La maladie d’Alzheimer est majoritairement sporadique et peu est connu sur les mécanismes déclenchant le développement de cette forme de la maladie. Les études sur la forme familiale ont attribué une importance particulière à la bêta-amyloïde (Aβ), un produit de clivage du précurseur de la protéine amyloïde (APP). Plusieurs facteurs de risques ont été identifiés comme déclencheurs potentiels du développement de la maladie d’Alzheimer dont le diabète de type II (T2D). En effet, la déficience de la signalisation de l’insuline par la désensibilisation des récepteurs de l’insuline (IR) dans le cerveau semble être une caractéristique commune aux deux maladies. Les effets à long terme de la résistance à l’insuline sur l’accumulation d’Aβ et sur la phosphorylation de Tau ont été étudiés, mais les effets de la perturbation aiguë des IR sont moins bien caractérisés. Aussi, les désordres métaboliques sont également des caractéristiques communes aux deux maladies. Le but de notre étude est de déterminer si la perturbation aiguë des IR peut affecter le clivage de l’APP et si la privation énergétique par le jeûne peut sensibiliser ce clivage à la perturbation aiguë des IR. Pour évaluer ceci, nous avons utilisé la Tyrphostin AG1024 à faible dose pour simuler une perturbation des IR plutôt qu’un blocage complet des récepteurs. Pour quantifié le clivage de l’APP, nous avons mesuré les changements de la quantité d’APP taille pleine totale par immunobuvardage de type Western. Pour s’assurer que les changements de la quantité d’APP taille pleine traduisait bien un clivage, nous avons développé un système de lecture par luciférase. Ce système nous permet de suivre le clivage de l’APP via l’expression de la luciférase Firefly puisque le facteur de transcription GAL4 est lié à la portion C-terminale de l’APP . Tout d’abord, nous avons observé que la perturbation aiguë des IR par la Tyrphostin mène au clivage de l’APP et que le jeûne augmente la vulnérabilité au clivage de l’APP suite à une plus petite dose de Tyrphostin. Ce clivage serait imputable à la voie amyloïdogénique puisque l’inhibition de la β-secrétase et de la γ-secrétase empêche le clivage de l’APP. Nous avons aussi montré que la perturbation des IR est nécessaire alors que la perturbation spécifique des IGF-1R n’est pas suffisante. De plus, ni l’autophagie, ni les caspases et ni le protéasomes ne semblent impliqués dans le clivage de l’APP suivant la combinaison du jeûne et de la petite perturbation des IR. L’activité de mTOR n’est également pas requise. Cependant, l’activité de la GSK3 est nécessaire au clivage et semble affecter le clivage par la γ-secrétase. Nous avons ensuite confirmé dans des cultures primaires neuronales que la combinaison du jeûne et de la perturbation aiguë des IR cause le clivage de l’APP et que la GSK3 est encore une fois fortement active. Ainsi, nos résultats suggèrent que la perturbation de la signalisation de l’insuline tel qu’observé dans le T2D augmente le clivage de l’APP via la voie amyloïdogénique et, donc, contribue à la pathologie de la maladie d’Alzheimer. / Little is known about the mechanisms that trigger the onset of Alzheimer’s disease (AD), a primarily sporadic disease. Studies on the familial form of AD attributed a particular importance to Amyloid beta (Aβ), a cleavage product of the Amyloid precursor protein (APP). Many risk factors have been identified as potential triggers of the development of AD including Type 2 diabetes (T2D). Indeed, the impairment of insulin signaling by the desensitization of insulin receptors (IR) in the brain seems to be a common hallmark of both diseases. The long term effects of IR resistance on the accumulation of Aβ and Tau hyperphosphorylation have been studied, but the acute effects of IR perturbation is less characterized. Also, both diseases show metabolic defects. Our research aimed to determine whether acute perturbation of IR signaling affects APP processing and if starving (energy deprivation) could sensitize this processing to acute perturbation of IR. To assess this, we used small doses of Tyrphostin AG1024 to simulate IR perturbations rather than a complete blocakade of the receptors. To quantify APP processing, we measured the change of total full- lenght APP by Western blot. To ensure that this change reflected APP processing we developed a luciferase based readout system. This system allowed us to monitor the occurrence of APP cleavage via GAL4-UAS Firefly luciferase driven expression because we linked GAL4 transcription factor to the C-terminal region of APP. First, we showed that IR perturbation with Tyrphostin leads to APP processing and that starving increased IR susceptibility to a smaller doses of Tyrphostin. This APP processing occurs via the amyloidogenic pathway because inhibition of β- and γ-secretase inhibited APP processing. We showed that this processing absolutely requires IR perturbation, while IGF-1R perturbation alone is insufficient. Furthermore, neither autophagy, caspases nor proteasome seemed to be implicated in APP processing following starvation and small IR perturbation. The activity of mTOR is also not required. On the contrary, GSK3 activation is necessary for the processing and seems to affect γ-secretase cleavage. We then confirmed in primary cultured neurons that the combination of acute starvation and small IR perturbation causes APP cleavage and GSK3 is again strongly activated. Taken together, our results suggest that the impairment of IR signalling seen in T2D increases the processing of APP via the amyloidogenic pathway and thereby contributes to the pathology of AD.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Résumé : Bien que l’hypoxie soit un puissant inducteur de l’angiogenèse, l’activation des facteurs de croissance est perturbée en hyperglycémie au niveau du pied et du cœur. Cette perturbation entraîne la perte de prolifération et de migration chez les cellules endothéliales, musculaires lisses vasculaires et péricytes empêchant la formation de nouveaux vaisseaux qui mènera à l’amputation des membres inférieurs chez les patients diabétiques. Une étude a démontré qu’une augmentation de la protéine tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) en condition hyperglycémique chez les péricytes entraînait l’inhibition de la signalisation du PDGF-BB, ce qui résultait en le développement d’une rétinopathie diabétique. Nous avons alors soulevé l’hypothèse que l’expression de SHP-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires affecte la prolifération et la migration cellulaire par l’inhibition de la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB en condition diabétique. Nos expérimentations ont été effectuées principalement à l’aide d’une culture primaire de cellules musculaires lisses primaires provenant d’aortes bovines. Comparativement aux concentrations normales de glucose (NG : 5,6 mM), l’exposition à des concentrations élevées de glucose (HG : 25 mM) pendant 48 h a résulté en l’inhibition de la prolifération cellulaire par l’insuline et le PDGF-BB autant en normoxie (20% O2) qu’en hypoxie (24 dernières heures à 1% O2). Lors des essais de migration cellulaire, aucun effet de l’insuline n’a été observé alors que la migration par le PDGF-BB fut inhibée en HG autant en normoxie qu’en hypoxie. L’exposition en HG à mener à l’inhibition de la signalisation de la voie PI3K/Akt de l’insuline et du PDGF-BB en hypoxie. Aucune variation de l’expression de SHP-1 n’a été observée mais son activité phosphatase en hypoxie était fortement inhibée en NG contrairement en HG où on observait une augmentation de cette activité. Finalement, une association a été constatée entre SHP-1 et la sous-unité bêta du récepteur au PDGF. En conclusion, nous avons démontré que l’augmentation de l’activité phosphatase de SHP-1 en hypoxie cause l’inhibition des voies de l’insuline et du PDGF-BB réduisant les processus angiogéniques des cellules musculaires lisses vasculaires dans la maladie des artères périphériques. / Abstract : Even though hypoxia is a strong angiogenic inducer, pro-angiogenic factor signaling pathways in peripheral limb and heart are altered by hyperglycemia. This disruption leads to loss of endothelial cells, vascular smooth muscle cells and pericytes proliferation and migration preventing new blood vessel formation which results in amputation of lower extremities in diabetic patients. A study has shown that increase expression of the protein tyrosine phosphatase Src homology-2 domain-containing phosphatase-1 (SHP-1) in hyperglycemic condition in pericytes caused PDGF-BB signaling inhibition resulting in the development of diabetic retinopathy. Our hypothesis is that SHP-1 expression in vascular smooth muscle cells inhibits cell proliferation and migration induced by insulin and PDGF-BB in diabetic condition. Our experiments were performed using primary culture of vascular smooth muscle cells (SMC) from bovine aortas. As compared to normal glucose concentrations (NG:5,6 mM), high glucose level (HG: 25 mM) exposure for 48h inhibited SMC proliferation induced by insulin and PDGF-BB in both normoxia (20% O2) or hypoxia (1% O2 for the last 24h). During cell migration assays, no effect of insulin was observed while PDGF-BB action of SMC migration was reduced in HG in both normal and low oxygen concentrations. HG exposure lead to inhibition of insulin- and PDGF-BB-stimulated PI3K/Akt signaling pathway in hypoxia. No variation of SHP-1 expression was observed in HG condition. However, SHP-1 phosphatase activity was elevated in HG condition during hypoxia as compared to NG concentrations. Finally, our data showed an association between SHP-1 and the PDGF receptor beta subunit. In conclusion, our results demonstrated that the increase of SHP-1 phosphatase activity in hyperglycemia and hypoxia environment caused inhibition of insulin and PDGF-BB signaling pathways reducing angiogenic processes in vascular smooth muscle cells contributing to peripheral arterial disease in diabetes.

La caractérisation des mécanismes moléculaires exacts de la signalisation de l'insuline est très importante pour comprendre, traiter et prévenir le diabète de type 2. Le deacetylase SIRT1 est une protéine récemment découverte qui est impliquée dans la régulation métabolique, comme dans la sécrétion de l'insuline et l'homéostasie glucidique. Un des activateurs de SIRT1, le resvératrol, a des effets bénéfiques sur la santé, dont une amélioration de la sensibilité à l'insuline et une durée de vie prolongée. Cependant, l'interaction exacte entre la signalisation de l'insuline, SIRT1 et le resvératrol n'est pas connue. Par conséquent j'ai étudié au cours de ma thèse l'impact du resvératrol et de SIRT1 sur la voie de signalisation de l'insuline, principalement dans des cellules musculaires mais aussi in vivo dans le modèle expérimentale du nématode C.elegans. J'ai pu montrer que le resvératrol est un inhibiteur class IA-spécifique de la PI3K. Le resveratrol inhibe aussi l'installation d'une insulino-résistance, peut-être par l'inhibition des protéines kinases comme JNK, diminuant ainsi la phosphorylation en sérine des IRS. Nous montrons aussi que SIRT1 intensifie la signalisation de l'insuline, probablement par l'interaction avec le complexe IRS-PI3K. L'interaction de SIR-2.1, l'homologue de SIRT1, avec la PI3K joue aussi un rôle important dans la régulation de la durée de vie de C.elegans / Characterisation of the exact molecular mechanisms of insulin signalling is of great importance in understanding, treating and preventing type 2 diabetes. The recently discovered deacetylase SIRT1 is implicated in several metabolic regulation mechanisms, including insulin secretion and glucose homeostasis. The SIRT1 activator resveratrol also has beneficial metabolic effects, including improved insulin sensitivity and prolonged lifespan. However, the exact interplay of insulin signalling, SIRT1 and resveratrol is not known. I have therefore studied the impact of resveratrol and SIRT1 on the insulin signalling pathway, mainly in muscle cells, but also in the living model C.elegans. This work has allowed me to show that resveratrol is an isoform-specific PI3K inhibitor. Resveratrol also inhibited instalment of insulin resistance, possible through inhibition of kinases like JNK thereby reducing the IRS serine phosphorylation. We also showed that SIRT1 potentiates insulin signalling, probably through interaction with IRS-PI3K. The interaction with SIR-2.1, the SIRT1 homolog, is important also in PI3K-mediated lifespan regulation in C.elegans