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Estudo funcional da proteína quinase JNK de Schistosoma mansoniatravés de expressão heteróloga no organismo modelo Caenorhabditis elegans

Gava, Sandra Grossi January 2013 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-11-20T18:45:22Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-SandraGrossiGava_Final.pdf: 2345943 bytes, checksum: 542baff1ce20827a286564ee6746784b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-20T18:45:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-SandraGrossiGava_Final.pdf: 2345943 bytes, checksum: 542baff1ce20827a286564ee6746784b (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / A identificação e caracterização dos mecanismos e moléculas envolvidos em sinalização celular são essenciais para o entendimento da biologia parasitária do S. mansoni. Proteína quinases desempenham papel chave em vias de sinalização e tem sido propostas como potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas anti-Schistosoma. Visto que a caracterização funcional em S. mansoni é dificultada por limitações nos métodos de transformação genética deste parasito, o presente estudo propõe o uso de C. elegans como um modelo para a expressão heteróloga de genes de S. mansonique codificam proteínas quinases. Genes que codificam proteína quinases em S. mansoni, homólogos aos identificados em C. elegans, foram selecionados pelo nosso grupo a partir do proteoma do parasito através de uma abordagem filogenômica. Inicialmente, foi selecionada a proteína quinase JNK, que participa da via de sinalização das MAP quinases para a realização das análises experimentais. Em C. elegans, a proteína JNK está relacionada ao aumento de longevidade e da resistência aos estresses térmico e oxidativo. Oligonucleotídeos específicos foram desenhados para amplificar a região promotora do gene em C. elegans bem como as regiões codificantes (CDS) em ambos os organismos. A região promotora foi amplificada a partir do DNA genômico extraído de C. elegans adultos. O RNA total foi extraído de esquistossômulos e C. elegans adultos. As CDS foram amplificadas a partir do cDNA sintetizado e os fragmentos de DNA resultantes foram clonados em E. coliDH5α. As construções obtidas foram digeridas com enzimas de restrição selecionadas de forma a linearizar o vetor contendo a região promotora e recuperar as CDS. Posteriormente, foram realizadas subclonagens através da ligação das CDS de C. elegans e S. mansoni com a construção contendo a região promotora. C. elegans N2 receberam as construções finais através de microinjeção. Foram obtidas três linhagens que expressam Ce_JNK-1, denominadas N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]e N2 Ex03[Ce_jnk-1]e duas linhagens expressando Sm_JNK, denominadas N2 Ex04[Sm_jnk] e N2 Ex05[Sm_jnk]. Os níveis de expressão de Sm_JNK e Ce_JNK-1 nas linhagens transgênicas foram avaliados por RT-PCR quantitativo. Apesar do aumento da expressão de JNK observado nas linhagens transgênicas, não houve aumento na longevidade das mesmas. Embora esta seja a primeira utilização de expressão heteróloga em C. elegans para investigar a função de genes de S. mansoni, esta técnica tem sido utilizada com sucesso para nematóides parasitos e pode tornar-se uma abordagem alternativa para os estudos funcionais em outros parasitos. / The identification and characterization ofmechanisms and molecules involved in cell signaling are essential to the understanding of the S. mansoni parasite’s biology. Protein kinases play key roles in signaling pathways and have been proposed as potential targets for the development of new anti-schistosome drugs. Since functional characterization in S. mansoni is hampered by limitations in methods for genetic transformation in this parasite, the present study proposes to use C. elegans as a model for heterologous expression of S. mansoni genes encoding protein kinases. S. mansoniprotein kinase coding genes orthologous to those identified in C. elegans were selected from the parasite’s proteome by using a phylogenomic approach. Initially, the protein quinase JNK that participates in the MAP kinases signaling pathwaywas selected to perform the experimental analyses. In C. elegans, JNK is related to increased longevity and resistance to oxidative and thermal stress. Specific primers were designed to amplify promoter regions of the JNK gene in C. elegans as well as the protein coding regions (CDS) in both organisms. The promoter region was amplified from the adult nematode’s DNA. Total RNA was extracted from schistosomula and mature C. elegans. CDS were amplified from synthesized cDNA and the resulting DNA fragments were cloned in E. coli DH5α. The construction obtained was digested with restriction enzymes to linearize the vector containing the promoter region and recover the CDS. Subsequently, subcloning was performed by ligation of C. elegansand S. mansoni CDS with the final construct containing the promoter region. C. elegansN2 received the final constructions through microinjections. Weobtained three lineages that expresses Ce_JNK-1, named N2 Ex01[Ce_jnk-1], N2 Ex02[Ce_jnk-1]and N2 Ex03[Ce_jnk-1] and two line ages that express Sm_JNK, named N2 Ex04[Sm_jnk] and N2 Ex05[Sm_jnk]. The expression levels of Ce_JNK-1 and Sm_JNK in transgenic lineages were measured by quantitative RT-PCR. Despite the increased expression of the JNK gene in the transgenic lineages, increased longevity was not observed in these organisms. Although this is the first use of heterologous expression in C. elegans to investigate gene functions in S. mansoni, it has been used successfully for nematode parasites and may become an alternative approach to functional studies in other parasites.
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Monitoramento da inserção do patrimônio genético de Biomphalaria tenagophila do Taim (RS), linhagem resistente ao Schistosoma mansoni, após a sua introdução em uma área endêmica para esquistossomose no Município de Bananal/SP, com transmissão mantida por B. tenagophila

Marques, Daisymara Priscila de Almeida January 2012 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-09-11T16:58:58Z No. of bitstreams: 1 Dissertação FINAL 08 09 12.pdf: 2298162 bytes, checksum: 6e2f996852589f87fd2d6180f0571f3e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-11T16:58:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação FINAL 08 09 12.pdf: 2298162 bytes, checksum: 6e2f996852589f87fd2d6180f0571f3e (MD5) / FIOCRUZ, FUNDEP, CNPq, CAPES / O córrego Herivelton Martins foi escolhido para dar continuidade aos estudos com a introdução da linhagem Biomphalaria tenagophila do Taim/RS, resistente ao Schistosoma mansoni, em coleções hídricas do Município de Bananal/SP, iniciados em 2008. Oitocentos exemplares B. tenagophila adultos da linhagem Taim/RS foram marcados e introduzidos. Pelo método de marcação da concha foi estimada a densidade populacional da linhagem introduzida em relação à local. Após 15 dias da introdução 37,5% dos caramujos coletados estavam marcados. Após 4, 11 e 14 meses da introdução, caramujos jovens (≤ 5 mm de diâmetro) foram coletados e submetidos a técnica de PCR_RFLP para identificação do marcador molecular de 350pb, típico da linhagem do Taim e com caráter dominante. A proporção do marcador molecular nestes caramujos foi 37,1%, 35,7 e 60% respectivamente. Foram realizados três testes de infecção com a cepa SJ de S. mansoni com os descendentes F1 de caramujos coletados nos diferentes períodos após a introdução. Os sobreviventes foram submetidos à técnica de PCR_RFLP para verificar se havia alguma correlação entre a resistência e a presença do marcador de 350pb. No primeiro desafio com o S. mansoni 38,6% dos exemplares provenientes dos caramujos locais, coletados antes da introdução, estavam positivos, bem como 14,9% dos descendentes coletados após 4 meses da introdução. A análise molecular realizada com os caramujos positivos para S. mansoni, oriundos de exemplares pós-introdução, demonstraram que apenas 10% apresentaram o marcador de 350 pb, sendo que este marcador estava presente em 60,8% dos caramujos negativos. No segundo desafio, os descendentes de caramujos coletados antes, após 4 e 11 meses da introdução apresentaram taxas de infecção de 25%, 4,1%, 17%, respectivamente. Os caramujos positivos para S. mansoni não apresentaram o marcador molecular. A percentagem do marcador molecular nos caramujos negativos, coletados após 4 e 11 meses da introdução, foi de 66,6% e 56,2%, respectivamente. No terceiro desafio, as taxas de infecção dos descendentes foram de 26,5% antes da introdução, 6,8% após 11 meses e 2,1% após 14 meses. A análise molecular dos descendentes neste desafio está em andamento. Os dados apontam para uma significativa diminuição da suscetibilidade dos caramujos coletados após a intervenção. O marcador molecular de 350pb típico da linhagem do Taim foi detectado em proporções muito maiores nos caramujos negativos. Os resultados parciais obtidos permitem a inferência que o patrimônio genético da linhagem resistente B. tenagophila do Taim está sendo transmitido com êxito aos descendentes após intervenção tendo como consequência uma maior resistência à infecção por S. mansoni. / The stream Herivelton Martins was chosen to continue the studies on introduction of Biomphalaria tenagophila from Taim/RS, resistant to Schistosoma mansoni, in hydric collections of Bananal/SP, initiated in 2008. Eight hundred adult specimens of B. tenagophila belonging to the lineage of Taim/RS were labeled and introduced. The populational density of the introduced lineage in relation to the local one was estimated using the labeling method of the shell. Fifteen days post-introduction, 37.5% of the collected snails were labeled. After 4, 11 and 14 months of the introduction, juvenile snails (≤ 5 mm diameter) were collected and submitted to PCR-RFLP technique for identification of the molecular marker 350 pb, typical of the Taim lineage and with dominant character. The proportions of the molecular marker in these snails were 37.1%, 35.7% and 60%, respectively. Three infection tests were carried out with the SJ strain of S. mansoni, using the descendants F1 of the snails collected on different periods after introduction. The surviving snails were submitted to the PCR-RFLP technique, in order to verify if there was any correlation between resistance and the presence of the marker 350 pb. In the first challenge with S. mansoni, 38.6% of the specimens belonging to the local population, and collected before introduction, were found to be positive, as well as 14.9% of the offsprings collected 4 months post-introduction. The molecular analysis performed with positive snails to S. mansoni, related to specimens after introduction, demonstrated that only 10% presented the molecular marker 350 pb, and this marker was present in 60.8% of the negative snails. In the second challenge, the offsprings of the snails collected before or 4 and 11 months post-introduction presented infection rates of 25%, 4.1% and 17%, respectively. The positive snails for S. mansoni did not present the molecular marker. The proportions of the molecular marker in the negative snails, collected 4 and 11 months after introduction, were 66.6% and 56.2%, respectively. In the third challenge, the infection rates of the descendants were 26.5% before introduction, 6.8% after 11 months and 2.1% after 14 months. The molecular analysis of the descendants related to this challenge is in progress. Data point out to a significant decrease in the susceptibility of the snails collected after intervention. The molecular marker 350 pb, typical of the Taim lineage, was detected in higher proportions in the negative snails. The partial results obtained allow to infer that the genetic heritage of the resistant B. tenagophila strain from Taim is being successfully transmitted to the descendants after intervention, showing as a result a higher resistance to S. mansoni infection.
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Cultivo primário e caracterização de células derivadas de diferentes tecidos de Biomphalaria tenagophila (Orbigny, 1835)

Silva Neto, Aristeu January 2012 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-07T16:25:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Aristeu.pdf: 6273421 bytes, checksum: b5f821ad263486462653b244d6c6ecbb (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-07T16:25:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Aristeu.pdf: 6273421 bytes, checksum: b5f821ad263486462653b244d6c6ecbb (MD5) / Schistosoma mansoni, agente etiológico causador da esquistossomose no Brasil, necessita de passagem obrigatória em moluscos do gênero Biomphalaria como hospedeiros intermedíarios, para fechamento do ciclo da doença. Os mecanismos envolvidos na relação parasito-hospedeiro ainda não foram completamente elucidados e culturas celulares tem-se mostrado úteis para responder questões específicas. Dessa forma, nosso estudo teve como objetivo o estabelecimento de culturas celulares de diferentes tecidos de Biomphalaria tenagophila Taim, linhagem completamente resistente ao S. mansoni. Todos os tecidos selecionados estão suposta ou comprovadamente envolvidos no sistema interno de defesa desses moluscos. As culturas foram mantidas em dois meios distintos e a viabilidade celular foi avaliada nos dois casos. As células cultivadas foram caracterizadas através de microscopia óptica invertida e microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Foram obtidas, com sucesso, culturas celulares em dez dos doze tecidos dissecados a partir da B. tenagophila. Sob microscopia ótica, a maioria das células apresentou formato esférico, sem aderência, sem pseudópodes ou filapódios. Através da microscopia eletrônica de transmissão identificamos dez subtipos celulares na cultura do manto e quinze na cultura de porção sacular e tubular do túbulo renal. Nas culturas de glândula digestiva e piloro identificamos seis tipos celulares, além de cinco originadas de glândulas nidamental e prostática, quatro de ovotesti e papo, e três de glândula de albúmen. Em quatro dessas culturas (manto, ovotesti, porção renal e sacular) analisamos a complexidade celular e o perfil de açúcares de membrana através de citometria de fluxo com conjugados lectina-Alexa Fluor 488, em busca de marcadores específicos para tipos celulares. Com exceção de WGA (wheat germ agglutinin), que se ligou a todos os tipos celulares estudados, todas as outras lectinas podem ser consideradas potenciais marcadores de tipos celulares. Estudos mais detalhados estão em andamento visando a seleção das lectinas mais adequadas como marcadores de tipos celulares nesse modelo experimental de culturas celulares de Biomphalaria. / Schistosoma mansoni, the etiological agent for schistosomiasis in Brazil, has an obligatory passage through Biomphalaria snails as intermediate hosts to complete the disease cycle. The mechanisms involved in the interaction mollusk-parasite have not been totally clarified yet and cell culture models appear as potential tools to help clarify specific issues. With that in mind, we devoted our study to develop primary cell cultures from different tissues of Biomphalaria tenagophila belonging to Taim strain, which is completely resistant to S. mansoni infection. Those tissues were selected based on their known or putative importance to the internal defense system of the mollusk. The cultures were maintained at two different media and cell viability was evaluated for each condition. The cells in culture were characterized by optical inverted and transmission electronic microscopy. Primary cultures from ten out of twelve tissues of B. tenagophila were successfully obtained. Most of the cell subsets were round, mostly non-adherent, without pseudopodia or filapodia by optical microscopy. Under electronic microscopy we identified ten cell subsets in mantle culture and fifteen cell subsets in both saccular and tubular kidney sections. In digestive gland and pylorus six differents cell subsets could be identified against five cell subsets in nidamental and prostatic gland, four in ovotestis and crop and three in albumen gland. Cell complexity and membrane sugar patterns of four different tissue-derived cultures (mantle, ovotesti, saccular and tubular kidney) were also analyzed by flow cytometry using different Alexa Fluor 488-lectin conjugates looking for subset-specific markers. Besides WGA (wheat germ agglutinin), which was found to bind to all kinds of mollusk cells, all the other lectins tested could be considered potential subset markers. Further studies are in progress to select the most suitable lectin to be used as subset marker in those cell culture-based experimental model for Biomphalaria.
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Desenvolvimento e padronização de novas metodologias aplicadas ao diagnóstico e monitoração de cura da esquistossomose mansoni na fase inicial (aguda) e crônica

Queiroz, Rafaella Fortini Grenfell e January 2012 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-07T16:58:40Z No. of bitstreams: 1 4. Tese Final RQ3Banca1.pdf: 2857998 bytes, checksum: 113972bf6018f1468776705c406f2b79 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-07T16:58:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4. Tese Final RQ3Banca1.pdf: 2857998 bytes, checksum: 113972bf6018f1468776705c406f2b79 (MD5) / Neste projeto, foram testados diferentes antígenos candidatos a padronização de novos métodos diagnósticos a serem usados nas diferentes fases da infecção esquistossomótica. Inicialmente, foram analisados os antígenos brutos do parasito visto que seu baixo custo e simplicidade de obtenção merecem novas abordagens. Assim, antígenos de vermes adultos, ovos e tegumento de esquistossômulos foram analisados com soro de pacientes submetidos a rigoroso diagnóstico parasitológico para determinação de infecção e/ou diagnóstico clínico e imunológico. Ao serem aplicados no método indireto de ELISA, estes antígenos apresentaram alta sensibilidade e especificidade em fases distintas da infecção murina. Através desses resultados foi possível confirmar que o uso de antígenos obtidos de diferentes formas evolutivas do parasito serve como ferramenta potencial para análise da evolução cronológica da infecção. Quando aplicados em amostras humanas, o uso de antígenos de vermes adultos mostrou-se promissor para o diagnóstico de pacientes residentes de áreas endêmicas que apresentavam baixa carga parasitária, com índices de sensibilidade e especificidade de 95%. Tendo sido, nestas condições, superior aos antígenos de ovos. O estudo de pacientes em fase aguda da infecção permitiu a validação da técnica indireta de ELISA com antígenos de tegumento de esquistossômulos. Esta técnica apresentou uma significativa sensibilidade na identificação de grande parte dos pacientes recentemente infectados. A outra abordagem adotada por este tarbalho envolveu o uso do Antígeno Catódico Circulante (CCA), antígeno este secretado/excretado por vermes jovens e adultos, que foram direcionados para o desenvolvimento de novas e promissoras metodologias diagnósticas. Para este propósito, o CCA foi utilizado em diferentes formas antigênicas: como glicoproteína purificada a partir de vermes, como proteína recombinante e como peptídeos imunogênicos de 20 aminoácidos. Estes antígenos foram usados na padronização do Método de Separação Imunomagnética, denominado IMS. O uso de CCA recombinante no método de IMS indireto levou aos índices mais significativos de sensibilidade e especificidade, sem que qualquer resultado falso-negativo fosse detectado. Por outro lado, o uso da glicoproteína CCA purificada demonstrou ser superior no diagnóstico para monitorização de cura. A partir destes resultados, mais promissores que a ELISA convencional, partimos para a padronização final desta técnica para a detecção direta do CCA nas mesmas amostras, de forma a permitir somente a identificação de infecções ativas. Para isto, anticorpos monoclonais específicos para a glicoproteína CCA foram produzidos e conjugados a marcadores. A escolha do clone foi baseada na reduzida especificidade deste pela porção responsável pelas reações cruzadas do CCA, a porção glicídica Lewis x. O novo método IMS para detecção direta demonstrou alta sensibilidade de 94% e especificidade de 100%, apresentando correlação direta com a carga parasitária destes pacientes determinada pela contagem de ovos nas fezes. Os excelentes resultados na detecção de antígeno circulante obtidos no presente trabalho, que contrapõem os obtidos em outros trabalhos publicados, se devem a nova metodologia empregada que utiliza a concentração destes antígenos ao invés da diluição de amostras. Por fim, idealizamos um último método, denominado FluoIMS, destinado a identificação qualitativa da presença de CCA através da microscopia de fluorescência. Este método, de detecção direta e de execução bastante simples, apresentou significativos índices de sensibilidade quando três lâminas individuais para cada amostra foram analisadas. Nossos resultados trazem grandes expectativas para a melhoria do diagnóstico dos muitos pacientes infectados por baixas cargas do Schistosoma mansoni, em diferentes fases da infecção, e apontam novas perspectivas para aplicação destes métodos no controle de cura pós-tratamento. / In this project, various candidate antigens for standardization of new diagnostic methods were tested for use at different phases of schistosome infection. Initially, the crude antigens of the parasite were analyzed, since their low cost and ease of obtaining deserve new approaches. Thus, antigens of adult worms, egg antigens, and tegument antigens of schistosomula were analyzed by means of sera of patients submitted to a rigorous parasitological diagnosis for determination of infection. When applied to the indirect method of ELISA, these antigens presented high sensitivity and specificity levels at different phases of murine infection. Based on these results, it was possible to confirm that the use of antigens obtained at different evolutive phases of the parasite acts as a potential tool for analysis of the chronological evolution of infection. When applied to human samples, the use of adult worm antigens was promising for diagnosis of patients living in endemic areas, and presenting low worm burden, with sensitivity and specificity levels of 95%. Under these conditions, they were considered superior than the egg antigens. The study related to tourists presenting acute phase of infection allowed the validation of the indirect technique of ELISA, with tegument antigens of schistosomula. This technique showed a significant sensitivity for identification of a large part of recently infected patients. Another approach used in this study involved the use of Circulating Cathodic Antigen (CCA), which was secreted/excreted by juvenile and adult worms, that were directed to development of new and promissing diagnostic methodologies. For this purpose, the CCA was used at different forms of antigens: as purified glycoprotein obtained from worms, as recombinant protein and as immunogenic peptides of 20 aminoacids. These antigens were used for standardization of the Immunomagnetic Separation Method, named IMS. The use of recombinant CCA in the indirect method of IMS showed the most significant levels of sensitivity and specificity, and no false-negative results could be detected. On the other hand, the use of purified glycoproteinCCA demonstrated to be superior for diagnosis of cure control. Based on these results, which were more promissing than the conventional ELISA, we started the final standardization of this technique for the direct detection of CCA in the same samples, in order to allow only the identification of active infections. For this purpose, specific monoclonal antibodies for glycoprotein CCA were produced and conjugated to merchandises. The choice of the clone was based on the lack of its specificity by the portion responsible for the cross-reactions of CCA, the glicidic portion Lewis x, and in order that a low level of cross-reactivity could be detected by this method, in future analyses. The new method IMS demonstrated high levels of sensitivity (94%) and specificity (100%), reaching superior levels than the ones showed by the current immunological methods, as well as presenting a direct correlation with those patients´worm burdens, which were obtained by fecal egg counts. The excellent results obtained in the present study regarding the detection of circulating antigen, that did not corroborate the results obtained in other published papers, are due to the new methodology used, that utilizes the concentration of these antigens and not the dilution of samples. Finally, we planned another method, named FluoIMS, for the qualitative identification of the presence of CCA by means of fluorescence microscopy. This method, offering direct detection and ease of execution, showed significant levels of sensitivity, when three individual glass-plates for each sample were analyzed. Our results offer great expectancy for the improvement of diagnosis of infected patients with low Schistosoma mansoni burdens, at different phases of infection, and indicate new perspectives for application of these methods in the post-treatment cure control
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Avaliação de biomarcadores imunológicos associados à terapêutica específica da fase aguda da esquistossomose mansônica humana

Silveira, Amanda Cardoso de Oliveira January 2011 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-24T18:16:29Z No. of bitstreams: 1 Amanda Cardoso de oliveira Silveira.pdf: 1397539 bytes, checksum: f51baa26b4d3bab7cb78cc4c63ea205a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-24T18:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Cardoso de oliveira Silveira.pdf: 1397539 bytes, checksum: f51baa26b4d3bab7cb78cc4c63ea205a (MD5) Previous issue date: 2011 / Nesse estudo foram avaliadas as principais alterações clínico-laboratoriais, ultra-sonográficas e imunofenotípicas induzidas em pacientes portadores da fase aguda da esquistossomose mansoni (AGD-AT) e o impacto que a terapêutica específica com praziquantel teria em um ano (AGD-PT I) e dois anos (AGD-PT II) após o tratamento. Amostras de fezes e sangue periférico dos pacientes foram coletadas para realização do exame parasitológico e hemograma, respectivamente. Posteriormente, os pacientes foram submetidos ao exame ultrasonográfico para avaliar comprometimento hepático e/ou esplênico. Em seguida, foi realizada a determinação dos níveis plasmáticos de IgE total, óxido nítrico (NO), citocinas e quimiocinas. Além disso, foram realizadas avaliações do perfil imunofenotípico de leucócitos circulantes e dosagem de NO, citocinas e quimiocinas em sobrenadantes de cultura de granulócitos do sangue periférico. Os resultados mostraram reduções da concentração de hemoglobina, percentual do hematócrito, número de plaquetas e global de leucócitos no grupo AGD-PT II, com algumas alterações ultra-sonográficas (hepatomegalia e esplenomegalia) persistentes. Em relação às avaliações plasmáticas no grupo AGD-PT II, foi observado redução dos níveis de IgE total quando comparados aos grupos CT, AGD-AT e AGD-PT I, NO em comparação com o grupo AGD-AT, CXCL-8 em comparação com o grupo AGD-AT, GM-CSF em comparação com o grupo AGD-PT I e CCL24 em comparação com o grupo CT. Nos dados referentes à avaliação dos sobrenadantes de cultura de granulócitos do grupo AGD-PT II, frente ao estímulo com SWAP, foi observado redução dos níveis de óxido nítrico quando comparado ao grupo AGD-AT e CXCL-8 em relação ao grupo AGD-PT I. Na avaliação do perfil imunofenotípico do grupo AGD-PT II, os resultados mostraram reduções progressivas nos números absolutos das moléculas CD28, CD80, CD86, CD23, CD25, HLADR, CD69, CD64, CD18, CD44, CD54, CCR2 e CCR3 em eosinófilos, CD80, CD86, CD11 e CCR2 em neutrófilos e número absoluto de linfócitos TCD3+ e suas subpopulações CD4+ e CD8+, bem como os marcadores CD28 e CD18 em comparação ao grupo AGD-PT I. Com base nos achados desse estudo sugere-se que dois anos após terapêutica específica com praziquantel, a grande maioria das alterações observadas nos pacientes portadores da forma clínica aguda da esquistossomose, antes e persistentes um ano após o tratamento, tenham sido normalizadas, sugerindo que o tratamento pode promover, a longo prazo, a reversibilidade das alterações imunofenotípicas das principais populações celulares envolvidas no contexto da infecção esquistossomótica aguda. / In this study was evaluated the main clinical/laboratory, ultrasonographic and immunophenotypic features in patients with the acute phase of schistosomiasis mansoni (ACT-BT) and the impact of the specific therapeutic with praziquantel about these parameters one year (ACT-AT I) and two years (ACT-AT II) after specific therapeutic. Peripheral blood and feces of patients were collected to perform blood and parasitological examinations, respectively. Subsequently, the patients were evaluated by ultrasound to assess hepatic/splenic commitment. Afterwards, we evaluated the plasmatic levels of total IgE, nitric oxide (NO), cytokines and chemokines. Moreover, we evaluated ex vivo immunophenotypic features from circulating leucocytes, and the levels of NO, cytokines and chemokines in supernatant of culture from circulating granulocytes. The results showed a reduction in the concentration of hemoglobin, percentage of hematocrit, number of platelets and total leucocytes as well as ultrasonographic alterations (hepatomegaly and splenomegaly) in the ACT-AT II group. The plasmatic analysis from ACT-AT II revealed a decreased levels of total IgE as compared to CT, ACT-BT and ACT-AT I groups, NO as compared to ACT-BT group, CXCL-8 as compared to ACT-BT group, GM-CSF as compared to ACT-AT I group and CCL24 as compared to CT group. Regarding the analysis in the supernatant culture of granulocytes from ACT-AT II, in the presence of SWAP, there was a reduction in NO levels as compared to ACT-BT as well as in CXCL-8 as compared to ACT-AT I. The immunophenotypic profile from ACT-AT II group showed progressive decrease in the absolute number of CD28, CD80, CD86, CD23, CD25, HLA-DR, CD69, CD64, CD18, CD44, CD54, CCR2 and CCR3 in eosinophils, CD80, CD86, CD11 and CCR2 in neutrophils and CD3+, CD4+, CD8+ and CD28 and CD18 markers in T lymphocytes as compared to ACT-AT I. In summary, the findings of this study suggest that after two years post-treatment specific with Praziquantel, the majority of alterations observed in acute patients of schistosomiasis, before and those persistents after one year post-treatment, returned to the normal levels, suggesting that chemotherapy can promote, a long time, the reversibility of the immunological alterations in the main cell populations involved in the context of acute schistosomiasis infection.
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Estudo do sistema inato de defesa de Biomphalaria tenagophila (d’Orbigny, 1835) frente ao Schistosoma mansoni Sambon, 1907

Mattos, Ana Carolina Alves de January 2011 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T10:42:23Z No. of bitstreams: 1 MATTOS, Ana Carolina.pdf: 1283545 bytes, checksum: a4b542c6c88309cd3a7cec32cb5e787f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T10:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MATTOS, Ana Carolina.pdf: 1283545 bytes, checksum: a4b542c6c88309cd3a7cec32cb5e787f (MD5) Previous issue date: 2011 / A fenoloxidase (PO) é uma enzima envolvida no processo de melanização. A melanização é um mecanismo de defesa contra patógenos, muito importante para diversos invertebrados, inclusive, alguns artigos já descreveram a existência dessa enzima em Biomphalaria glabrata. Utilizando B. tenagophila (linhagem resistente Taim e linhagem susceptível Cabo Frio), tentou-se esclarecer, por meio de experimentos “in vivo” e “in vitro”, a real importância desse sistema enzimático no processo de resistência da Biomphalaria ao S. mansoni. Verificou-se que, apesar do sistema fenoloxidase apresentar, em alguns experimentos, uma atividade significativamente maior, principalmente na linhagem Taim, na presença do S. mansoni, não foi possível afirmar que esse sistema tem importância no mecanismo de resistência da B. tenagophila Taim contra S. mansoni, pois a ativação enzimática ocorreu em todas as linhagens testadas. Quando os testes da atividade enzimática foram realizados, utilizando Echistosoma paraensei (trematódeo, digenea), que infecta a linhagem Taim, os resultados foram semelhantes. Outro aspecto estudado neste trabalho foi a resposta do sistema interno de defesa (SID - hemócitos, fração solúvel e hemolinfa total) da B. glabrata e B. tenagophila (Taim e Cabo Frio), frente aos esporocistos secundários, obtidos de caramujos B. glabrata infectadas. Já foi descrito na literatura o processo de mascaramento/mimetismo molecular como mecanismo de evasão do parasito. Assim, utilizando os esporocistos secundários, foi possível demonstrar que os esporocistos primários são mais afetados pelo SID da Biomphalaria (principalmente Taim) do que os esporocistos secundários. Os esporocistos primários apresentaram maior mortalidade e danos no tegumento do que os esporocistos secundários. No entanto, a inoculação dos esporocistos secundários, provenientes de B. glabrata, obteve sucesso apenas na espécie análoga, resultando na eliminação de cercárias, trinta dias após a inoculação. O mesmo não ocorreu nas linhagen de B. tenagophila Taim e Cabo Frio. Dessa forma, o mimetismo/mascaramento molecular é um mecanismo possível, porém experimentos utilizando esporocistos secundários provenientes da B. tenagophila são necessários para verificar a real importância desse processo como mecanismo de escape do parasito em relação a B. tenagophila Taim. / Phenoloxidase (PO) is an enzyme involved in the process of melanization, which is a defense mechanism against pathogens, being very important for different invertebrates. Several articles have described the presence of this enzyme in Biomphalaria glabrata. Using B. tenagophila (resistant Taim and susceptible Cabo Frio) lineages to Schistosoma mansoni), we carried out “in vivo” and “in vitro” experiments aimed at clarifying the real importance of this enzymatic system in the process of Biomphalaria resistance to S. mansoni. It was observed in some experiments that the phenoloxydase system presented a significantly higher activity, mainly in Taim lineage in the presence of S. mansoni, but it was not possible to confirm whether this system exerts some importance in the resistance mechanism of B. tenagophila Taim against S. mansoni, since the enzymatic activity has occurred in all the lineages tested. When the enzymatic activity was tested using Echistosoma paraensi (Trematode, Digenea), which infects the Taim lineage, the results obtained were very similar. Another aspect investigated in the present work was the response of the internal defense system (IDS – hemocytes, soluble fraction, and total hemolymph) of B. glabrata and B. tenagophila (Taim and Cabo Frio) in the presence of secondary sporocysts derived from infected B. glabrata snails. The process of molecular masking/mimetism as evasion mechanism of the parasite has been described in the literature. Thus, using secondary sporocysts, it was possible to demonstrate that primary sporocysts are more affected by IDS of Biomphalaria (mainly of Taim), presenting higher mortality rate and tegumental damages than the secondary ones. Nevertheless, inoculation of secondary sporocysts derived from B. glabrata was successful only in the analogue species, showing as a result elimination of cercariae thirty days post-inoculation. The same result did not occur with B. tenagophila Taim and Cabo Frio. In this way, the molecular masking/mimetism may be considered a possible mechanism, however, further experiments using secondary sporocysts derived from B. tenagophila are needed in order to verify the real importance of this process as the parasite´s scape mechanism in relation to B. tenagophila Taim.
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Estudo da resistência do Schistosoma mansoni Sambon, 1907 ao praziquantel

Couto, Flávia Fernanda Bubula January 2014 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-15T18:38:01Z No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-15T18:38:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-15T18:38:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T18:38:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_DIP_FlaviaFernandaBubulaCouto.pdf: 1019436 bytes, checksum: 5193b8188e8f866ddd717bb135bc3fee (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Atualmente, a droga utilizada no tratamento da esquistossomose é o praziquantel (PZQ). Alguns casos de isolados de S. mansoni resistentes ao PZQ no campo e em laboratório já foram relatados. Estes relatos refletem uma parcela ínfima do problema real, devido às dificuldades para a comprovação dessa resistência em condições de laboratório. Recentemente, nosso grupo conseguiu induzir resistência, em laboratório, a uma cepa de S. mansoni, utilizando sucessivos tratamentos com PZQ em B. glabrata infectadas com o S. mansoni (cepa LE-PZQ). Diante disso, este trabalho teve como objetivo geral avaliar a resistência/ suscetibilidade da cepa LEPZQ ao longo de seu desenvolvimento no hospedeiro vertebrado bem como avaliar a ação do PZQ em cercárias sensíveis e resistentes ao PZQ a fim obter um teste rápido para detecção de resistência e, por fim, estudar o envolvimento das proteínas SMDR2, SmMRP1 e SmMVP na resistência do S. mansoni ao PZQ. Para isso, camundongos infectados com a cepa LE-PZQ ou com a cepa suscetível (LE) foram tratados com PZQ após 2, 6, 16, 23 e 45 dias de infecção. Os resultados mostraram maior recuperação de vermes da cepa resistente tratadas com PZQ após 16 e 23 dias de infecção em comparação com a cepa LE. Outro objetivo do nosso estudo foi avaliar a perda da cauda de cercárias LE e LE-PZQ após 1 e 2 horas de contato com o PZQ em diferentes concentrações. Cercárias LE-PZQ apresentaram uma perda da cauda estatisticamente menor após exposição nas diferentes concentrações de PZQ por 1 ou 2 horas. Artigos sobre resistência à multidrogas (MDR) têm sido importantes para estudo de resistência em diversos organismos. Por isso, investigamos os níveis de RNA de SMDR2 e SMRP1 por qRT-PCR. SMDR2 mostrou níveis maiores em fêmeas quando comparados com machos e vermes em pares na cepa LE. Na cepa LE-PZQ, vermes fêmeas apresentaram níveis maiores quando comparados apenas com vermes machos. Quando comparadas as duas cepas, a resistente apresentou níveis estatisticamente maiores em machos, fêmeas e vermes em pares. SmMRP1 demonstrou expressão significativamente maior em machos e machos e fêmeas nas duas cepas quando comparados com fêmeas. Na comparação entre a cepa sensível e a resistente, a LE-PZQ apresentou maiores níveis de expressão em machos e vermes em pares. Investigamos também os níveis de RNA e proteínas de SmMVP. Foi possível observar que SmMVP está diferencialmente expressa entre machos, fêmeas e vermes em pares quando comparados entre si em cada cepa e quando compara-se cepa sensível e resistente. / Currently, the drug of choice in schistosomiasis treatment is Praziquantel (PZQ). Some cases of S. mansoni resistant strains to PZQ in field and laboratory have been already reported. These cases reports reflect a small parcel of the real problem due to the difficulty to prove this resistance in laboratory conditions. Recently, our group induced resistance in a S. mansoni strain using successive PZQ treatments in B. glabrata infected, under laboratory conditions (LE-PZQ strain). Thus, this work aimed to evaluate the resistance/ susceptibility of the LE-PZQ strain during its development in the vertebrate host as well as to evaluate the PZQ action in susceptible and resistant cercarie in order to obtain a rapid test to detect resistance, and lastly to study the involvement of SMDR, SmMRP1 and SmMVP proteins in the S. mansoni resistance to PZQ. For that, mice were infected with LE-PZQ strain or susceptible strain (LE) and treated with PZQ after 2, 6, 16, 23 and 45 days of infection. The results showed a bigger worm recovery when it was treated after 16 and 23 days of the infection when compared with susceptible strain. We also aimed to evaluate tail loss of LE and LE-PZQ cercarie after exposure to PZQ for 1 or 2 hours in different concentrations. LE-PZQ cercarie showed a statistically smaller tail loss after PZQ exposure in all concentrations for 1 or 2 hours. Works about multidrug resistance (MDR) have been important to studies of resistance in several organisms. Therefore, we investigated levels of RNA for SMDR2, SmMRP1 and SmMVP using RT-PCR. Females showed high levels of expression when compared to males and paired worms in the LE strain. In the LE-PZQ strain, female worms showed high levels of expression only when compared to male worms. When compared both strains, the resistant showed high levels of expression in males, females and paired worms. SmMRP1 showed upregulated in males and paired worms in both strains when compared to females. In the susceptible and resistant strain comparison, LE-PZQ strain showed high levels of expression in male and paired worms. We investigated also RNA and proteins levels for SmMVP. It was possible to observe that SmMVP was found differentially expressed in adult males and females from the susceptible strain.
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Avaliação da resposta imunológica e mecanismos efetores associados à proteção induzida pela preparação antigênica do tegumento do esquistossômulo do Schistosoma mansoni.

Melo, Tatiane Teixeira January 2014 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:41:55Z No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:42:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-17T14:42:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:42:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_TatianeTeixeiradeMelo.pdf: 3978043 bytes, checksum: 1a0b6aa00d756ed3ab737751773db659 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Segundo a Organização Mundial da Saúde (WHO), atualmente 200 milhões de pessoas estão infectadas por espécies do gênero Schistosoma, uma vacina, administrada sozinha ou em combinação com drogas anti-helmínticas, seria importante para o controle da esquistossomose. Recentemente, nosso grupo demonstrou que uma preparação do tegumento de esquistossômulo do S. mansoni (Smteg) é capaz de elicitar uma diminuição estatisticamente significativa na carga parasitária quando formulado com adjuvante de Freund. Neste trabalho nós avaliamos a imunoproteção induzida em camundongos pelo Smteg sem adjuvante ou Smteg associado ao Alum ou Alum + CpG. Na ausência de adjuvante não houve diminuição estatisticamente significativa da carga parasitária. Apesar disso, o Smteg foi capaz de ativar a resposta imune produzindo níveis significativos de anticorpos específicos, aumentando a porcentagem de células TCD4+IFN-γ+ e de células TCD4+IL-10+ no baço e aumentando a produção das citocinas IFN-γ e IL-10 pelas células esplênicas e IL-10 por células dendríticas,. Ao contrário, a associação Smteg/alum/CpG-ODN foi capaz de induzir uma redução parcial na carga parasitária (43,1%) além de uma reduzir significativamente o número de ovos eliminados nas fezes. Esta resposta protetora foi associada com um perfil predominantemente do tipo Th1, com o aumento na produção de IgG2c, IFN-γ e TNF-α. O papel dos anticorpos na eliminação do parasito em animais imunizados com o Smteg também foi avaliado, e demonstramos que anticorpos específicos estão envolvidos na eliminação do parasito. Uma vez observada a importância dos anticorpos na imunidade protetora, realizamos análises proteômicas e sorológicas pela técnica de Western-blotting bidimensional (2D-WB) para identificar candidatos vacinais. Uma das proteínas identificadas, a ciclofilina do S. mansoni (SmCyp), foi utilizada como antígeno em um protocolo de imunização gênica, porém não observamos redução significativa da carga parasitária e do número de ovos nas fezes e no intestino e fígado de camundongos imunizados, apesar da imunização diminuir significativamente a área dos granulomas hepáticos em animais imunizados. Nossos resultados demonstram a importância do tegumento do esquistossômulo do S. mansoni como fonte de antígenos vacinais para a esquistossomose mansoni; a importância dos anticorpos na eliminação do parasito e identifica proteínas candidatas a serem utilizadas em formulações vacinais, abrindo novas possibilidades de estudos avaliando as mesmas em diferentes formulações e estratégias vacinais em ensaios pré-clinicos / According to the World Health Organization (WHO), currently 200 million people are infected by Schistosoma species, the vaccine, administered alone or in association with antihelminthic drugs, would be important to control schistosomiasis. Recently, our group demonstrated that the schistosomula tegument preparation from S. mansoni (Smteg) is able to induce a significant reduction in worm burden when formulated to Freund adjuvant. In this work we evaluated the protection induced by Smteg without adjuvant or Smteg with Alum or Alum + CpG. Without adjuvant any significant reduction in parasite burden was observed. However, Smteg immunization activate immune response inducing significant production of specific antibody; increased percentage of TCD4+IFN-γ+ and TCD4+IL-10+ cells in spleen and increased production of IFN-γ and IL-10 cytokines by spleen cell and IL-10 by dendritic cells. On the other hand Smteg/alum/CpG-ODN formulation was able to induce partial reduction in worm burden (43.1%) and also a significant reduction in the number of eggs eliminated in the feces. This protective response was associated with a predominant Th1 type of immune response, with increased production of specific IgG2c, IFN-γ and TNF-α. The role of antibodies in the elimination of parasites in animals immunized with Smteg was also evaluated and we have demonstrated that specific antibodies are involved in the elimination of the parasite. Once we have observed the importance of antibodies in protective immunity, we performed proteomic and serological analyzes by two-dimensional Western blotting (WB 2D) technique to identify vaccine candidates. One of the identified proteins, the S. mansoni cyclophilin (SmCyp), was used as antigen in a genetic immunization protocol, although no significant reduction in parasite burden and the number of eggs in the feces and intestine and liver of immunized mice was observed, immunization significantly decrease the area of hepatic granulomas in immunized animals. Our results demonstrate the importance of S. mansoni schistosomula tegument as a source of vaccine targets for schistosomiasis; the importance of antibodies in parasite elimination and also identify proteins to be used in vaccine formulations, opening new studies possibilities in the evaluation of these candidates in different formulations and vaccination strategies in preclinical trials.
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Caracterização da maquinaria de processamento de miRNAs e piRNAs em Biomphalaria glabrata e o efeito da infecção por Schistosoma mansoni no processo

Queiroz, Fábio Ribeiro January 2015 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T17:41:26Z No. of bitstreams: 1 Fábio Ribeiro Queiroz - Caracterização da maquinaria de processamento de miRNAs e piRNAs em Biomphalaria glabrata e o efeito da infecção por Schistosoma mansoni no processo - 2015.pdf: 3625694 bytes, checksum: fa248ee7f88a52b2c4f2165fa5d9b5e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T17:41:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Fábio Ribeiro Queiroz - Caracterização da maquinaria de processamento de miRNAs e piRNAs em Biomphalaria glabrata e o efeito da infecção por Schistosoma mansoni no processo - 2015.pdf: 3625694 bytes, checksum: fa248ee7f88a52b2c4f2165fa5d9b5e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-06-18T17:41:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Fábio Ribeiro Queiroz - Caracterização da maquinaria de processamento de miRNAs e piRNAs em Biomphalaria glabrata e o efeito da infecção por Schistosoma mansoni no processo - 2015.pdf: 3625694 bytes, checksum: fa248ee7f88a52b2c4f2165fa5d9b5e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-18T17:41:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fábio Ribeiro Queiroz - Caracterização da maquinaria de processamento de miRNAs e piRNAs em Biomphalaria glabrata e o efeito da infecção por Schistosoma mansoni no processo - 2015.pdf: 3625694 bytes, checksum: fa248ee7f88a52b2c4f2165fa5d9b5e4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / A Organização Mundial de Saúde estima que cerca de 240 milhões de pessoas, em 78 países, necessitam de tratamento para esquistossomose, uma doença crônica causada por trematódeos do gênero Schistosoma. No Brasil, o Schistosoma mansoni é o único representante deste gênero, cuja passagem pelo hospedeiro invertebrado, caramujos do gênero Biomphalaria, é obrigatória antes de infectar um hospedeiro mamífero, entre eles o homem. A interação parasito-hospedeiro invertebrado é complexa, podendo o grau de susceptibilidade do caramujo à infecção variar desde extremamente permissivo até completamente resistente. Com o genoma e transcriptoma de B. glabrata disponíveis, o estudo de genes relacionados à regulação da expressão gênica, principalmente aqueles responsáveis pela maquinaria de processamento de miRNAs e piRNAs poderão auxiliar no entendimento da biologia do vetor B. glabrata bem como sua relação como o parasito S. mansoni. Alguns aspectos da interação parasito-hospedeiro invertebrado continuam pouco explorados, incluindo a participação dos pequenos RNAs não codificadores de proteínas como miRNAs, siRNAs e piRNAs. Utilizando ferramentas de bioinformática e PCR quantitativa, buscamos identificar e caracterizar a maquinaria de processamento de miRNAs e piRNAs em B. glabrata. Nosso trabalho demonstra que a maquinaria necessária para o processamento destas moléculas está ativa em B. glabrata com expressão gênica diferencial dos genes Argonauta, Drosha, Piwi, Exportina 5 e Tudor em diferentes estágios de desenvolvimento do animal bem como durante a infecção pelo S. mansoni. As análises de bioinformática utilizadas nesse trabalho mostraram a alta conservação dos genes envolvidos na maquinaria de miRNAs e piRNAs utilizando análise e distribuição de domínios conservados, análise de resíduos do sítio catalítico bem como análise filogenética. Estes dados sugerem que a maquinaria de silenciamento mediada por miRNAs e piRNAs interferem na biologia do caramujo durante todo o seu ciclo de vida, além de contribuir, de maneira ainda indefinida, na relação B. glabrata/S. mansoni. Estudos mais detalhados necessitarão ser realizados para confirmar a participação das preditas proteínas da via de miRNAs e piRNAs na relação parasito/hospedeiro, principalmente sua participação efetiva em seus genes alvos, uma vez que o parasito S. mansoni não possui expressa a via de piRNAs em seu genoma / The World Health Organization (WHO) estimates that about 240 million people in 78 countries require treatment for schistosomiasis, a chronic disease caused by trematodes of the genus Schistosoma. In Brazil, the Schistosoma mansoni is the only representative specie, whose passage through the invertebrate host, snails of the genus Biomphalaria, is mandatory before infecting a mammalian host, including humans. The interaction between the invertebrate host and the parasite is complex and the degree of susceptibility of the snail to infection ranges from extremely permissive to completely resistant. With the genome and transcriptome of B. glabrata available, the study of genes related to the regulation of gene expression, particularly those responsible for miRNAs and piRNAs processing machinery may assist in vector biology understanding B. glabrata well as its relation to the parasite Schistosoma mansoni. Some aspects of this interaction are still poorly explored, including the participation of small RNAs not protein-coding as miRNAs, siRNAs and piRNAs. Using bioinformatics tools and quantitative PCR, we seek to identify and characterize the processing machinery of miRNAs and piRNAs in B. glabrata. Our work shows that the protein machinery required for processing these molecules are active at the level of gene transcription in B. glabrata with a differential expression of the genes Argonauta, Drosha, Piwi, Exportin 5 and Tudor in different developmental stages and also during infection with S. mansoni. The bioinformatics analysis used in this study showed the high conservation of genes involved in miRNAs and piRNAs machinery using analysis and distribution of conserved domains, the catalytic site residue analysis and phylogenetic analysis. These data suggest that the silencing machinery mediated by miRNAs and piRNAs interfere in the snail biology throughout its life cycle, and contribute, even indefinitely, in relation B. glabrata/S. mansoni. More detailed studies need to be performed to confirm the participation of the predicted proteins of miRNAs and piRNAs pathway in the parasite/host relationship, mainly their effective participation in their target genes, since the parasite S. mansoni has not expressed the piRNAs pathway in its genome.
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Avaliação da imunoproteção induzida pelas proteínas recombinantes Sm29 e Sm22.6 de Schistosoma mansoni em camundongos primoinfectados e tratados

Alves, Clarice Carvalho January 2015 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-23T13:09:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_ClariceCarvalhoAlves.pdf: 3366605 bytes, checksum: 500faa250a99b7c383180d2bec4de2e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-23T13:09:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_ClariceCarvalhoAlves.pdf: 3366605 bytes, checksum: 500faa250a99b7c383180d2bec4de2e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-23T13:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_ClariceCarvalhoAlves.pdf: 3366605 bytes, checksum: 500faa250a99b7c383180d2bec4de2e8 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brazil / O desenvolvimento de uma vacina para a esquistossomose, juntamente com a quimioterapia, seria de grande impacto para o controle e eliminação da doença. Nesse sentido, vários antígenos do parasito já foram testados a fim de avaliar a capacidade dos mesmos em induzirem proteção contra a infecção pelo Schistosoma mansoni. Porém, apesar de alguns antígenos apresentarem bons resultados na proteção contra a infecção, esses nunca foram testados em modelos experimentais previamente expostos a antígenos do parasito. No caso da esquistossomose, isso seria importante já que os moradores de áreas endêmicas, população alvo de uma vacina para a doença, passam por repetidas infecções ao longo de suas vidas. Diante dessa necessidade, duas proteínas de tegumento de Schistosoma mansoni, Sm22.6 e Sm29, merecem destaque já que têm sido associadas à resistência à infecção e reinfeção em moradores de áreas endêmicas, e por terem induzido proteção parcial em ensaios envolvendo a imunização de camundongos C57BL/6 naïve. Portanto, este trabalho objetivou avaliar a habilidade das proteínas recombinantes, Sm22.6 e Sm29, em induzirem proteção em animais BALB/c que já tenham sido previamente infectados e tratados. Nós também avaliamos a capacidade das proteínas Sm22.6r e Sm29r em induzirem proteção em camundongos BALB/c naïve, já que nos trabalhos anteriores essas foram testadas em animais da linhagem C57BL/6. Nossos resultados demonstraram que, diferentemente dos trabalhos anteriores, a imunização de animais BALB/c naïve com Sm22.6r ou Sm29r não foi capaz de induzir proteção. Apesar disso, através de um ensaio de imunofluorescência, foi possível observar que os anticorpos produzidos, em resposta à imunização com Sm22.6r ou Sm29r, foram capazes de reconhecer a forma nativa dessas proteínas, na superfície do parasito. A imunização de animais, infectados e tratados, com Sm22.6r+Freund, embora tenha desencadeado uma resposta imune robusta, também não foi capaz de conferir imunidade protetora. Por outro lado, camundongos, infectados/tratados, imunizados com Sm29r+Freund apresentaram significativa redução da carga parasitária (proteção de 26%-48%) após três doses da vacina. Esta formulação vacinal induziu uma produção significativa das citocinas IL-2, IFN-γ, IL-17 e IL-4; uma resposta humoral vigorosa com produção de IgG, IgG1, IgG2a e IgE específicos; e um aumento significativo no percentual de células TCD4+ de memória central. Os adjuvantes Alum e MPL também foram formulados juntamente com a Sm29r. Os resultados demonstraram que somente a formulação vacinal Sm29r+Alum foi capaz de conferir proteção (29%-37%), desencadeando uma produção significativa de IL-2, IL-17 e IL-10, e um aumento do percentual de células TCD4+ produtoras de IFN-γ. Além disso, esses animais apresentaram níveis significativos de anticorpos específicos IgG, IgG1, IgG2a e IgE e um aumento significativo no percentual de células B de memória. Nossos resultados confirmam o papel imunoprotetor da proteína Sm29r, reforçando seu potencial como candidata vacinal. / The development of a vaccine against schistosomiasis together with chemotherapy would have a great impact in the disease control and elimination. In this sense, several parasite antigens have been tested in order to assess its ability to induce protection against Schistosoma mansoni infection. Despite the great results observed after mice immunization with those antigens, they have never been tested in mice previously exposed to the parasite antigens. In the case of schistosomiasis, this is an important assessment to be done, since the residents of endemic areas, target population of a schistosomiasis vaccine, are exposed to several infections through life. In this context, two parasite tegument proteins, Sm22.6 and Sm29, are promising candidates, that have been associated with resistance to infection and reinfection in individuals living in endemic areas, and also induce partial protection against schistosomiasis in immunization trials using C57BL/6 naïve mice. Therefore, this work aimed to evaluate Sm22.6r and Sm29r ability to induce protection in BALB/c mice previously infected with S. mansoni and treated with Praziquantel. We also evaluated the Sm22.6r and Sm29r ability to induce protection in BALB/c naïve mice, since, previous studies were performed in C57BL/6 strain. Unlike previous works, our results showed that neither immunization with Sm29r nor immunization with Sm22.6r induced reduction in parasite burden in BALB/c naïve mice. Nevertheless, an immunofluorescence staining assay demonstrated that antibodies produced in response to mice immunization with rSm22.6 or rSm29 were able to recognize the native proteins in the parasite surface. In infected and treated mice, the immunization with Sm22.6r plus Freund failed to induce protection, despite the robust immune response observed. In the other hand, infected and treated mice, immunized with Sm29r+Freund, presented a significant reduction in parasite burden (26%- 48% of protection). This immunization trial induced a significant production of IL-2, IFN-γ, IL-17 and IL-4 cytokines; a vigorous humoral response with a production of increased levels of specific IgG, IgG1, IgG2a and IgE antibodies; and a significant increase in the percentage of TCD4+ memory cells. Sm29r were also formulated with Alum and MPL adjuvants. The results of trials using these formulations demonstrated that only Sm29r+Alum vaccine formulation was able to confer protection (29%-37%), inducing a significant production of IL-2, IL-17 and IL-10 cytokines, and an increase in the percentage of TCD4+ IFN-γ + cells. Moreover, these animals produced higher levels of specific IgG, IgG1, IgG2a and IgE, and a significant increase in the percentage of B memory cells. Our results demonstrated that Sm29r retains its ability to induce protection in previously infected/treated mice, reinforcing its potential as a vaccine candidate.

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