Orientador: Marcelo Menossi Teixeira, Andréa Akemi Hoshino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T07:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mattos_RaphaeldeSouza_M.pdf: 5526068 bytes, checksum: 090cb9f141a5a7dd324df049c18bf9c1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A cana-de-açúcar é uma das mais importantes espécies vegetais cultiváveis do mundo, sendo o Brasil o principal produtor. É uma fonte eficiente e de baixo custo para a obtenção de açúcar e etanol, que é considerado o mais promissor substituto do petróleo como fonte de energia a médio prazo, especialmente nos transportes. A seca é um dos principais estresses que reduzem a produtividade da cana e a produção de variedades tolerantes não só representa ganhos econômicos como contribui para a sustentabilidade dos canaviais. Embora a base genética da tolerância à seca ainda seja pouco conhecida, variedades desenvolvidas em programas de melhoramento tem apresentado progresso, apesar do ritmo ser mais lento que o desejado. Genômica funcional e desenvolvimento de marcadores colaboram aumentando a eficiência do melhoramento tradicional, mas ainda existem elementos do genoma que podem ser aproveitados de novas formas. Foram descobertos recentemente genes de função regulatória chamados microRNAs (miRNA) que também desempenham um papel na adaptação de plantas a diferentes estresses. Utilizando ESTs de cana-de-açúcar, sequenciamento de nova geração e microarranjos para avaliar a expressão de miRNAs sobre estresse hídrico foram descobertos novos miRNAs associados à seca e possíveis genes de miRNAs ligados à tolerância a este tipo de estresse / Abstract: Sugarcane (Saccharum spp.) is amongst the most relevant crops in the world and Brazil is the most prominent producer. It is an inexpensive and efficient source for commodities such as sugar and ethanol, the latter being increasingly considered the most promising immediate energy source substitute for oil, mainly in transportation. Apart from being very productive, it is largely affected by stress-related yield losses, notably from abiotic triggers. Drought stress is determinant for every crop field, and this is true for sugarcane as well. Although the molecular basis drought stress tolerance lacks further elucidation, newly developed cultivars have successfully reduced yield loss due to water shortage, albeit not at the desirable pace. Functional genomics and molecular markers development assist new cultivar selection programs by identifying and locating agronomically relevant alleles and QTL's, but there are other elements in the genome which can provide new ways to approach crop field improvement. The recently discovered microRNAs (miRNA) are regulatory genes found to have an important role in plants adaptation under different kinds of stresses. By using sugarcane ESTs, deep-sequencing and microarray technology to access stress induced miRNA expression, we have found novel sugarcane miRNA participating in the drought stress response and identified possible tolerance related miRNA genes / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Zanoni Dias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:27:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baudet_Christian_M.pdf: 13612079 bytes, checksum: 648d18039dc13dcd5a2f422cc7863666 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O sequenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tag) [2] e uma tecnica que trabalha com bibliotecas de cDNAs tendo como objetivo a obtençao de uma boa aproximaçao para o ?ndice genico, que e a listagem de genes existentes no genoma do organismo estudado. Antes da serem analisadas, as sequencias obtidas do sequenciamento dos ESTs devem ser processadas para eliminaçao de artefatos. Artefatos sao trechos que nao pertencem ao organismo ou que possuem baixa qualidade ou baixa complexidade. Trechos de vetores, adaptadores e caudas poli-A podem ser citados como exemplos de artefatos. A eliminaçao dos artefatos deve ser feita para que a an'alise das sequencias produzidas no projeto nao seja prejudicada por estes ?ru?dos?. Por exemplo, artefatos presentes em sequencias freq¨uentemente produzem erros em processos de clusterizaçao, pois eles podem determinar se sequencias serao unidas em um mesmo cluster ou separadas em clusters diferentes. Observando a importancia da realizaçao de um bom processo de limpeza das sequencias, o trabalho desenvolvido nesta dissertaçao teve como principal objetivo a obtençao de um conjunto eficiente de procedimentos de detecçao e remoçao de artefatos. Este conjunto foi produzido a partir de uma nova estrategia de deteçao de artefatos. Normalmente, cada projeto de seq¨uenciamento possui seu proprio conjunto de procedimentos dividido em varias etapas. Estas etapas sao, em geral, ligadas entre si e o resultado de uma pode influenciar o resultado de outra. A nossa estrategia visa a realizaçao destas etapas de forma totalmente independente. Alem da avaliaçao desta nova estrategia, o trabalho tambem realizou um estudo mais detalhado sobre dois tipos de artefatos: baixa qualidade e derrapagem. Para cada um deles, algoritmos foram propostos e validados atraves de testes com conjuntos de seq¨u?encias produzidas em projetos reais de sequenciamento. O conjunto final de procedimentos, baseado nos estudos desenvolvidos durante a escrita deste texto, foi testado com as sequencias do projeto SUCEST [100, 103, 113] e mostrou bons resultados. O clustering produzido com as sequencias processadas por nossos metodos apresentou melhores consistencia interna e externa e menores taxas de redundancia quando comparado ao clustering original do projeto / Abstract: Expressed Sequence Tag (EST) Sequencing [2] is one technique that works with cDNA libraries. It aims to achieve a good approximation for the gene index of an organism. Before analyzing the sequences obtained by sequencing ESTs, they must be processed for artifact removal. An artifact is a sequence that does not belong to the studied organism or that has low quality or low complexity. As example of artifacts, we have adapters, poly- A tails, vectors, etc. Artifacts removal must be performed because their presence can produce ?noises? in the sequencing project data analysis. For example, artifact can join two sequences in a same cluster inappropriately or separate them in two different clusters when they should be put together. Motivated by the sequence cleaning process importance, our main objective in this work was to develop an efficient set of procedures to detect and to remove sequence artifacts. Usually, each EST sequencing project has its own procedure set divided in many steps. These steps are, in general, linked and the result of one given step might influence the result of the next one. Our strategy was to perform each step independently assuring that any execution order of those steps would lead to the same result. Additionally to the new strategy evaluation, this work also studied detailedly two type of artifacts: low quality and slippage. For each one, algorithms were proposed and validated through tests with sequences of real sequencing projects. The final set of procedure, developed in this work, was evaluated using the sequences of the SUCEST project [100, 103, 113] and produced good results. The resulting clustering from our method has better external and internal consistency and lower redundacy rate than those produced by the SUCEST project clustering / Mestrado / Ciência da Computação / Mestre em Ciência da Computação

A hemocromatose hereditária é caracterizada pelo aumento da absorção intestinal de ferro, acarretando progressivo acúmulo no organismo. Os objetivos foram: 1- determinar as frequências das mutações p.C282Y, p.H63D e p.S65C no gene HFE e avaliar os efeitos nas concentrações dos parâmetros do ferro em doadores de sangue; 2- pesquisar mutações nos genes: 2.1- HFE, 2.2- HJV e HAMP, 2.3- TFR2 e SLC40A1, em pacientes portadores de sobrecarga de ferro primária. Participaram 542 doadores de sangue provenientes do Hemocentro da Santa Casa de São Paulo. Foram incluídos 51 pacientes que apresentavam saturação de transferrina ≥ 50% (para mulheres) e ≥ 60% (para homens) e ausência de causas secundárias. Os genótipos para as mutações nos genes HFE foram avaliados pela PCR-RFLP. Foi realizado sequenciamento direto bidirecional para cada éxon dos genes, utilizando o sequenciador Genetic Analizer 3500XL®. Nos doadores de sangue, as frequências dos alelos HFE 282Y, HFE 63D e HFE 65C foram 2,1, 13,6 e 0,6%, respectivamente. Os homens que doaram pela primeira vez, portadores do genótipo HFE 282CY, apresentaram maiores valores de saturação de transferrina; e também os portadores dos genótipos HFE 63DD e 63HD apresentaram maiores concentrações de ferritina sérica, em relação aos de genótipo selvagem. Para os pacientes, 72,5% (37/51) apresentaram ao menos 1 alteração no gene HFE e 11 foram identificados como homozigotos para a mutação p.C282Y. Uma mutação não descrita na literatura (p.V256I) foi identificada no gene HFE e a modelagem molecular (análises de ligação e estrutural) detectou que a mutação não reduziu a afinidade entre as proteínas HFE e β2-microglobulina. No sequenciamento dos éxons dos genes HJV e HAMP foram identificadas as alterações já descritas: HJV p.E302K, HJV p.A310G, HJV p.G320V e HAMP p.R59G. Para o gene TFR2, foram identificados 3 polimorfismos já descritos (p.A75V, p.A617A e p.R752H). No gene SLC40A1 foram observados 6 polimorfismos (rs13008848, rs11568351, rs11568345, rs11568344, rs2304704 e rs11568346) e 1 alteração não descrita previamente na literatura (p.G204S). As conclusões foram: 1- em relação aos doadores de sangue, a presença dos alelos HFE 282Y e HFE 63D foi associada ao maior aporte de ferro nos homens que não doaram sangue anteriormente. 2.1- Para os pacientes com sobrecarga de ferro, a mutação p.C282Y em homozigose, ou em heterozigose composta com a p.H63D, foi a mais frequente alteração encontrada (33,3%). 2.2- O diagnóstico molecular de hemocromatose juvenil (HJ) no Brasil (HJV p.G320V em homozigose) foi relatado. As mutações funcionais HJV p.E302K e HAMP p.R59G foram identificadas, sendo possível que estas alterações possam estar contribuindo para consequências fenotípicas juntas as outras mutações em regiões intrônicas ou regulatórias dos genes. 2.3- Mutações funcionais nos genes TFR2 e SLC40A1 não foram identificadas. / Hereditary hemochromatosis (HH) is characterized by increased intestinal iron absorption, which leads to a progressive accumulation of iron in the body. The aims were: 1- to assess the frequency of HFE gene mutations (p.C282Y, p.H63D and p.S65C) and to identify their relationship to iron status in blood donors; 2- to search in primary iron overload patients: 2.1- HFE, 2.2- HJV and HAMP, 2.3- TFR2 and SLC40A1 gene mutations. Blood donors (n=542) were recruited from Hemocentro of Santa Casa Hospital, Sao Paulo, Brazil. The study included 51 patients with transferrin saturation ≥ 50% (women) and ≥ 60% (men) and absence of secondary causes. The genotypes for HFE mutations were evaluated by PCR-RFLP. Subsequent bidirectional sequencing for each gene was performed using the Genetic Analizer sequencer 3500XL®. The frequencies of HFE 282Y, HFE 63D and HFE 65C alleles were 2.1, 13.6 and 0.6% in blood donors, respectively. The first time male donors carrying heterozygous genotype for the p.C282Y mutation had higher transferrin saturation values; and men carrying HFE 63DD and 63HD genotypes had higher serum ferritin concentrations when compared to the wild genotype. Thirtyseven (72.5%) out of the 51 patients presented at least one HFE mutation and 11 were identified as homozygous for the mutation p.C282Y. One novel mutation (p.V256I) in the HFE gene was indentified and molecular modeling (free energy and structural analysis in silico) showed that p.V256I mutation did not reduce the affinity binding between HFE and β2-microglobulin. Sequencing in the HJV and HAMP genes revealed HJV p.E302K, HJV p.A310G, HJV p.G320V and HAMP p.R59G alterations. Sequencing in the TFR2 gene observed 3 polymorphisms (p.A75V, p.A617A e p.R752H); and sequencing in the SLC40A1 gene identified 6 polymorphisms (rs13008848, rs11568351, rs11568345, rs11568344, rs2304704 e rs11568346) and 1 p.G204S non-described mutation. The conclusions were: 1- for blood donors, the presence of HFE 282Y and HFE 63D alleles were associated with alterations on iron status only in first time male blood donors. 2.1- For patients with iron overload, the p.C282Y mutation in homozygous or in compound heterozygous with p.H63D, was the most frequent molecular change found (33.3%). 2.2- The molecular diagnosis of Juvenil Hemochromatosis (JH) in Brazil (homozygous genotype for the HJV p.G320V) was reported. The HJV p.E302K and HAMP p.R59G functional mutations were found and, it is conceivable that they may be contributing to phenotypic consequences together to other mutations in intronic or regulatory regions. 2.3- Functional mutation in the TFR2 and SLC40A1 genes were not identified.

A terapia antiagregante é comumente indicada na prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares. A dupla antiagregação com clopidrogrel e ácido acetilsalicílico (AAS) tem sido frequentemente adotada em pacientes com Doença Arterial Coronariana (DAC), mas apresenta ineficácia em uma parcela significativa da população com genótipo de respondedores. Essa falha terapêutica nos leva a questionar se outros mecanismos moleculares podem estar influenciando na resposta a esses fármacos. Recentes estudos sugerem que pequenas sequências de RNA não codificantes denominadas microRNAs (miRNAs) podem estar fortemente relacionadas com resposta ao tratamento fármaco-terapêutico, controlando as proteínas envolvidas na farmacocinética e farmacodinâmica. Entretanto, os principais miRNAs que atuam na dinâmica da resposta medicamentosa ainda não foram bem definidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de miRNAs no sangue total periférico, procurando melhor esclarecer os mecanismos envolvidos na resposta aos antiagregantes plaquetários AAS e clopidogrel. Para isso, selecionou-se pacientes com DAC, os quais apresentavam diferentes respostas à dupla terapia de antiagregação determinadas pelo teste de agregação plaquetária. Baseados nos fenótipos, os perfis de expressão de miRNAs foram comparados entre os valores da taxa de agregação categorizados em tercis (T) de resposta. O grupo T1 foi constituído de pacientes respondedores, o T2 de respondedores intermediários e o T3 de não respondedores. Os perfis de miRNAs foram obtidos após sequenciamento de última geração e os dados obtidos foram analisados pelo pacote Deseq2. Os resultados mostraram 18 miRNAs diferentemente expressos entre os dois tercis extremos. Dentre esses miRNAs, 10 deles apresentaram importantes alvos relacionados com vias de ativação e agregação plaquetária quando analisados pelo software Ingenuity®. Dos 10 miRNAs, 4 deles, os quais apresentaram-se menos expressos no sequenciamento, demonstraram os mesmos perfis de expressão quando analisados pela reação em cadeia pela polimerase quantitativa (qPCR): hsa-miR-423-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR- 30a-5p e hsa-let-7g-5p. A partir das análises de predição de alvos, pôde-se observar que os quatro miRNAs, quando menos expressos simultaneamente, predizem ativação da agregação plaquetária. Além disso, os miRNAs hsa-miR- 423-5p, hsa-miR-744-5p e hsa-let-7g-5p mostraram correlação com o perfil lipídico dos pacientes que, por sua vez, apresentou influência nos valores de agregação compreendidos no T3 de resposta a ambos os medicamentos. Sendo assim, conclui-se que maiores taxas de agregação plaquetária podem estar indiretamente relacionadas com os padrões de expressão de hsa-miR- 423-3p, hsa-miR-744-5p e hsa-let-7g-5p. Sugere-se que a avaliação do perfil de expressão destes 3 miRNAs no sangue periférico de pacientes com DAC possa predizer resposta terapêutica inadequada ao AAS e ao clopidogrel / The antiplatelet therapy is often indicated for the prevention and treatment of cardiovascular diseases. Dual antiplatelet therapy with clopidogrel and acetylsalicylic acid (ASA) has often been adopted in patients with coronary artery disease (CAD), but it has been ineffective in a significant portion of the population with genotype of responders. This fact leads us to question whether other molecular mechanisms may be influencing the response to these drugs. Recent studies suggest that small non-coding RNA sequences known as microRNAs (miRNAs) may be closely related to response to drug-therapeutic treatment, controlling proteins involved in pharmacokinetics and pharmacodynamics. The aim of this study was to evaluate the profile of miRNAs in whole blood, looking to better clarify mechanisms involved in ASA and clopidogrel response. For this purpose, we selected CAD patients who showed different responses to dual antiplatelet therapy determined by aggregation test. Based on the phenotypes, the miRNA expression profiles were compared between the platelet aggregation values categorized into tertiles (T) of response. The T1 group consisted of responding patients, the T2 consisted of intermediate responders and the T3 consisted of non-responders. The miRNA profiles were obtained after next-generation sequencing and data were analyzed by Deseq2 package. Results showed that 18 miRNAs were differentially expressed between the two extreme tertiles. By Ingenuity® software prediction analysis, 10 miRNAs showed important targets related with activation and aggregation of blood platelets. Of the 10 miRNAs, 4 of them, which were down-expressed on sequencing, showed the same fold-regulation when expression profiles were analyzed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR): hsa-miR-423-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-30a-5p and has-hsa- let-7g-5p. By target prediction analysis, it was observed that, when the four miRNAs are simultaneously down-expressed, they predict activation of platelet aggregation. Furthermore, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-744-5p, and hsa-let-7g-5p showed correlation with the lipid profile of patients which, in turn, demonstrated influence in aggregation values reaching T3 of response to both drugs. Therefore, we concluded that increased platelet aggregation rates may be indirectly related to the expression profiles of hsa-miR-423-3p, hsa-miR-744-5p and hsa-let-7g-5p. It is suggested that the evaluation of the expression profile of these three miRNAs in the peripheral blood of patients with CAD may predict inadequate therapeutic response to aspirin and clopidogrel.

A tuberculose (TB) embora passível de tratamento efetivo, ainda é um grave problema de saúde pública em diversos países, inclusive no Brasil. Nas últimas décadas houve progressos consistentes no controle da doença, porém o avanço da resistência bacilar ainda é um desafio a ser superado, já que os mecanismos da resistência são bastante complexos e não totalmente conhecidos, o que dificulta o desenvolvimento de testes de sensibilidade com elevada acurácia. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as mutações gênicas de cepas de Mycobacterium tuberculosis de pacientes do Brasil e de Moçambique com doença resistente a drogas através do sequenciamento genômico total, além de descrever padrões de mutações obtidos por testes moleculares comerciais e comparar estes dados com resultados de testes fenotípicos. Estudo descritivo e transversal que incluiu 30 isolados (17 do Brasil e 13 de Moçambique), submetidos aos testes moleculares comerciais Genotype MTBDRplus®, Genotype MTBDRsl®, Xpert MTB/RIF® e teste fenotípico BACTEC MGIT 960 SIRE®. Todos os isolados também foram avaliados pelo sequenciamento genômico realizado pelo Illumina MiSeq Sequencing System® e submetidos a análise de mutações que conferem resistência às drogas contra TB utilizando o TB profiler online tool. A sensibilidade e especificidade do sequenciamento genômico para detecção de resistência a rifampicina foi de 87,5% e 92,3%, respectivamente. Além disso, o sequenciamento detectou a mutação (Val170Phe) no gene rpoB em dois isolados de M. tuberculosis de Moçambique. Esta mutação não é detectada pelos testes genotípicos comerciais. A sensibilidade do sequenciamento para a isoniazida foi de 95,6% e a especificidade de 100%. Para a estreptomicina, a sensibilidade foi de 85,7% e a especificidade de 93,3%. Para o etambutol, observamos sensibilidade de 100% e especificidade de 77,2%. As mutações mais frequentes associadas à resistência à rifampicina foram a Ser450Leu e a His445Tyr no gene rpoB. Em relação à isoniazida, predominou a mutação Ser315Thr no gene katG. O sequenciamento genômico, dado seu alto poder discriminatório, tem grande potencial de fornecer informações mais acuradas sobre mecanismo gênicos da resistência bacilar, possibilitando futuramente o aprimoramento de testes diagnósticos mais precisos. / Although there is an effective treatment for tuberculosis (TB), it is still a serious public health problem in several countries, including Brazil. In the last decades, there has been consistent progress in disease control, but the increasing number of disease caused by resistant strains is still a challenge to be overcome, since the mechanisms of resistance are quite complex and not fully known, which difficult the development of susceptibility tests with high accuracy. The aim of this work was to characterize gene mutations of Mycobacterium tuberculosis strains from Brazilian and Mozambican patients with drug-resistant disease through whole genome sequencing, as well as to describe patterns of mutations obtained by commercial molecular tests and to compare these data with results of phenotypic susceptibility tests. It was a cross-sectional study that included 30 isolates (17 from Brazil and 13 from Mozambique). Commercial molecular tests Genotype MTBDRplus(TM), Genotype MTBDRsl(TM), Xpert MTB / RIF(TM) and BACTEC MGIT 960 SIRE(TM) phenotypic test were performed for all isolates. All of them were also evaluated by whole genome sequencing performed by the Illumina MiSeq Sequencing System(TM) and submitted to analysis of mutations that confer drug resistance against TB using the TB profiler online tool. The sensitivity and specificity of whole genome sequencing for detection rifampicin resistance was 87.5% and 92.3%, respectively. Also, whole genome sequencing detected the mutation (Val170Phe) in the rpoB gene in two isolates of M. tuberculosis from Mozambique. This mutation is not detected by commercial genotypic tests. The sensitivity of the whole genome sequencing for isoniazid was 95.6%, and the specificity was 100%. For streptomycin, the sensitivity was 85.7%, and the specificity was 93.3%. For ethambutol, we observed a sensitivity of 100% and specificity of 77.2%. The most frequent mutations associated with rifampicin resistance were rpoB Ser450Leu and His445Tyr. About isoniazid, the katG Ser315Thr mutation was the most frequent. Whole genome sequencing, given its high discriminatory power, has great potential to provide more accurate information about the gene mechanisms of bacilli resistance, making possible the improvement of more accurate diagnostic tests in the future.

O presente estudo realizou o sequenciamento de nova geração do vírus da hepatite C genótipo 1, incluindo os subtipos 1a (n=51) e 1b (n=49), e identificou variantes associadas com resistência (RAV) aos antivirais de ação direta em pacientes sem tratamento prévio. No subtipo 1a, foram encontradas RAV para as regiões NS3-4A, NS5A e NS5B em 10%, 22% e 8% dos pacientes, respectivamente. RAV detectadas foram: T54S (2%), V55A (2%), Q80K (4%) e R155K (2%) na protease NS3-4A; Q30H (4%), H58P (10%) e Q30H/R+Y93C/H/N (8%) na região NS5A; e A421V (8%) na polimerase NS5B. As frequências das RAV para o subtipo 1b foram 12%, 53% e 31% para as regiões NS3-4A, NS5A e NS5B, respectivamente. Foram encontradas as RAV F43I (2%), T54S (4%), Q80H (2%), D168E (2%) e M175L (2%) na região NS3-4A; L28M (2%), R30Q (2%), L31M (2%), Q54H (27%), A92T (2%), Y93H (4%), Q54H+A92T (6%), Q54H+Y93H (6%) e A92T+Y93H (2%) na região NS5A e, L159F (2%), C316N (4%), A421V (7%), L159F+C316N (9%) e S556G (9%) na polimerase. Utilizando esta metodologia, um recombinante inter-subtipo 1a/1b foi identificado. / This study performed the next-generation sequencing of the hepatitis C virus genotype 1, including subtypes 1a (n = 51) and 1b (n = 49), and identified resistance-associated variants (RAVs) to direct-acting antivirals in previously untreated patients. In subtype 1a, RAVs were found for NS3-4A, NS5A, and NS5B regions in 10%, 22% and 8% of patients, respectively. RAVs detected were: T54S (2%), V55A (2%), Q80K (4%) and R155K (2%) in NS3-4A protease; Q30H (4%), H58P (10%) and Q30H/R+Y93C/H/N (8%) in NS5A region; and A421V (8%) in NS5B polymerase. Frequencies of RAV for subtype 1b were 12%, 53% and 31% for NS3-4A, NS5A and NS5B regions, respectively. RAVs F43I (2%), T54S (4%), Q80H (2%), D168E (2%) and M175L (2%) were found in NS3-4a region; L28M (2%), R30Q (2%), L31M (2%), Q54H (27%), A92T (2%), Y93H (4%), Q54H+A92T (6%), Q54H+Y93H (6%) and A92T+Y93H (2%) in NS5A region and, L159F (2%), C316N (4%), A421V (7%), L159F+C316N (9%) and S556G (9%) in polymerase. By using this methodology, a recombinant inter-subtype 1a/1b was identified.

A cor da pele, olhos e cabelos são alguns dos traços fenotípicos mais aparentes quando nos referimos à identificação de características individuais. Essas características frequentemente são utilizadas na descrição de indivíduos em retratos falados usados em investigações policiais. Porém, em muitos casos as vítimas ou testemunhas não reconhecem o agressor, tornando inviável a produção desses retratos. Contudo, os vestígios biológicos deixados pelo criminoso poderiam ser utilizados na predição de suas características físicas, suprindo a falta ou complementando o retrato falado. Para que isso seja possível, é preciso conhecer as variáveis responsáveis pela formação desses fenótipos. No caso dos fenótipos de pigmentação há tanto um fator genético, quanto ambiental. Diversos genes participam da formação desses fenótipos, dentre eles está o gene MITF (Melanogenesis-associated transcription factor), um dos principais regulador da biossíntese de melanina nos melanócitos. Esse gene está fortemente associado às síndromes de Waadenburg e Tietz, as quais causam pigmentação anormal, principalmente na pele, e ao melanoma. No entanto, apesar do claro envolvimento do gene MITF na melanogênese, ainda não são conhecidas associações significativas de polimorfismos nesse gene com fenótipos de pigmentação. À vista disso, esse trabalho avaliou a relação da variabilidade do gene MITF com os fenótipos de pigmentação encontrados em uma amostra populacional do estado de São Paulo, por meio de sequenciamento de nova geração. Foram identificados 133 pontos de variação em toda a extensão do gene e sua região promotora, dos quais 21 estão associadas a pelo menos um fenótipo de pigmentação de pele, olhos ou cabelo. Adicionalmente foram encontradas associações com ao menos um fenótipo de pigmentação para 3 dos 17 haplótipos da região promotora, 7 dos 50 haplótipos da extensão que engloba a região 5UTR e codificante, e um dos 18 haplótipos encontrados na região 3UTR. Considerando os haplótipos encontrados para a extensão total do gene MITF e sua promotora, 20 dos 132 haplótipos encontrados estão associados a algum fenótipo de pigmentação. A maior parte das associações encontradas, tanto para alelos e genótipos quanto para haplótipos, são referentes a fenótipos mais escuros como cabelos castanhos escuros e pretos e pele escura. Associações com fenótipos mais claros, tais como olhos azuis e verdes e cabelos loiros e ruivos, também foram encontradas, porém envolvendo variantes e haplótipos de frequência baixa na população amostrada; tais associações, entretanto, representam achados falsos positivos. Os resultados confirmam a hipótese de que a variabilidade do gene MITF pode contribuir para a formação dos fenótipos de pigmentação de pele, olhos e cabelos dos indivíduos da população brasileira / Skin, eye and hair colors are some of the most noticeable phenotypes when referring to the identification of individual characteristics. These characteristics are often used to describe individuals in police sketches used in investigations. However, in many cases the victims or witnesses are unable to recognize the assaulter, making this sketches unfeasible. Nonetheless, biological traces left by the assaulter could be used to predict their physical characteristics, compensating or complementing these sketches. To make this possible, its necessary to know the variables responsible for the development of these traits. Pigmentation phenotype development relies on genetic and environmental aspects. A variety of genes contribute to the development of these phenotypes, among them MITF (Melanogenesis-associated transcription factor), one of the main regulators of melanin synthesis in melanocytes. This gene is strongly associated with Waardenburg and Tietz syndrome, which cause abnormal pigmentation, mostly in skin, and melanoma. Although MITFs clear involvement in melanogenesis, significant associations between this genes polymorphisms and pigmentation phenotypes are still unknown. Thus, this study evaluated the relation between MITF genetic variability and pigmentation phenotypes found in a population sample from the state of São Paulo, through next generation sequencing. There were identified 133 variation points through the whole gene and its promoter, from which 21 were associated with at least one skin, eye or hair pigmentation phenotype. Additionally, 3 of the 17 promoter haplotypes, 7 of the 50 haplotypes comprising the 5UTR and coding regions and one of the 18 3UTR haplotypes were associated with at least one pigmentation phenotype. Considering the haplotypes found for the whole gene and its promoter, 20 of the 132 haplotypes found were associated with at least one phenotype. The majority of the associations found for alleles, genotypes and haplotypes were related to darker phenotypes, like dark brown and black hair and dark skin. Associations with lighter phenotypes, like blue and green eyes and blonde and red hair, were also found, although involving variants and haplotypes with low frequencies in the studied population; these associations, however, represent false positives. The results corroborate the hypothesis that the MITF variability can contribute to the formation of pigmentation phenotypes in skin, eye and hair in the Brazilian population

O dengue vírus é o responsável por uma das mais importantes doenças transmitidas por vetores em todo o mundo, causando cerca de 390 milhões de infecções anualmente em mais de 100 países. Estima-se que mais de 3,51 bilhões de pessoas (40% da população mundial) estejam vivendo em regiões de risco. A distribuição geográfica dos tipos de dengue aumentou drasticamente nas últimas décadas, impulsionada pela expansão de sua principal espécie de vetor, o Aedes aegypti, o crescimento da população humana, as viagens, o comércio internacional e a crescente urbanização nos trópicos e subtrópicos. Objetivos: Realizar a caracterização molecular do genoma completo do vírus da DENGUE; Avaliar tendências evolutivas que possam estar ocorrendo na epidemia brasileira, comparando nossos achados com os pré-existentes na literatura; Métodos: Amostras de doadores e receptores de sangue coletadas entre 15 de fevereiro a 15 de junho de 2012 em bancos de sangue e hospitais nas cidades de Recife, PE e Rio de Janeiro, RJ. Foi realizado o genoma viral de 90 amostras e posteriormente foram realizadas analises de filodinâmica viral e modelo matemático para estimar dados epidemiológicos. Resultados: As análises filogenéticas indicam que o surto foi causado pelo dengue vírus 4 genótipo II, embora dois isolados do genótipo I também tenham sido detectados pela primeira vez no Rio de Janeiro. A análise evolutiva e as estimativas de modelagem são congruentes, indicando um número reprodutivo acima de 1 entre janeiro e junho, com pelo menos dois terços das infecções sendo despercebidas. A análise de modelos sugere que a transmissão viral começou no início de janeiro, o que é consistente com múltiplas introduções, muito provavelmente dos estados do norte do Brasil, e com um aumento simultâneo de viagens aéreas dentro do país para o Rio de Janeiro. Discussão: O sistema nacional de vigilância notificou 213.000 casos de dengue no RJ e PE em 2012, por outro lado, inferimos pelo menos um número 3,4 vezes maior de infecções de dengue, de acordo com as estimativas anteriores com base em dados sorológicos. Modelos baseados na temperatura e pesquisas entomológicas mostraram que a região amazônica do Brasil é altamente adequada para a transmissão do DENV durante todo o ano. A explicação mais parcimoniosa para a ausência de casos notificados em centros urbanos estudados até 2012. O Rio de Janeiro recebe consistentemente novas linhagens de DENV mostrando ser improvável que as cadeias de transmissão dentro deste estado sejam sustentadas em várias estações do ano e, portanto, necessitarão de reintrodução da origem. Conclusão: A combinação de dados genéticos e epidemiológicos de doadores de sangue pode ser útil para antecipar a disseminação epidêmica de arbovírus. / Dengue virus is responsible for one of the most important vector-borne diseases in the world, causing about 390 million infections annually in more than 100 countries. It is estimated that more than 3.51 billion people (40% of the world\'s population) are living in regions at risk. The geographic distribution of dengue types has increased dramatically in recent decades, driven by the expansion of its major vector species, Aedes aegypti, human population growth, travel, international trade and increasing urbanization in the tropics and subtropics. Objectives: To carry out the molecular characterization of the complete genome of the DENGUE virus; Evaluate evolutionary trends that may be occurring in the Brazilian epidemic, comparing our findings with those in the literature; Methods: Samples of donors and blood recipients collected between February 15 and June 15, 2012 in blood banks and hospitals in the cities of Recife, PE and Rio de Janeiro, RJ. A viral genome of 90 samples was performed and phylodynamics and mathematical models were analyzed to estimate epidemiological data. Results: Phylogenetic analyzes indicated that the outbreak was caused by dengue virus 4 genotype II, although two genotype I isolates were also detected for the first time in Rio de Janeiro. Evolutionary analysis and modeling estimates are congruent, indicating a reproductive number above 1 between January and June, with at least two-thirds of the infections being unnoticed. Model analysis suggests that viral transmission began in early January, consistent with multiple introductions, most likely from the northern states of Brazil, and with a simultaneous increase in air travel within the country to Rio de Janeiro. Discussion: The national surveillance system reported 213,000 dengue cases in RJ and PE in 2012, on the other hand, we inferred at least a 3.4 times higher number of dengue infections, according to previous estimates based on serological data. Temperature based models and entomological surveys have shown that the Amazon region of Brazil is highly suitable for DENV transmission throughout the year. The most parsimonious explanation for the absence of reported cases in urban centers studied by 2012. Rio de Janeiro consistently receives new DENV lineages showing that it is unlikely that the transmission chains within this state will be sustained at various seasons of the year and therefore will require reintroduction of origin. Conclusion: The combination of genetic and epidemiological data from blood donors may be useful in anticipating the epidemic spread of arboviruses

A cultura do maracujazeiro tem sido afetada por um grande número de pragas e doenças, que exigem dedicação e esforços urgentes, no sentido de minimizar as perdas e evitar sua disseminação. O vírus da pinta verde do maracujazeiro (PVM) (Passion fruit green spot virus PFGSV) caracteriza-se por induzir a formação de pequenas manchas verdes em frutos e em folhas, e lesões necróticas em ramos. Exames de secções ultrafinas de tecidos infectados ao microscópio eletrônico de transmissão consistentemente revelam a presença de partículas baciliformes em cisternas do retículo endoplasmático e viroplasma denso no citoplasma. Os efeitos citopáticos encontrados, a relação com o ácaro vetor, Brevipalpus phoenicis, e a comparação com outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTB), como o da leprose dos citros, classifica o vírus como sendo do tipo citoplasmático. Seu relato inicial deu-se há cerca de 10 anos em Vera Cruz-SP, mas em 1994 foi relatada uma doença no Estado da Bahia chamada de definhamento precoce do maracujazeiro (DPM), que apresenta sintomas, efeitos citopáticos e vetor semelhantes ao da pinta verde, tendo sido sugerida a possibilidade de serem duas denominações para uma mesma doença. Atualmente a PVM/DPM encontra-se em vários outros Estados como Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pará, além do Distrito Federal. Sua diagnose ainda depende dos sintomas observados, infestação por ácaros Brevipalpus e microscopia eletrônica. Para se desenvolver um método de diagnose molecular, que permita detectar o vírus causador da PVM/DPM de maneira rápida e confiável, em grande número de amostras, foi feita uma Biblioteca de cDNA a partir do RNA dupla fita do vírus, extraído de tecidos sintomáticos de maracujazeiros infectados com um isolado do PFGSV encontrado em Limeira-SP. Com o sequenciamento parcial do genoma viral, foram desenhados primers específicos que amplificam partes dos genes putativos da p24 e aqueles que codificam a proteína de movimento (MP) e a Replicase (Rep) de diferentes isolados do PFGSV. Primers do PFGSV e de dois outros VTBs do tipo citoplasmático (VTB-C) para os quais se dispõe de primers para sua detecção por RT-PCR (vírus da leprose dos citros C - CiLV-C; mancha anelar de Solanum violaefolium - SvRSV) foram testados em reações homólogas e heterólogas. Ocorreram amplificações por RT-PCR gerando fragmentos de tamanho esperados apenas para os vírus homológos, mas não nas reações heterólogas, indicando que PFGSV deve diferir do CiLV-C e SvRSV. Assim, tem-se agora uma ferramenta molecular que detecta especificamente o PFGSV. Um estudo inicial sobre a variabilidade genética do PFGSV foi feito a partir da extração do RNA total, seguido de RT-PCR utilizando os primers específicos, purificação dos fragmentos obtidos e uso da técnica de Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Foram analisados isolados procedentes de diferentes regiões brasileiras e em geral a variabilidade foi maior para as amostras do Estado de São Paulo. Logrou-se transmitir experimentalmente o PFGSV com ácaros para uma espécie silvestre de maracujá (Passiflora morifolia). / In Brazil, passion fruits are affected by several diseases and pests which affect their yield. Among them, a recently recognized viral disease, caused by Passion fruit green spot virus (PFGSV), is characterized by the presence of green spots on fruits and senescent leaves, and necrotic lesions on branches. When the infection is early, stem lesions may coalesce, girdling the branch resulting in the subsequent death of the plant. Electron microscopic examination of the thin sections of infected tissues revealed the presence of short, bacilliform particles in the cistern of the endoplasmic reticulum and dense, vacuolated viroplasma in the cytoplasm. The disease was shown to be transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). The localized symptoms, transmission by Brevipalpus mite and the observed cytopathic effect are considered evidences to demonstrate the viral nature of the disease and place it among the socalled cytoplasmic type of Brevipalpus-transmitted viruses (C-BTV), whose prototype is the Citrus leprosis virus C (CiLV-C). Though the first report of the disease occurred more than 10 years ago at Vera Cruz-SP, little is known about PFGSV, though it has been found in several passion flower growing areas in Brazil. In 1994 was report a disease named of DPM (definhamento precoce do maracujazeiro) was reported state of Bahia, with characteristics similar to that of the PVM and it has been suggested that DPM and PVM are the same disease. Subsequently the PVM/DPM has been found in several others Brazilian States as Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pará and Distrito Federal. Diagnosis has been made by symptoms, association with Brevipalpus mites and the time consuming transmission electron microscopy. This work reports the results of efforts to generate a quick and precise method to detect the virus for the diagnosis of the disease, evaluate the variability of the PFGSV isolates from different regions of the country and determine the taxonomic position of this virus. From the dsRNA present in extracts of the PFGSV-infected passion flower plant tissues, a cDNA library was obtained and its sequencing permitted to identify part of the viral genome. Based on these sequences, particularly of p24 and the putative genes that code for the movement protein (MP) and replicase (Rep), specific primers were designed which specifically detected PFGSV by RT-PCR in extracts of PFGSV-infected tissues. Evaluation of the variability of different isolates of PFGSV was made by single strand conformational polymorphism (SSCP) of the amplified fragments of the viral genome. In general, it a larger variation was found in isolates from São Paulo state. PFGSV seems to differ from two other C-BTV with available primers, CiLV-C and the Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), since RT-PCR assays do not cross amplify their genomes. Experimental transmission of PFGSV by mites to woodland passion flower (Passiflora morifolia) was achieved.

O Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus é usado como agente de controle biológico da lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), e representa o bioinseticida viral mais amplamente utilizado no mundo. Sabendo-se que as populações selvagens de baculovírus são geneticamente heterogêneas, este trabalho avaliou a diversidade genômica de 17 isolados selvagens de AgMNPV, coletados no Brasil, Argentina e Uruguai, entre 1980 e 1990. Os genótipos reconstruídos evidenciam a conservação da colinearidade genômica durante a evolução de AgMNPV, porém, deleções e inserções de uma ou mais bases foram comuns. Um novo gene com possível origem em lepidóptero foi identificado em dois genótipos; e o gene bro-a está ausente em muitos isolados. Análises de diversidade genética apontaram que a maioria dos genes de AgMNPV é pouco variável, e os genes mais diversos estão em loci variáveis específicos. Os resultados obtidos reforçam a percepção de que grandes vírus de DNA evoluem principalmente sob baixas taxas de substituição, e por meio de duplicações, ganhos e perdas gênicas. / The Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus is employed as a biological control agent against velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis), and represents the most widely used viral bioinseticide in the world. Since baculovirus wild populations are genetically heterogeneous, this work evaluated the genomic diversity of 17 AgMNPV geographic isolates obtained from 1980 to 1990, in the Brazil, Argentina and Uruguay. The genotypes reconstructed evidenced the highly genomic colinearity conservation during AgMNPV evolutionary history, however, deletions and insertions of one or more bases were common. A new gene with possible lepidopteran origin was identified in two genotypes; and the gene bro-a is absence in many isolates. Genetic diversity analyses pointed that most AgMNPV genes shows little variation, and the highly diverse genes are in specific variable loci. The obtained results reinforce the perception that large DNA virus evolve mainly under low rates of substitution, and through gene duplications, gain and loss.