe-se a avaliar o reparo ósseo em estudo experimental, em modelo animal, através do tratamento de defeito ósseos criados em fêmures de ratos. A amostra dessa pesquisa foi composta de 96 ratos albinos da espécie Rattus novergicus albinus, linhagem SHR (Spontaneously Hypertensive Rats), isogênicos. Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de acordo com o tipo de tratamento (Grupo I: α – TCP + ADSCs; Grupo II: α – TCP + ADSCs/ENDO; Grupo III: α – TCP; Grupo IV). A cultura de células tronco tiveram como tecido de origem o tecido adiposo da região abdominal e as células endoteliais formam coletadas da medula óssea. A peças foram avaliadas em 03 períodos de tempo diferentes (07, 14 e 21 dias). A histomorfometria avaliou a área de neoformação óssea dos defeitos bem como a imunohistoquímica com marcação para a proteína VEGF avaliou a eficácia da adição das células endoteliais. Os resultados demonstraram, através dos testes estatísticos que houve uma diferença estatisticamente significante, no reparo ósseo, favorecendo os tratamentos dos defeitos que utilizaram a terapia celular e a vascularização foi também otimizada no grupo que foi tratado com a adição das células endoteliais. Dessa forma conclui-se que nesse modelo de estudo a utilização das ADSCS foram capazes de otimizar o reparo ósseo. / The regenerative medicine has been searching for a new therapeutic options to manage diseases and also organic dysfunctions. The advanced research fields, has enrolled the stem cells to achieve the upgrade in the new treatment objectives. The bioengineering is application of this new and experimental, treatment method to repair damaged tissues and organs using the stem cells, includes the possibility to acelerating and improving the bone repair process. The autogenous bone graft has been considered the gold standart graft material to reconstruction the bone defects, fundamentally because of the osteogenic potential. However, the harvest disadvantages autogenous bone tissue leads to the search for bone substitutes improvement. In this field a promising alternative has been proposed by tissue engineering. The totipotent cells, also called mesenchymal stem cells, which has the cellular plasticity ability, is associated with biomaterials, creating a synergy, between these cells and the scaffold, to optimize the osteogenesis. The tissue engineering application to tissue repair has been extensively researched with the aim of proposing more reliable and more efficient clinical methods. Although the effects of the use of adult stem cells are well known in bone marrow transplants, in some areas, such as bone repair, there is still lack of scientific data. This research was conducted, in animal model, to assessment bone repair in created femural bone defects treated with mesenchymal stem cells. 96 animals (Rattus novergicus albinus - Spontaneously Hypertensive Rats) were randomly divided into four groups (Group I: α - TCP + ADSCs, Group II: α - TCP + ADSCs/Endo, and Group III: α - TCP; (07, 14 and 21 days). The histological sections were stained in H&E and the histomorphometry was used to evaluated the new bone formation area in the defects and also the immunohistochemical expression of VEGF was analysed. Our results suggest that the combination of ADSCs and the scaffold was able to enhance the bone repair in this study model.

A maioria das perdas auditivas adquiridas ou congênitas decorre de dano ou perda das células ciliares da cóclea ou dos seus neurônios associados. A irreversibilidade da surdez em mamíferos ocorre devido à incapacidade de substituição das células perdidas, seja por divisão celular ou por regeneração de células endógenas no epitélio da orelha interna. Com isso o objetivo deste trabalho foi obtenção de linhagens de células progenitoras do epitélio coclear de fetos de cães com 40 dias de gestação, colaborando com futuras pesquisas relacionadas a trabalhos de tratamento para surdez neurossensorial. Foram utilizados oito fetos caninos com idade compreendidos a 40 dias de gestação, nos quais, foi realizada uma dissecação no crânio, expondo a cóclea para a retirada do epitélio coclear, visando sua analise morfológica, e obtenção de suas células. Para analise morfológica do tecido colear realizou-se as técnicas macroscópica, microscópica e de imunohistoquímica. As células obtidas da cóclea foram fotodocumentadas, e submetidas às analises de método colorimétrico MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-уl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), análise do ciclo celular, análise da imunofenotipagem e da diferenciação celular. Em cultivo as células apresentaram formato fibroblastóide. Na caracterização imunofenotipica apresentaram marcação positiva para marcadores de células-tronco mesenquimais e de pluripotência e marcação negativa para células hematopoiéticas. Apresentaram ainda a capacidade de diferenciação para linhagens celulares osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. Essas análises sugeriram resultados satisfatórios na obtenção, quantificação e caracterização dessas células, as quais foram adquiridas a partir de células do epitélio coclear de feto de cão, as quais poderão constituir fontes de células a serem utilizadas na terapia celular da espécie canina destinada ao tratamento de surdez causada por lesões ou danos do epitélio coclear / Most acquired or congenital hearing loss results from damage or loss of hair cells of the cochlea or their associated neurons. The irreversibility of deafness in mammals is due to the lost cells replacement inability, either by cell division or by regeneration of endogenous cells in the epithelium of the inner ear. Therefore, the objective of this work was to increase knowledge about getting progenitor cell lines of the cochlear epithelium from dogs’ fetuses with 40 days of gestation, collaborating with future research related to treatment work for sensorineural deafness. Eight canine fetuses were used aged as mentioned above, in which, a dissection was performed in the skull, exposing the cochlea to the withdrawal of the cochlear epithelium, for their morphological analysis and cells obtainment. For morphological analysis of the cochlear tissue was held the macroscopic techniques, microscopy and immunohistochemistry. The cochlea cells obtained were photo documented and analyzed for the colorimetric method MTT ( 3- ( 4,5- dimethylthiazol -2- уl ) -2,5 - Diphenyltetrazolium Bromide), cell cycle analysis, immunophenotyping analysis and cell differentiation. In culture, the cells showed fibroblast format. In immunophenotype characterization, they presented positive staining for mesenchymal stem cell markers and pluripotency and negative marking for hematopoietic cells. They also exhibit the differentiation capacity for cell osteogenic lineages, adipogenic and chondrogenic. These analyzes suggested satisfactory results in obtainment, quantification and characterization of these cells, which were acquired from the dog fetal cells’ cochlear epithelium, which may be cells of fonts to be used in cellular therapy of canine species for the treatment of deafness caused by injury or damage to the cochlear epithelium

As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética / The spermatogonial stem cells (SSCs) are characterized by the capacity for self-renewal, proliferation and transmission of genetic information. In canines the first attempt to xenotransplantation did not achieve the success of sperm production. However, there is evidence that testicular xenogeneic cells can be transplanted into the testis of the host animal, and generate viable sperm donor. Therefore, this study aims conduct xenotransplantation of the canine germ cells in immunosuppressed mice, and thereby promote the production of viable sperm canines, genetically modified. And by this technique, analyze the efficiency of post-transplant spermatogenesis. Testicular germ cells were identified, isolated and cultured prepuberes dogs through enrichment culture systems and growth factors. Cells were modificated with a reporter gene GFP and LacZ. The SSCs canine was transplanted in mice (C57Bl/6), after different period and then the recipient animals were euthanized and analyzed. After 10 days in culture the germ cells were positive for CD49f, CD117, and 5 days a similar expression of GFRA1 and DAZL was observed, demonstrating the presence of SSCs and some cells in meiosis. 105 cells were transplanted and 20-43% of the transplanted cells were identified in the basement membrane of the seminiferous tubules after 90 days after transplantation. Therefore, the transplantation of canine germ cells showed that the cultivation and purification are performed possible for canine SSCs, it can colonize the seminiferous tubules the mice infertility remained alive in the basement membrane for 90 days after transplanting, even though these animals have phylogenetic distance

O camundongo mdx é um modelo animal muito utilizado para estudar a distrofia muscular degenerativa de Duchenne (DMD) e apesar de o modelo apresentar uma degeneração mais branda, inúmeras pesquisas com este animal são realizadas devido à alta reprodutibilidade de fenótipos, obtenção comercial de várias linhagens e baixo custo de manutenção. A degeneração muscular progressiva ocorre devido a uma mutação genética que culmina na ausência ou diminuição da produção da proteína distrofina. Esta alteração gera uma cascata de eventos que pioram a degeneração muscular. Atualmente, a terapia preconizada é o uso de corticóide, que visa modular a inflamação muscular e possui uma série de efeitos colaterais, por isso uma série de estudos propondo outras formas de tratamento vem sendo desenvolvidos. Um tratamento promissor parece ser a terapia celular com células-tronco mesenquimais, a qual pode interferir no processo degenerativo por imunomodulação celular. Como a acupuntura pode controlar o processo inflamatório de doenças degenerativas, tal qual na doença de Parkinson, acredita-se que o uso consorciado das duas terapias possa diminuir o efeito degenerativo da DMD. Nesta pesquisa foram avaliados 22 camundongos mdx, machos, 4 a 6 semanas de idade. As células-tronco utilizadas para a aplicação foram de polpa dentária humana carregando a proteína verde fluorescente (EGFP) e a quantidade aplicada em cada acuponto foi de 1x104 células. Os acupontos selecionados foram B47 (Hunmen), B49 (Yishe) e B52 (Zhishi). Os animais foram distribuídos aleatoriamente em quatro tratamentos (A) células-tronco em acupontos falsos, (B) solução fisiológica em acupontos verdadeiros, (C) células-tronco em acupontos verdadeiros e (D) controle, sem nenhum tratamento. No total três injeções foram realizados em um período de 56 dias de estudo. As avaliações do tratamento foram feitas através das análises da força de tração dos músculos, da creatinofosfoquinase sérica (CPK), histológica através da estruturação das miofibrilas e morfometria do colágeno e imuno-histoquímica pela expressão da proteína distrofina. Ao décimo dia após a terceira aplicação de células-tronco observa-se uma diferença somente no grupo controle, a qual manifestou um aumento da CPK em relação aos outros tratamentos e sem diferença estatística para força de tração pelos membros torácicos. Na histologia dos músculos tibial cranial e diafragma foram observou-se infiltrados inflamatórios, regeneração tecidual e diminuição do colágeno nos grupos tratados p<0,05. Na imuno-histoquímica verificou-se uma melhora da quantidade de distrofina nos animais tratados principalmente no tratamento células-tronco em acupontos verdadeiros p< 0,05 e, pela análise do rastreamento das células-tronco com EGFP não se pode determinar o seu caminho uma vez que não observamos imunorreatividade nas análises utilizando o anti-GFP. Conclui-se que os tratamentos com terapia celular nos acupontos verdadeiros, acupontos falsos e solução fisiológica nos acupontos podem melhorar a doença degenerativa muscular no mdx pelo aumento da expressão da proteína distrofina. / Muscular dystrophy in mdx mouse is an animal model used to study Duchenne muscular dystrophy (DMD) in humans. Although this model presents a milder degeneration, there are several studies with this animal due to the high reproducibility of phenotypes, obtaining various lines available and low maintenance cost. It is known that progressive muscle degeneration occurs due to a genetic mutation that culminates in the absence or decreased production of dystrophin protein. This change generates a cascade of events which aggravate the muscle degeneration. Currently, the recommended therapy is the use of corticosteroids to modulate muscle inflammation; however, there are a number of collateral effects, so a series of studies suggesting other forms of treatment have been developed. A promising treatment seems to be a therapy with mesenchymal stem cells, which can interfere with the degenerative process by cellular immunomodulation. As acupuncture can control the inflammatory process of degenerative diseases such as Parkinson\'s disease, the use of both syndication therapies may reduce the DMD degenerative effect. In this study 22 mdx mice, males, 4-6 weeks of age were evaluated. Stem cells were used for the application of human dental pulp carrying the green fluorescent protein (EGFP) and the quantity applied to each acupoint was 1x104 cells. The acupoints selected were B47 (Hunmen), B49 (Yishe) and B52 (Zhishi). The animals were randomly assigned to four treatments groups: (A) stem cells in false acupoints, (B) saline in true acupoints, (C) stem cells in true acupoints and (D) control without any treatment. In total, three injections were performed over a period of 56 days of study. Evaluations of treatment were made by analyzing the tensile strength of muscles, measuring the serum creatine phosphokinase (CPK), structuring of myofibrils by histology and morphometry of collagen immunohistochemistry and by the amount of dystrophin protein. At day ten after the third application of stem cells there is a difference only in the control group, which manifests an increase in CPK compared to other treatments and no statistical difference in tensile strength. In the histology of cranial tibial muscles and diaphragm, inflammatory infiltrates were observed, as well as tissue regeneration and decreased collagen in the treated groups (p <0.05). On immunohistochemistry there was an improvement in the amount of dystrophin in animals treated mainly in acupoints true (p <0.05) and through analysis and tracking of stem cells with EGFP it was not possible to determine its path once immunoreactivity was not observed in analyzes using anti-GFP. We conclude that treatment with stem cell therapy on true and false acupoints and with saline solution on acupoints can improve muscular degenerative disease in mdx by increased expression of dystrophin protein.

Orientador: Li Li Min / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T06:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarceloRibeirodos_M.pdf: 15997698 bytes, checksum: a2a854db0d49fda4c48ff382a7aaa486 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As injeções de células tronco de medula óssea, autólogas ou heterólogas, estão na vanguarda das terapias celulares bem sucedidas, apresentando resultados interessantes na cura de diversas patologias, incluindo aquelas usualmente associadas com o envelhecimento. Entretanto, nunca foram testadas injeções de células-tronco em modelos de envelhecimento natural, o que constitui uma séria lacuna de conhecimento que precisa ser preenchida. Neste trabalho caracterizamos e injetamos células mononucleares de medula óssea de camundongos transgênicos c57Bl/6 EGFP jovens em camundongos c57Bl/6 em meia-idade e velhice extrema. As células injetadas foram caracterizadas como diplóides e normais em citometria de fluxo de ciclo celular apresentando, no entanto, instabilidade genética quando submetidas ao cultivo para análise citogenética, com formação de células poliplóides anormais, indicando um possível fenótipo "mutator". Foi feito o acompanhamento do estado geral e desempenho reprodutivo dos animais após as injeções, visualizando-se o comportamento das célulasmononucleares injetadas através de análise histológica e citogenética após a morte natural ou sacrifício dos animais. Todos os animais injetados apresentaram a formação de neoplasia EGFP+ hemolinfóide indiferenciada de alto grau histológico ao atingirem a idade média de mortalidade para a linhagem c57Bl/6. Em um experimento paralelo de injeções heterólogas de células mononucleares de medula óssea em cães SRD (sem raça definida) com seqüelas neurológicas causadas por cinomose, houve remissão dos sintomas na maior parte dos indivíduos injetados e não houve formação de neoplasia após 8 meses de acompanhamento. Estes resultados enfatizam a correlação entre células-tronco, tumorigênese e envelhecimento, demonstrando que células jovens portadoras de instabilidade genética intrínseca podem permanecer normais e quiescentes em organismos jovens, desencadeando a formação de neoplasia quando submetidas ao ambiente celular de organismos velhos / Abstract: Bone marrow mononuclear cell transplantation has been successfully used in the treatment of several pathologies. However, stem cell injections have not been examined in models of natural aging. In this study we derived bone marrow mononuclear cells from young c57Bl/6 EGFP mice and investigated the effects of transplantion into aged mice. EGFP transgenic mice have been an important tool in the study of stem cell behavior both in vivo and in vitro models. The bone marrow mononuclear fraction has been intensively used in animal experiments and human clinical trials and EGFP transgenic mice cells are the basis for many experiments involving bone marrow mononuclear cell transplantation. However, the EGFP mice mononuclear fraction has never been characterized concerning cellular content, stages in cell division and cytogenetic stability. We performed the cytometric characterization of EGFP transgenic mice bone marrow mononuclear cells, profiling cell proportions in stages of differentiation and cell division, as well as ploidy. We also make the cytogenetic control of these cells to determine chromosomic stability under cultivation. Aged c57Bl/6 mice were transplanted with young c57Bl/6 EGFP mice mononuclear cells. The general health and reproductive performance before and after transplantation was recorded, and histopathological analysis was performed after the death of the animals. All injected mice developed an hemolymphoid neoplasia of high histological degree originating from the transplanted cells upon reaching average death age for c57Bl/6. Neoplastic cells were found in the liver, spleen and lymph nodes, leading to death in a few weeks. Cytogenetic analysis showed abnormal karyotypes in cultured tumor cell lines obtained from these mice. The injected EGFP mononuclear cells have a normal cytometric profile, including normal ploidy, but upon cultivation for cytogenetic analysis loose stability, presenting polyploidy in many of the analyzed cells. These results suggest a mechanism of genetic instability innate to these cells. In a parallel experiment of heterologous bone marrow mononuclear cell injections in mixed breed dogs with neurologic canine distemper sequels, there was remission of symptoms in most patients and no neoplasia outcomes after an 8 months follow up. Our results highlight the relationship between stem cells, aging and tumorigenesis and suggest the need for careful investigation of the adverse effects of stem cell therapies due to their neoplastic potential / Mestrado / Neurociencias / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Radovan Borojevic / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T18:37:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assis_IsabellaMarianade_M.pdf: 8539134 bytes, checksum: fcbe68b90d8af44acaf0dc538b030450 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Terapias celulares para o tratamento de doença isquêmica cardíaca estão atualmente sob investigação. Foram anteriormente publicados pelo nosso grupo os resultados de ensaio clínico na fase I, onde células autólogas mononucleares da medula óssea foram injetadas por via transendocárdica em pacientes com doença cardíaca isquêmica terminal. O estudo atual reporta os achados anatomopatológicos do estudo post-mortem de um dos pacientes tratados, que morreu 11 meses após a terapia celular objetivando verificar a presença de neovascularização nas zonas tratadas assim como descrever a possibilidade de ter havido transdiferenciação de populações celulares. Trata-se de estudo necroscópico de paciente de 55 anos com cardiomiopatia isquêmica, com defeito parcial reversível na parede anterolateral e defeito fixo (cicatriz) na parede posterior, pertencente à classe funcional III (NYHA ¿ New York Heart Association) e angina classe III (CCS ¿ Canadian Cardiovascular Society). O paciente recebeu um total de 30 milhões de células mononucleares da medula óssea colhidas 2 horas antes da injeção, obtidas através de punção óssea. As células foram injetadas por via transendocárdica na parede anterolateral do ventrículo esquerdo com o auxílio de mapeamento eletromecânico. Fragmentos das paredes ventriculares, anterolateral (a que recebeu a terapia celular), septal (septo interventricular, a qual tinha perfusão normal e que não recebeu terapia celular) e a inferoposterior (a qual tinha cicatriz extensa e sem terapia celular) foram retiradas durante a necropsia e processados em parafina e congeladas. Anticorpos foram utilizados contra fator VIII para células endoteliais, actina a de músculo liso para pericitos, troponina T, actina a sarcomérica e actinina a sarcomérica e desmina para identificação de cardiomiócitos. Estudo histomorfométrico da densidade capilar nas diferentes paredes ventriculares e da densidade de capilares contendo pericitos foi realizado, assim como foi quantificado o número de capilares/mm2 das paredes anterolateral e posterior, dados estes submetidos a testes estatísticos. Nossos resultados demonstraram não haver crescimento excessivo de nenhuma população celular, havendo aumento significativo da densidade de capilares com e sem pericitos na parede anterolateral. Nas zonas de cicatrizes comparando-se a parede anterolateral com a posterior foi verificado também haver aumento significativo do número de capilares. Nesta mesma parede houve uma hiperplasia dos pericitos, algumas destas células adquiriram elementos do citoesqueleto e proteínas contráteis (desmina e troponina). Em conclusão, nosso estudo demonstrou que o procedimento utilizado é seguro e que leva ao aumento da densidade capilar, hiperplasia pericitária com provável transdiferenciação de pericitos em cardiomiócitos / Abstract: Cell-based therapies for treating ischemic heart disease are currently under investigation. We previously reported the results of a human phase I trial of transendocardial injection of autologous mononuclear bone marrow cells in patients with end-stage ischemic heart disease. The current report focuses on post mortem cardiac findings from one of the treated patients, who died 11 months after cell therapy in order to verify modifications on cardiac structure produced by the procedure. The heart of study was obtained on necropsy of a 55 years old patient suffering of an ischemic cardiomiopathy with a reversible partial defect on anterolateral ventricular wall (scar), a fixed one in the posterior wall. At enrollment, he was in New York Heart Association (NYHA) functional class III and Canadian Cardiovascular Society (CCS) angina class III. Patient was treated with 30 millions bone marrow mononuclear cells collected 2 hours and injected transendocardially with the guidance of electromechanical mapping, into the anterolateral wall of the left ventricle. Fragments of ventricular wall, anterolateral, septal (interventricular) and posterior walls were collected for histology and frozen. Immunohistological detection of endothelial and pericytic population allowed the quantification of capillaries and pericytic containing capillaries in anterolateral, septal and posterior walls (surface density). The amount of capillaries present in fibrotic zones of anterolateral and posterior walls were also quantified. No signs of adverse events were found in the cell-injected areas. Capillary density was significantly higher (P<0.0001) in the anterolateral wall than in the previously infarcted tissue in the posterior wall. The increased vascularity of the anterolateral wall was associated with hyperplasia of pericytes, mural cells, and adventitia. Some of these cells had acquired cytoskeletal elements and contractile proteins (troponin, sarcomeric a-actin, actinin). In conclusion, our morphological and immunocytochemical analysis of the area that received autologous bone marrow cell injections showed no abnormal cell growth or tissue lesions, thereby suggesting the safety of transendocardial cell injections. The treated areas had a heightened capillary density. Pericyte hyperplasia and pericytes with cytoskeletons and early cardiomyocyte morphology were seen only at injected sites / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

As células tronco possuem a capacidade de auto renovação ilimitada e de se manterem indiferenciadas durante um período prolongado de tempo, até se diferenciarem em uma linhagem celular específica. Devido as dificuldades encontradas na utilização de células embrionárias por questões éticas, de segurança e histocompatibilidade e a limitada plasticidade das células tronco adultas, as células tronco fetais, derivadas de tecidos extraembrionários, aparecem no cenário terapêutico como uma alternativa promissora. Uma vez que apresentam alta capacidade de proliferação e expansão in vitro, além de sua característica imunogênica, por se encontrarem na interface materno fetal. Por conta destas características, a membrana amniótica surgiu como uma nova e importante fonte de células tronco em diferentes espécies. Neste trabalho, foram utilizados 8 fetos de coelhos para a coleta da membrana amniótica. A membrana foi isolada pela técnica de explante, as amostras foram cultivadas em meio DMEM-HIGH, e posteriormente criopreservadas nas passagens P4 e P8 para realizar os experimentos. Em cultivo, essas células apresentaram aderência a placa, alta capacidade de proliferação e morfologia semelhante à fibroblastos. Na caracterização imunofenotípica, houve expressão de marcadores de citoesqueleto, de células mesenquimais, proliferação, pluripotência e para precursores de células hematopoiéticas, embora não tenha ocorrido a expressão de marcadores de células hematopoiéticas (CD-45) e de células precursoras neuronais. Quando induzidas a diferenciação in vitro, as células amnióticas tiveram capacidade de se diferenciarem nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Além disso, quando injetadas em camundongos nude, não foi verificada a formação de tumor. Nossos resultados demostram que células de membrana amniótica de coelho podem ser consideradas células tronco mesenquimais com possibilidade de serem utilizadas no futuro na terapia celular / Stem cells are capable of unlimited self renewal and to remain undifferentiated for a prolonged period of time up to differentiate into a specific cell lineage. Due to the difficulties in the use of embryonic cells due ethical reasons, security and histocompatibility, and in the other hands, the limited plasticity of adult stem cells, fetal stem cells, derived from extraembryonic tissues, appear in the therapeutic setting as a promising alternative. They have high capacity of proliferation and in vitro expansion, as well as immunogenic properties, since they are at the maternal-fetal interface. Due to these characteristics, the amniotic membrane has emerged as an important new source of stem cells in different species. In this work, we used 8 fetuses of rabbits to collect amniotic membrane. The membrane was isolated by the explant technique. Samples were cultured in DMEM-HIGH, and cryopreserved in the passages P4 and P8 in order to perform the experiments. In culture, these cells exhibited adhesion to the dishes, high proliferative capacity and fibroblast-like morphology. In immunophenotypic characterization, there was expression of markers related to cell cytoskeleton, mesenchymal stem cells, proliferation, pluripotency, and hematopoietic precursor cells. And there was no expression of hematopoietic cell markers (CD-45) and neuronal precursor cells. When induced to in vitro differentiation, the amniotic cells were able to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Furthermore, when injected into nude mice, tumor formation has not been verified. Our results demonstrate that rabbit amniotic membrane cells can be considered mesenchymal stem cells with possibility to be used in the future in cell therapy

Avaliou-se a proliferação das células tronco da polpa de dentes decíduos esfoliados humanos (SHED) após aplicação única do laser de baixa potência. Foi realizada a análise da viabilidade das SHED cultivadas sob déficit nutricional e em condições ideais após irradiação com o laser de baixa potência vermelho de Indio Gálio Alumínio e Fósforo - InGaAlP (660nm, 40mW e 10J/cm2) e infravermelho (780nm, 40mW e 10J/cm2) durante 4 e 8 segundos, nos períodos de 24, 48 e 72 horas através dos ensaios de redução do MTT e do ensaio colorimétrico de Busatti e Gomes. Para análise estatística utilizou-se o teste ANOVA complementado pelo teste de Tukey com nível de significância de 5% (p< 0,05). Observou-se tanto com o MTT quanto com o ensaio colorimétrico de Busatti e Gomes uma tendência de aumento da proliferação celular diretamente relacionada à dose do LBP, estatisticamente significante nos períodos de 24, 48 e 72 horas. Ao analisar os resultados e considerando os parâmetros utilizados e o protocolo de LBP, pode-se concluir que o LBP promoveu a proliferação das SHED tanto a 660 nm quanto a 780nm, pode influenciar a viabilidade e a proliferação das SHED nas doses e comprimentos de onda utilizados e os ensaios do MTT e colorimétrico de Busati e Gomes demonstraram dentro de suas limitações ser eficientes para determinar a viabilidade e proliferação das SHED. / It was evaluated the proliferation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after a single application of low power laser. The viability of SHED grown under ideal conditions and under nutritional deficit after irradiation with red laser (660/780nm, 10J/cm2 and 40mW) during periods of 4 and 8 seconds was analyzed through the MTT reduction assays and rapid colorimetric assay of Busatti and Gomes. Statistical analysis was performed using the ANOVA and Tukey´s multiple comparisons test with a significance level of 5% (p < 0.05). It was observed with the MTT assay and Busatti and Gomes assay a trend of cell proliferation increase directly releated to the irradiation dose, statistically significant. After 24, 48 and 72 hours, all the groups showed higher cell proliferation when compared to control. Analyzing the results and considering the used parameters and LBP protocol, it can be concluded that LBP promoted the proliferation of SHED both 660nm and 780nm according to the dosage and wavelengths used, and MTT assay and colorimetric Busatti and Gomes demonstrated within their limitations to be effective in determining the viability and proliferation of SHED.

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Joaquim Murray Bustorff Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Volpe_BrunoBosch_M.pdf: 3151194 bytes, checksum: afd54e9f5fdcdd55a24ddfa4b90d02a7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As fístulas enterocutâneas (FE) são de difícil cicatrização e seu tratamento cirúrgico frequentemente falha, fazendo com que a fistula volte a abrir. Estudos recentes têm demonstrado que a terapia celular pode ser uma nova forma de tratamento nesta área. As células tronco mesenquimais (MSCs) são capazes de se auto- renovar tem alta capacidade proliferativa, podendo se diferenciar em várias linhagens celulares. Ainda apresentam capacidade imunomodulatória. A medula óssea, o sangue de cordão umbilical e o tecido adiposo são as principais fontes de MSCs. O tecido adiposo (TA) é de fácil acesso, sendo que o procedimento de lipoaspiração é um procedimento comum. O tratamento de fístulas enterocutâneas com AT-MSCs já foi testado algumas vezes, porém a fístula em sua grande maioria não se fecha totalmente. O objetivo deste estudo foi analisar o potencial terapêutico das MSCs aderidas a fios de sutura no intuito de melhorar a cicatrização e recuperação no tratamento de FE. O TA foi obtido através do procedimento de lipoaspiração. O TA foi submetido ao processo de digestão com colagenase. As células ficaram em meio de cultura DMEM com baixa glicose e com SFB durante 3 dias. Quando atingiram 80% de confluência, as células aderentes foram tratadas com tripsina e ressuspendidas com o meio citado acima. Na 4ª passagem essas células foram caracterizadas com citometria de fluxo, microscopia confocal e diferenciadas nas três linhagens mesodérmicas para confirmação que realmente são MSCs. Após, a confirmação de que as células eram realmente células tronco mesenquimais, elas foram aderidas em fios de sutura de poliglactina (4-0 Poly Vicryl / Poliglactina 910). Foram gotejadas 106 MSCs em cima de cada fio de sutura e logo em seguida foi adicionada a cola de fibrina (20uL Fibrinogênio, 30uL Trombina e 10uL Cloreto de Cálcio) para ajudar na fixação das células. Os fios de sutura com MSCs aderidas ficaram em meio de cultura durante 24 horas para proliferação celular. As amostras foram analisadas por microscopia confocal de imnunofluorescência e eletrônica de varredura. O experimento animal utilizou ratos Wistar com 10 semanas de vida que foram distribuídos em três grupos: Grupo Controle (GC) que incluiu 5 animais onde a formação da fístula foi através de cirurgia sem nenhum tipo de suporte. Grupo Injeção (GI) que incluiu 8 animais que receberam uma injeção de 106 AT-MSCs ao redor do local de formação da fístula. Grupo Sutura (GS) que incluiu 9 animais que receberam sutura de 4-0 Vicryl (poliglactina) com 106 AT-MSCs aderidas com a ajuda de cola de fibrina. Após a exposição do ceco foi realizada enterotomia de 5mm, sendo então realizada a sutura da abertura a abertura da parede abdominal (superfície interna da pele) com 4 pontos separados com 4-0 Vicryl - Poly J-304 Polyglactin 910. No grupo GS, o fio para confecção da fístula, como descrita acima, continha 106 AT-MSCs aderidas. As fístulas foram fotografadas no dia da cirurgia e no 3°, 6°, 9°, 12°, 15°, 17°, 19° e 21° dias, onde foram anestesiados e sacrificados. O tamanho da área da fístula foi mensurado através do software ImageJ. Foram utilizados dois métodos estatísticos para analisar os dados do modelo animal. O primeiro método foi o Two-way Anova, fazendo a análise comparativa da cicatrização entre os três grupos, e o segundo o One-way analysis of variance, fazendo a análise comparativa da cicatrização entre os três grupos nos dias D0, D12 e D21. As microscopias confocal de imunofluorescência e eletrônica de varredura demonstraram a presença de AT-MSCs aderidas aos fios de sutura. No experimento animal mostrou que a média de redução do tamanho da área da fístula no 21º dia foi de 46,54% no GC, 71,80% no GI e 90,34% no GS (p<0,05), demonstrando que as MSCs foram eficazes na cicatrização das fístulas enterocutâneas tanto no grupo que recebeu a injeção de células quanto no grupo que utilizou as células aderidas ao fio de sutura. As MSCs foram capazes de se fixarem nos fios de sutura. Quando as fístulas enterocutâneas receberam a sutura com MSCs aderidas, elas mostraram uma melhor recuperação e cicatrização da fístula. AT-MSCs aderidas a fios de sutura pode ser uma nova e efetiva forma no tratamento de fístulas enterocutâneas / Abstract: Enterocutaneous fistulas (EF) are difficult to resolve and surgical failure is frequent. Cell therapy could be a new approach in this area. Mesenchymal stem cells (MSCs) have high proliferative capacity, can differentiate into several lineages and have immunomodulatory capacity. Adipocyte tissue (AT) is an easy source of them. Enterocutaneous fistula (EF) treatment with MSCs was yet performed but sometimes, the fistula did not close completely. The aim of this study is to analyze if AT-MSCs could attached in the suture filament in order to be used for EF treatment. AT obtained from lipoaspirate procedure was submitted to collagenase digestion. Cells were cultured in DMEM low glucose medium, with FBS during 3 days. At the 4ª passages, cells were characterized by flow cytometry, confocal microscopy, differentiated to mesodermal lineages to confirm MSCs and telomerase enzyme activity and karyotype analysis. The experiments were performed with polyester suture filament. MSCs, 106 cells, were fixed in the suture filament by adding fibrin glue.Filaments was led in the medium described above during 3 days. Samples were analyzed by confocal and scanning electron microscopy. The animal experiments were performed on 10 weeks old male Wistar rats divided into 3 groups. Control Group (CG): 5 animals undergoing fistula formation alone. Injection Group (IG):8 animals receiving 106 AT-MSCs injected around the suture line. Suture Filament Group (SG): 9 animals in which suture were performed using 4-0 Vicryl with 106 MSCs attached in the filament with fibrin glue. The cecum was accessed through a standard 7mm stab incision on the lower left side of the abdomen. Upon exposure, a 5mm enterotomy was performed and sutured to the abdominal wall in order to produce the fistula. To ensure normal closure of the fistula the opening in the cecum wall was fixed to the internal surface of the skin, without maturation, using four separate 4-0 Vicryl stitches (Poly J-304 Polyglactin 910 Ethicon). The fistulas were photographed on the day of operation and on the 3°, 6°, 9°, 12°, 15°, 17°, 19° and 21° day, in which they were anesthetized and sacrificed. Measure of the size of the fistula was performed using ImageJ software. Statistic comparison between the groups was performed by ANOVA. Confocal and scanning electronic microscopy results demonstrated that the cells were able to attach to the suture filaments. Animal experiments showed that the average size reduction of the fistula area at 21th day was: control group, 46.54%; injected group 71.80% and sutured group 90.34% (p<0,05). MSCs were able to attach to the suture filaments. When the fistulas were sutured with filaments containing MSCs they showed better recovery and healing than the injected and control group. Adipocyte tissue MSCs adhered to suture filament might be a new and effective approach for enterocutaneus fistulas treatment / Mestrado / Fisiopatologia Cirúrgica / Mestre em Ciências