Diante da busca por abordagens mais sustentáveis para o controle de insetos, os inibidores de peptidases de plantas surgem como uma ferramenta promissora para a proteção de culturas via obtenção de plantas transgênicas. Efeitos nocivos da ingestão de inibidores de peptidases de soja (IPS) sobre o desenvolvimento de Diatraea saccharalis já foram reportados em trabalhos anteriores, entretanto, esses efeitos não foram estudados em nível molecular para essa espécie. Esse trabalho teve como objetivos identificar e analisar a expressão gênica e a atividade de serino peptidases intestinais de D. saccharalis em resposta à ingestão de um concentrado ativo de inibidores de peptidases de soja, relacionando essas informações com a presença ou não de algum mecanismo adaptativo desse inseto em resposta à ingestão desses inibidores. Para isso, foi obtido o transcriptoma intestinal de lagartas de D. saccharalis no quinto ínstar do desenvolvimento, submetidas à ingestão crônica de IPS. Em seguida foram identificadas as sequências correspondentes a serino peptidases do tipo tripsinas e quimotripsinas nesse transcriptoma, as quais foram utilizadas para o estudo da expressão gênica relativa por RT-PCR quantitativo, em resposta à ingestão aguda (por 24 e 48 horas) e crônica e de 0,5% (m/v) de um concentrado ativo de IPS por lagartas de D. saccharalis no terceiro e no quinto ínstares do desenvolvimento larval. As mesmas sequências foram utilizadas para a proposição de filogenias, sendo comparadas inclusive com sequências de serino peptidases de Spodoptera frugiperda identificadas em outro estudo paralelo. Ensaios de atividade tríptica e quimotríptica foram realizados utilizando substratos específicos (BApNA e SApNA) para determinar o efeito da ingestão de IPS sobre a atividade enzimática e finalmente, a integridade e a atividade inibitória do IPS foram analisadas após sua passagem pelo trato digestório das lagartas. Os resultados obtidos permitiram concluir que, nas condições experimentais empregadas nesse estudo, as lagartas de D. saccharalis não foram capazes de modular a expressão gênica das serino peptidases em resposta à ingestão crônica ou aguda de IPS. Os resultados de atividade tríptica e quimotríptica em função da ingestão de IPS podem sugerir um sinergismo na ação dessas enzimas em lagartas do quinto instar. Não foram detectadas diferenças na atividade de tripsinas e quimotripsinas em lagartas do terceiro ínstar em função da ingestão de IPS. A separação eletroforética das proteínas das fezes de lagartas permitiu a visualização de uma banda com massa molecular em torno de 20 kDa possivelmente correspondente ao inibidor do tipo Kunitz presente em soja que, juntamente com os dados de atividade antitríptica das fezes, indicam que D. saccharalis não é capaz de hidrolisar esse inibidor como um mecanismo de adaptação à sua presença na dieta. / Given the importance of search for more sustainable approaches for pest control, plant peptidases inhibitors emerge as a promising tool for the protection of crops by obtaining transgenic plants. Harmful effects of soybean peptidases inhibitors (SPI) intake by Diatraea saccharalis on its development were already reported in previous studies, however, these effects have not been studied at the molecular level for this specie. This study aimed to identify and analyze the gene expression and the gut serine peptidases activity of D. saccharalis in response to the intake of an active extract of soybean peptidases inhibitors. These informations were related to the presence or absence of some adaptive mechanism of this insect in response to these inhibitors. The gut transcriptome of larvae of D. saccharalis in the fifth developmental instar was obtained, undergoing chronic intake of IPS. Then, sequences of serino peptidases like trypsin and chymotrypsin were identified and used for gene expression studies on a real-time PCR in response to acute (for 24 and 48 hours) and chronic intake of 0.5 % (w/v) of SPI active extract by larvae of D. saccharalis in the third and fifth instars of larval development. The same sequences were used to propose phylogenies, including comparisons with sequences of Spodoptera frugiperda serine peptidases identified in another parallel study. Tryptic and chymotryptic activity assays were performed using specific substrates (BApNA and SApNA) to determine the effect of the SPI intake on enzyme activity and finally, the integrity and the inhibitory activity of the SPI were analyzed after passing through the digestive tract of caterpillars. The results showed that under the experimental conditions employed in this study, the larvae of D. saccharalis were not able to modulate the gene expression of serine peptidases in response to acute or chronic SPI intake. The results of tryptic and chymotryptic activity due to the SPI intake can suggest a synergism in the action of these enzymes in larvae of the fifth developmental instar. SPI intake did not cause differences in enzymatic activity of third instar larvae. Electrophoretic separation of proteins from the feces of caterpillars enabled visualization of a band with a molecular mass around 20 kDa possibly corresponding to the Kunitz inhibitor present in soybean. The antitryptic activity of the feces indicates that D. saccharalis is not able to hydrolyze soybean peptidases inhibitor as a mechanism of adaptation to their presence in the diet.

A proteína serina/treonina fosfatase do tipo 1 (PP1) é a principal serina/treonina fosfatase envolvida na regulação de diversos processos tais como metabolismo, crescimento e divisão celular, síntese protéica e processamento de RNA. A holoenzima PP1 é constituída de uma subunidade catalítica conservada (PP1c) e subunidades reguladoras variáveis. Em mamíferos já foram identificados dezenas de polipeptídeos que associam-se direta ou indiretamente a PP1c, gerando holoenzimas com localizações celulares e especificidades distintas. Entre as proteínas que se associam a PP1c, muitas têm função inibitória como o inibidor-1 (I-1) e o inibidor-2 (I-2). A partir de extratos de micélios de Neurospora crassa foi purificada uma proteína, denominada INc-1, que atua in vitro como inibidor da atividade de fosforilase fosfatase de PP1c e constitui-se no primeiro exemplo de subunidade reguladora da PP1 descrito em fungos filamentosos. INc-1 apresenta diversas características bioquímicas comuns ao I-2 de mamíferos. Seqüências parciais de aminoácidos de três fragmentos proteolíticos obtidos de INc-1 permitiram a identificação de uma ORF (fase aberta de leitura) no genoma de N. crassa que provavelmente codifica INc-1. A análise dessa ORF mostrou que a sequência de aminoácidos do INc-1 é similar a do I-2, especialmente em regiões supostamente envolvidas em sua interação com a PP1c. Neste trabalho descrevemos a clonagem e a expressão em bactérias da sequência codificadora de INc-1. A atividade inibidora de PP1c de duas isoformas recombinantes purificadas, INc-1L e INc-1, foram avaliadas e comparadas. A forma denominada INc-1L apresenta em sua região aminoterminal um segmento de 38 aminoácidos derivado da retenção de um íntron, sem alterar a fase de leitura. Ambas proteínas recombinantes exibiram efeito inibidor sobre a atividade de fosforilase fosfatase de PP1c recombinante, sendo que a IC50 determinada para INc-1L foi de ~50nM e para INc-1 foi de ~11nM, sugerindo que a retenção do segmento de aminoácidos codificado pelo íntron na isoforma INc-1L diminui seu potencial inibitório. Verificamos também que o mRNA de INc-1 é expresso durante o crescimento vegetativo de N.crassa, apresentando níveis máximos na fase exponencial. / Type 1 protein serine/threonine phosphatases (PP1) play important roles in the regulation of many cellular functions including metabolism, cell growth and division, protein synthesis and pre-mRNA splicing. PP1 holoenzyme consists of one highly conserved catalytic subunit (PP1c) and variable regulatory subunits. A number of proteins that interact with PP1c have been described in mammals and the respective holoenzymes present distinct substrate specificity and/or different subcelular localization. Among the proteins that interact with PP1c, there are many with inhibitory effect such as inhibitor-1 (I-1) and inhibitor-2 (1-2). It has been demonstrated that a protein denominated INc-1, purified from Neurospora crassa extracts, specifically inhibits PP1c and has biochemical properties that resemble those of mammalian I-2. INc-1 is the first example of a PP1c regulatory subunit in filamentous fungi. Partial amino acid sequences of INc-1 led to the identification of an ORF (open reading frame) in Neurospora crassa genome which appears to encode INc-1. This ORF shows similarity with mammalian I-2 mainly in regions mapped as sites for interaction with PP1c. In this work we report the cloning and bacterial expression of the coding sequence for INc-1. The PP1c inhibitory activities of two recombinant isoforms, named INc-1L and INc-1, were compared. INc-1L aminoacid sequence presents an in frame segment of 38 residues encoded by an non-processed intron. 80th recombinant proteins showed inhibitory effect against phosphorylase phosphatase activity of recombinant PP1c, with IC50 of ~50nM for INc-1L and ~11nM for INc-1, suggesting that retention of the 38 residue segment decrease the inhibitory potential of INc-1L. We have also verified that INc-1 mRNA is expressed during N.crassa vegetative growth with maximum level at the exponential phase.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 µmol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 µmol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 µmol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 µmol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 µmol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 µmol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

Le système endocannabinoïde est un important modulateur des fonctions physiologiques. Il est composé des récepteurs aux cannabinoïdes, de ses ligands lipides endogènes (les endocannabinoïdes) et de la machinerie enzymatique pour leur synthèse et leur dégradation. Les récepteurs aux cannabinoïdes de type 1 (CB1) sont exprimés dans différents types cellulaires dans le cerveau et sont connus pour être impliqués dans les processus mnésiques. Les endocannabinoïdes sont mobilisés dépendamment de l’activité notamment dans les régions cérébrales impliquées dans la mémoire telle que l’hippocampe. Dans cette région, les récepteurs CB1 sont exprimés au niveau des terminaisons neuronales présynaptiques où leur stimulation inhibe la libération de neurotransmetteurs, modulant ainsi différentes formes d’activité synaptique. Outre leur expression sur les neurones, les récepteurs CB1 sont également exprimés par les astrocytes. Avec l’élément pré- et post-synaptique, les astrocytes font partis de la « synapse tripartite » où ils participent à la plasticité synaptique et les processus mnésiques associés. De manière intéressante, la stimulation des récepteurs CB1 astrocytaires facilite la transmission glutamatergique dans l’hippocampe. Dans cette région, les astrocytes régulent l’activité des N-methyl-Daspartate receptors (NMDARs) à travers le contrôle des niveaux synaptiques de leur co-agoniste, la D-serine, modulant ainsi la plasticité synaptique à long terme. Cependant, le mécanisme entrainant la libération de D-serine par les astrocytes n’est pas identifié. De manière intéressante, notre laboratoire a montré que les effets délétères des cannabinoïdes exogènes sur la mémoire de travail spatial sont médiés par les récepteurs CB1 astrocytaires à travers un mécanisme dépendant des NMDARs dans l’hippocampe. Cependant, le rôle physiologique des récepteurs CB1 astrocytaires restent méconnus. Une des formes de mémoire impliquant le récepteurs CB1 est la mémoire de reconnaissance d’objet (NOR). La stimulation exogène des récepteurs CB1 hippocampique inhibe la consolidation de la NOR mais la délétion constitutive des récepteurs CB1 n’affecte pas la NOR, suggérant que la signalisation des récepteurs CB1 endogènes n’est pas nécessaire. Cependant, de récentes études soulignent que la délétion globale du gène CB1 pourrait masquer le rôle des récepteurs CB1 des différents types cellulaires. Ceci indique la nécessité de nouveaux outils plus sophistiqués afin de totalement comprendre le rôle physiologique du système endocannabinoïde dans des comportements complexes. Dans cette étude, nous avons étudié le rôle physiologique des récepteurs CB1 astrocytaires dans la formation de la NOR et la plasticité synaptique. En utilisant une combinaison d’approches génétiques, comportementales, électro-physiologiques, d’imagerie et de biochimie, nous avons montré que l’activation endogène des récepteurs CB1 astrocytaires est nécessaire pour la consolidation de la NOR à long terme, et ceci à travers un mécanisme impliquant l’apport en D-sérine, afin de stimuler l’activité des NMDARs synaptiques de l’hippocampe dorsal. Cette étude révèle un mécanisme inattendu à la base de la libération de D-sérine, entrainant l’activité des NMDARs et la formation de la mémoire à long terme. / The endocannabinoid system is an important modulator of physiological functions. It is composed of cannabinoid receptors, their endogenous lipid ligands (the endocannabinoids) and the enzymatic machinery for endocannabinoid synthesis and degradation. The type-1 cannabinoid receptors (CB1) are expressed in different cell types of the brain and are known to be involved in memory processes. Endocannabinoids are mobilized in an activity-dependent manner in brain areas involved in the modulation of memory such as the hippocampus. In this brain region, CB1 receptors are mainly expressed at neuronal pre-synaptic terminals where their stimulation inhibits the release of neurotransmitters, thereby modulating several forms of synaptic activity. Besides their expression in neurons, CB1 receptors are also expressed in astrocytes. Along with the pre- and post-synaptic neurons, astrocytes are part of the “tripartite synapse”, where they participate in synaptic plasticity and associated memory processes. Interestingly, modulation of astroglial CB1 receptors has been proposed to facilitate glutamatergic transmission in the hippocampus. In this brain area, astrocytes regulate the activity of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) through the control of the synaptic levels of their co-agonist D-serine, thereby mediating long-term synaptic plasticity. However, the mechanisms inducing D-serine release by astrocytes are still not identified. Interestingly, our laboratory showed that the negative effect of exogenous cannabinoids on spatial working memory is mediated by astroglial CB1 receptors through a NMDAR-dependent mechanism in the hippocampus, but the physiological role of astroglial CB1 remains unknown. One of the forms of memory involving CB1 receptors is novel object recognition (NOR) memory. The exogenous stimulation of hippocampal CB1 receptors inhibits the consolidation of long-term NOR formation. Constitutive global deletion of CB1 receptors in mice leaves NOR memory intact, suggesting that endogenous CB1 receptor signaling is not necessary for long-term NOR. However, recent studies pointed-out that, likely due to compensatory mechanisms, the global deletion of the CB1 gene might mask cell type-specific roles of CB1 receptors, indicating that more sophisticated tools are required to fully understand the physiological roles of the endocannabinoid system in complex behavioral functions. In this work, we investigated the physiological role of the astroglial CB1 receptors on NOR memory formation and synaptic plasticity. By using a combination of genetic, behavioral, electrophysiological, imaging and biochemical techniques, we showed that endogenous activation of astroglial CB1 receptors is necessary for the consolidation of long-term NOR memory, through a mechanism involving the supply of D-serine to enhance synaptic NMDARs-dependent plasticity in the dorsal hippocampus. This study uncovers an unforeseen mechanism underlying D-serine release, triggering NMDARs activity and long-term memory formation.ory.

INTRODUÇÃO: A asma ainda acomete um número crescente de indivíduos, podendo ser muito grave e, algumas vezes, fatal. A despeito da melhor eficiência diagnóstica e eficácia terapêutica, a maioria dos asmáticos graves não obtém controle total dos sintomas com as terapias disponíveis. Alguns estudos sugerem a atuação de inibidores de serinoproteases em diversos processos inflamatórios, entre estes inibidores encontra-se o Boophilus microplus trypsin Inhibitor (BmTI-A). OBJETIVO: Avaliar se o recombinante do inibidor de serinoproteases rBmTI-A modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação e remodelamento das vias aéreas em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Camundongos Balb-c foram divididos em 4 grupos: SAL (salina), OVA (sensibilizados com ovoalbumina), SAL+rBmTI-A (controle tratados com rBmTI-A ) e OVA+rBmTI-A (sensibilizados com ovoalbumina e tratados com rBmTI-A). Nos dias 0 e 14 do protocolo, os animais receberam injeção intraperitoneal (i.p) de salina (0,9% NaCl) (SAL e SAL+rBmTI-A) e ovoalbumina (50 ug/mL) (OVA e OVA+rBmTI-A). Nos dias 22, 24, 26 e 28 foram submetidos à inalação com salina (0,9% NaCl) ou ovoalbumina (10 mg/ml) e foram tratados com rBmTI-A (35,54 pmol em 50 uL de NaCl) ou apenas salina, via instilação nasal, nos dias 22 e 28. No dia 29, foram realizadas as seguintes análises: hiper-responsividade à metacolina e respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; quantificação do número total de células, macrófagos, linfócitos e polimorfonucleares no fluido do lavado broncoalveolar (FLBA); determinação da concentração das citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A e IFN-y no FLBA por citometria de fluxo (Cytometric Bead Array - CBA); avaliação da expressão de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, MMP-9 e TIMP-1 nas vias aéreas; análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas e avaliação da atividade proteolítica de tripsina-like, MMP-1 e MMP9. A significância foi considerada p < 0,05. RESULTADOS: O tratamento com rBmTI-A nos animais sensibilizados reduziu a atividade proteolítica de tripsina no tecido pulmonar; a resposta máxima de Rrs e Ers; o número de polimorfonucleares e a concentração de IL-5, IL-10, IL-13 e IL-17A no FLBA; a expressão de IL-5, IL-13, IL-17, MMP-9 e TIMP-1 nas vias aéreas; o número de eosinófilos e a fração de fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas do grupo OVA+rBmTI-A comparado ao grupo OVA (p < 0,05). CONCLUSÃO: O rBmTI-A atenuou a hiper-responsividade brônquica, a inflamação e o remodelamento nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Embora mais estudos precisem ser realizados, este inibidor pode contribuir como potencial ferramenta terapêutica para o tratamento de asma / INTRODUCTION: Asthma still affects an increasing number of individuals and can be very serious and sometimes fatal. Despite the improved diagnostic efficiency and therapeutic efficacy, most severe asthmatics do not have complete symptom control with available therapies. Some studies suggest the role of serine protease inhibitors in various inflammatory processes, such as Boophilus microplus trypsin inhibitor (BmTIA). AIMS: To evaluate whether rBmTI-A serine protease inhibitor recombinant modulates bronchial hyperresponsiveness to methacholine, airway inflammation and remodeling in an experimental model of chronic allergic lung inflammation. METHODS: Balb/c mice were divided in four groups: SAL (saline), OVA (sensitized with ovalbumin), SAL+rBmTI-A (control treated with rBmTI-A) and OVA+rBmTI-A (sensitized with ovalbumin and treated with rBmTI-A). On days 0 and 14 of the protocol the animals received intraperitoneal injection (i.p) of saline (0.9% NaCl) (SAL and SAL+rBmTI-A) and ovalbumin (50 ug/mL) (OVA and OVA+rBmTI-A). On days 22, 24, 26 and 28 the groups were submitted to inhalations with saline (0.9% NaCl) or ovalbumin (10 mg/ml) and were treated with a rBmTI-A (35.54 pmol in 50 uL of saline or just saline) by nasal instillation, on the days 22 and 28. On day 29, the following analysis were performed: hyperresponsiveness to methacholine and the maximal resistance and elastance responses of the respiratory system were obtained; quantification of the total number of cells, macrophages, lymphocytes and polymorphonuclear in bronchoalveolar lavage fluid (FLBA); determination of the cytokines IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A and IFN-y concentration in FLBA by Cytometric Bead Array (CBA); IL4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, MMP-9 and TIMP-1 expression in the airways; histopathological analysis of the lung for quantification of eosinophils, collagen and elastic fibers and evaluation of trypsin-like, MMP-1 and MMP9 proteolytic activity. Significance was considered when p < 0.05. RESULTS: The treatment with rBmTI-A in sensitized animals reduced: the proteolytic activity of trypsinlike in lung tissue, the maximum response of Rrs and Ers, the number of polymorphonuclear cells and the concentration of IL-5, IL-10, IL-13 and IL-17A in FLBA, the expression of IL-5, IL-13, IL-17, MMP-9 and TIMP-1 in the airways, the number of eosinophils and the fraction of collagen and elastic fibers in the airways of the OVA + rBmTI-A group compared to the OVA group (p < 0.05). CONCLUSION: rBmTI-A attenuated bronchial hyperresponsiveness, inflammation and remodeling in this experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. Although more studies need to be performed, this inhibitor may contribute as a potential therapeutic tool for the asthma treatment

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, AIDS,malária e tuberculose são as três maiores doenças infectantes do mundo, atingindo principalmente crianças. Regiões paupérrimas e de clima tropical, como a África sub-saariana, são as mais atingidas. Este quadro agrava-se com a disseminação de cepas do Plasmodium falciparum resistentes à cloroquina e multi-resistentes.Além disso, alguns fármacos utilizados na terapêutica da malária apresentam vários efeitos adversos, comprometendo o tratamento. Trata-se de um grande desafio e o seu enfrentamento requer estratégias. O desenvolvimento de novos quimioterápicos deve fundamentar-se em diferenças bioquímicas e morfológicas entre as células do hospedeiro e do parasita. A biossíntese de fosfolipídeos de membrana em parasitas do grupo Apicomplexa é de extrema importância para a maturação e a reprodução do parasita e constitui-se em bom alvo para novos antimaláricos, uma vez que é encontrada somente em parasitas. Hemácias infectadas têm sua absorção modificada em relação aos eritrócitos não-infectados, conferindo seletividade a substâncias como lipídeos. O trabalho em questão propõe a síntese de antimetabólitos da serina, visando à inibição das enzimas fosfatidilserina síntase e serina descarboxilase, fundamentais para a biossíntese de fosfolipídeos de membrana desses parasitas.. Cinco derivados heterocíclicos da serine foram sintetizados: derivados diidroimidazólico, diidroxazólico, diidroxazínico, diidropirimidínico e diidrooxatiólico. Também, o transportador fosfolipídico com o ácido esteárico foi sintetizado. Os antimetabólitos serão acoplados a esse e outros fosfolipídeos, obtendo-se fármacos dirigidos específicos direcionados seletivamente a eritrócitos infectados. / According to the World Health Organization, Aids, malaria and tuberculosis are the three greatest infectious diseases in the world. Children are the most involved in those diseases. Extremely poor regions, as sub-Saharan, Africa, are the most affected. In the worst case scenario, one of the parasites that causes malaria, Plasmodium falciparum, become resistant to chloroquine and the current therapy. Besides, some drugs used in the mataria chemotherapy are very toxic, showing many side effects, and compromising the treatment. This is a big challenge and facing it requires new strategies.. The development of chemotherapeutic has been inspired in biochemical differences between the parasite and the host. Plasmodíum falciparum needs to biosynthesize phospholipids for their membrane. These phospholipids are very important to the maturation and reproduction of the parasite and occur only in it.. This makes the phospholipids biosynthesis a good target for new and specific antimalarial drug design. Infected red blood cell shows modified permeation, allowing the lipids to be freely transported, what is not usual in the non-infected red blood cells. This said, in the present work the design and synthesis of serine metabolic inhibitors, using the bioisosteric strategy, have been proposed. The inhibition of the phosphatidylserine biosynthesis, an important phospholipid, is expected. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected red-blood cell.. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected redblood cell. In the present work five heterocyclic serine inhibitors: diidroimidazolic, diidroxazolic, diidroxazinico, diidropyriminic and diidroxatiolic. Also synthesized a phospholipid to be connected to the heterocyclic inhibitors.

Diante da busca por abordagens mais sustentáveis para o controle de insetos, os inibidores de peptidases de plantas surgem como uma ferramenta promissora para a proteção de culturas via obtenção de plantas transgênicas. Efeitos nocivos da ingestão de inibidores de peptidases de soja (IPS) sobre o desenvolvimento de Diatraea saccharalis já foram reportados em trabalhos anteriores, entretanto, esses efeitos não foram estudados em nível molecular para essa espécie. Esse trabalho teve como objetivos identificar e analisar a expressão gênica e a atividade de serino peptidases intestinais de D. saccharalis em resposta à ingestão de um concentrado ativo de inibidores de peptidases de soja, relacionando essas informações com a presença ou não de algum mecanismo adaptativo desse inseto em resposta à ingestão desses inibidores. Para isso, foi obtido o transcriptoma intestinal de lagartas de D. saccharalis no quinto ínstar do desenvolvimento, submetidas à ingestão crônica de IPS. Em seguida foram identificadas as sequências correspondentes a serino peptidases do tipo tripsinas e quimotripsinas nesse transcriptoma, as quais foram utilizadas para o estudo da expressão gênica relativa por RT-PCR quantitativo, em resposta à ingestão aguda (por 24 e 48 horas) e crônica e de 0,5% (m/v) de um concentrado ativo de IPS por lagartas de D. saccharalis no terceiro e no quinto ínstares do desenvolvimento larval. As mesmas sequências foram utilizadas para a proposição de filogenias, sendo comparadas inclusive com sequências de serino peptidases de Spodoptera frugiperda identificadas em outro estudo paralelo. Ensaios de atividade tríptica e quimotríptica foram realizados utilizando substratos específicos (BApNA e SApNA) para determinar o efeito da ingestão de IPS sobre a atividade enzimática e finalmente, a integridade e a atividade inibitória do IPS foram analisadas após sua passagem pelo trato digestório das lagartas. Os resultados obtidos permitiram concluir que, nas condições experimentais empregadas nesse estudo, as lagartas de D. saccharalis não foram capazes de modular a expressão gênica das serino peptidases em resposta à ingestão crônica ou aguda de IPS. Os resultados de atividade tríptica e quimotríptica em função da ingestão de IPS podem sugerir um sinergismo na ação dessas enzimas em lagartas do quinto instar. Não foram detectadas diferenças na atividade de tripsinas e quimotripsinas em lagartas do terceiro ínstar em função da ingestão de IPS. A separação eletroforética das proteínas das fezes de lagartas permitiu a visualização de uma banda com massa molecular em torno de 20 kDa possivelmente correspondente ao inibidor do tipo Kunitz presente em soja que, juntamente com os dados de atividade antitríptica das fezes, indicam que D. saccharalis não é capaz de hidrolisar esse inibidor como um mecanismo de adaptação à sua presença na dieta. / Given the importance of search for more sustainable approaches for pest control, plant peptidases inhibitors emerge as a promising tool for the protection of crops by obtaining transgenic plants. Harmful effects of soybean peptidases inhibitors (SPI) intake by Diatraea saccharalis on its development were already reported in previous studies, however, these effects have not been studied at the molecular level for this specie. This study aimed to identify and analyze the gene expression and the gut serine peptidases activity of D. saccharalis in response to the intake of an active extract of soybean peptidases inhibitors. These informations were related to the presence or absence of some adaptive mechanism of this insect in response to these inhibitors. The gut transcriptome of larvae of D. saccharalis in the fifth developmental instar was obtained, undergoing chronic intake of IPS. Then, sequences of serino peptidases like trypsin and chymotrypsin were identified and used for gene expression studies on a real-time PCR in response to acute (for 24 and 48 hours) and chronic intake of 0.5 % (w/v) of SPI active extract by larvae of D. saccharalis in the third and fifth instars of larval development. The same sequences were used to propose phylogenies, including comparisons with sequences of Spodoptera frugiperda serine peptidases identified in another parallel study. Tryptic and chymotryptic activity assays were performed using specific substrates (BApNA and SApNA) to determine the effect of the SPI intake on enzyme activity and finally, the integrity and the inhibitory activity of the SPI were analyzed after passing through the digestive tract of caterpillars. The results showed that under the experimental conditions employed in this study, the larvae of D. saccharalis were not able to modulate the gene expression of serine peptidases in response to acute or chronic SPI intake. The results of tryptic and chymotryptic activity due to the SPI intake can suggest a synergism in the action of these enzymes in larvae of the fifth developmental instar. SPI intake did not cause differences in enzymatic activity of third instar larvae. Electrophoretic separation of proteins from the feces of caterpillars enabled visualization of a band with a molecular mass around 20 kDa possibly corresponding to the Kunitz inhibitor present in soybean. The antitryptic activity of the feces indicates that D. saccharalis is not able to hydrolyze soybean peptidases inhibitor as a mechanism of adaptation to their presence in the diet.

INTRODUÇÃO: A asma ainda acomete um número crescente de indivíduos, podendo ser muito grave e, algumas vezes, fatal. A despeito da melhor eficiência diagnóstica e eficácia terapêutica, a maioria dos asmáticos graves não obtém controle total dos sintomas com as terapias disponíveis. Alguns estudos sugerem a atuação de inibidores de serinoproteases em diversos processos inflamatórios, entre estes inibidores encontra-se o Boophilus microplus trypsin Inhibitor (BmTI-A). OBJETIVO: Avaliar se o recombinante do inibidor de serinoproteases rBmTI-A modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação e remodelamento das vias aéreas em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Camundongos Balb-c foram divididos em 4 grupos: SAL (salina), OVA (sensibilizados com ovoalbumina), SAL+rBmTI-A (controle tratados com rBmTI-A ) e OVA+rBmTI-A (sensibilizados com ovoalbumina e tratados com rBmTI-A). Nos dias 0 e 14 do protocolo, os animais receberam injeção intraperitoneal (i.p) de salina (0,9% NaCl) (SAL e SAL+rBmTI-A) e ovoalbumina (50 ug/mL) (OVA e OVA+rBmTI-A). Nos dias 22, 24, 26 e 28 foram submetidos à inalação com salina (0,9% NaCl) ou ovoalbumina (10 mg/ml) e foram tratados com rBmTI-A (35,54 pmol em 50 uL de NaCl) ou apenas salina, via instilação nasal, nos dias 22 e 28. No dia 29, foram realizadas as seguintes análises: hiper-responsividade à metacolina e respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; quantificação do número total de células, macrófagos, linfócitos e polimorfonucleares no fluido do lavado broncoalveolar (FLBA); determinação da concentração das citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A e IFN-y no FLBA por citometria de fluxo (Cytometric Bead Array - CBA); avaliação da expressão de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, MMP-9 e TIMP-1 nas vias aéreas; análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas e avaliação da atividade proteolítica de tripsina-like, MMP-1 e MMP9. A significância foi considerada p < 0,05. RESULTADOS: O tratamento com rBmTI-A nos animais sensibilizados reduziu a atividade proteolítica de tripsina no tecido pulmonar; a resposta máxima de Rrs e Ers; o número de polimorfonucleares e a concentração de IL-5, IL-10, IL-13 e IL-17A no FLBA; a expressão de IL-5, IL-13, IL-17, MMP-9 e TIMP-1 nas vias aéreas; o número de eosinófilos e a fração de fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas do grupo OVA+rBmTI-A comparado ao grupo OVA (p < 0,05). CONCLUSÃO: O rBmTI-A atenuou a hiper-responsividade brônquica, a inflamação e o remodelamento nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Embora mais estudos precisem ser realizados, este inibidor pode contribuir como potencial ferramenta terapêutica para o tratamento de asma / INTRODUCTION: Asthma still affects an increasing number of individuals and can be very serious and sometimes fatal. Despite the improved diagnostic efficiency and therapeutic efficacy, most severe asthmatics do not have complete symptom control with available therapies. Some studies suggest the role of serine protease inhibitors in various inflammatory processes, such as Boophilus microplus trypsin inhibitor (BmTIA). AIMS: To evaluate whether rBmTI-A serine protease inhibitor recombinant modulates bronchial hyperresponsiveness to methacholine, airway inflammation and remodeling in an experimental model of chronic allergic lung inflammation. METHODS: Balb/c mice were divided in four groups: SAL (saline), OVA (sensitized with ovalbumin), SAL+rBmTI-A (control treated with rBmTI-A) and OVA+rBmTI-A (sensitized with ovalbumin and treated with rBmTI-A). On days 0 and 14 of the protocol the animals received intraperitoneal injection (i.p) of saline (0.9% NaCl) (SAL and SAL+rBmTI-A) and ovalbumin (50 ug/mL) (OVA and OVA+rBmTI-A). On days 22, 24, 26 and 28 the groups were submitted to inhalations with saline (0.9% NaCl) or ovalbumin (10 mg/ml) and were treated with a rBmTI-A (35.54 pmol in 50 uL of saline or just saline) by nasal instillation, on the days 22 and 28. On day 29, the following analysis were performed: hyperresponsiveness to methacholine and the maximal resistance and elastance responses of the respiratory system were obtained; quantification of the total number of cells, macrophages, lymphocytes and polymorphonuclear in bronchoalveolar lavage fluid (FLBA); determination of the cytokines IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A and IFN-y concentration in FLBA by Cytometric Bead Array (CBA); IL4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, MMP-9 and TIMP-1 expression in the airways; histopathological analysis of the lung for quantification of eosinophils, collagen and elastic fibers and evaluation of trypsin-like, MMP-1 and MMP9 proteolytic activity. Significance was considered when p < 0.05. RESULTS: The treatment with rBmTI-A in sensitized animals reduced: the proteolytic activity of trypsinlike in lung tissue, the maximum response of Rrs and Ers, the number of polymorphonuclear cells and the concentration of IL-5, IL-10, IL-13 and IL-17A in FLBA, the expression of IL-5, IL-13, IL-17, MMP-9 and TIMP-1 in the airways, the number of eosinophils and the fraction of collagen and elastic fibers in the airways of the OVA + rBmTI-A group compared to the OVA group (p < 0.05). CONCLUSION: rBmTI-A attenuated bronchial hyperresponsiveness, inflammation and remodeling in this experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. Although more studies need to be performed, this inhibitor may contribute as a potential therapeutic tool for the asthma treatment

De acordo com a Organização Mundial da Saúde, AIDS,malária e tuberculose são as três maiores doenças infectantes do mundo, atingindo principalmente crianças. Regiões paupérrimas e de clima tropical, como a África sub-saariana, são as mais atingidas. Este quadro agrava-se com a disseminação de cepas do Plasmodium falciparum resistentes à cloroquina e multi-resistentes.Além disso, alguns fármacos utilizados na terapêutica da malária apresentam vários efeitos adversos, comprometendo o tratamento. Trata-se de um grande desafio e o seu enfrentamento requer estratégias. O desenvolvimento de novos quimioterápicos deve fundamentar-se em diferenças bioquímicas e morfológicas entre as células do hospedeiro e do parasita. A biossíntese de fosfolipídeos de membrana em parasitas do grupo Apicomplexa é de extrema importância para a maturação e a reprodução do parasita e constitui-se em bom alvo para novos antimaláricos, uma vez que é encontrada somente em parasitas. Hemácias infectadas têm sua absorção modificada em relação aos eritrócitos não-infectados, conferindo seletividade a substâncias como lipídeos. O trabalho em questão propõe a síntese de antimetabólitos da serina, visando à inibição das enzimas fosfatidilserina síntase e serina descarboxilase, fundamentais para a biossíntese de fosfolipídeos de membrana desses parasitas.. Cinco derivados heterocíclicos da serine foram sintetizados: derivados diidroimidazólico, diidroxazólico, diidroxazínico, diidropirimidínico e diidrooxatiólico. Também, o transportador fosfolipídico com o ácido esteárico foi sintetizado. Os antimetabólitos serão acoplados a esse e outros fosfolipídeos, obtendo-se fármacos dirigidos específicos direcionados seletivamente a eritrócitos infectados. / According to the World Health Organization, Aids, malaria and tuberculosis are the three greatest infectious diseases in the world. Children are the most involved in those diseases. Extremely poor regions, as sub-Saharan, Africa, are the most affected. In the worst case scenario, one of the parasites that causes malaria, Plasmodium falciparum, become resistant to chloroquine and the current therapy. Besides, some drugs used in the mataria chemotherapy are very toxic, showing many side effects, and compromising the treatment. This is a big challenge and facing it requires new strategies.. The development of chemotherapeutic has been inspired in biochemical differences between the parasite and the host. Plasmodíum falciparum needs to biosynthesize phospholipids for their membrane. These phospholipids are very important to the maturation and reproduction of the parasite and occur only in it.. This makes the phospholipids biosynthesis a good target for new and specific antimalarial drug design. Infected red blood cell shows modified permeation, allowing the lipids to be freely transported, what is not usual in the non-infected red blood cells. This said, in the present work the design and synthesis of serine metabolic inhibitors, using the bioisosteric strategy, have been proposed. The inhibition of the phosphatidylserine biosynthesis, an important phospholipid, is expected. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected red-blood cell.. These inhibitors will be linked to phospholipids, to promote the selective permeation to the infected redblood cell. In the present work five heterocyclic serine inhibitors: diidroimidazolic, diidroxazolic, diidroxazinico, diidropyriminic and diidroxatiolic. Also synthesized a phospholipid to be connected to the heterocyclic inhibitors.

The yeasts Pichia pastoris and Kluyveromyces lactis were used to express several recombinant human proteins for further biochemical characterization. Two substitution variants of recombinant human enteropeptidase light chain (rhEPL) were engineered to modify the extended substrate specificity of this serine protease. Both were secreted as active enzymes in excess of 1.7 mg/L in P. pastoris fermentation broth. The substitution variant rhEPL R96Q showed significantly reduced specificities for the preferred substrate sequences DDDDK and DDDDR; however, the rhEPL Y174R variant displayed improved specificities for these substrate sequences relative to all other reported variants of this enzyme. The neutrophil serine proteases human cathepsin G (hCatG) and human neutrophil elastase (HNE) were expressed in P. pastoris and HNE was also expressed in K. lactis. The recombinant variants rhCatG and rHNE, with intact C-terminal extensions, were expressed as fusion proteins with the soluble heme-binding domain of cytochrome B5 (CytB5) and an N-terminal hexahistidine (6xHis) tag for purification. The CytB5 domain was linked to the native N-termini of active rhCatG and rHNE by the EPLcleavable substrate sequence DDDDK~I, where ~ is the sessile bond. These fusion proteins were directed for secretion. The yeast P. pastoris expressed up to 3.5 mg/L of EPL-activable rHNE in fermentation broth; however, only 200 μg/L of rhCatG could be produced by this method. Recombinant expression in K. lactis never surpassed 100 μg/L of activable rHNE. The CytB5 fusion domain was present in the heme-bound form, conferring a red color and 410 nm absorbance peak to solutions containing the fusion proteins. This absorbance pattern was most readily visible during the purification of CytB5-rHNE from P. pastoris. Human C-reactive protein (hCRP) and the substitution variant CRP E42Q were expressed in recombinant form and secreted by P. pastoris. Both products were found to bind phosphocholine (PCh) in the same manner as native hCRP. Difficulties encountered during purification revealed that wild type recombinant CRP (rCRP) was produced at 2 different molecular masses. The P. pastoris recombinant expression system yielded better results than K. lactis. Bioreactor-scale fermentation in a 5 L vessel facilitated expression and characterization of these recombinant proteins.