Elementos de transposição são caracterizados como segmentos de DNA capazes de mover-se no genoma em que estão inseridos. A diversidade e abundância desses elementos variam de espécie para espécie, sendo sua distribuição nem uniforme, nem aleatória. Com a grande quantidade de informações provenientes de projetos genoma, a busca de um sistema universal para classificação desses elementos é uma constante. Atualmente, elementos de transposição são divididos em duas classes, sendo os elementos da classe I, ou retrotransposons, divididos em cinco ordens. A ordem mais abundante em plantas é a dos LTR retrotransposons, no qual se insere a superfamília Ty1/Copia. Essa superfamília apresenta diversas famílias de elementos, dentre elas a família Tnt1. Tnt1 foi o primeiro elemento de transposição caracterizado na família Solanaceae, sendo um dos retrotransposons mais bem estudados em plantas. Originalmente isolado do genoma de Nicotiana tabacum, elementos similares a Tnt1 já foram encontrados em pimenta, berinjela, tomate, batata, e em petúnias de jardim. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a diversidade dos retrotransposons com LTR do clado Tork da superfamília Copia, relacionados ao elemento Tnt1, em espécies nativas do gênero Petunia. Para tanto, sequências foram obtidas a partir de reação de PCR com primers já descritos na literatura, com posterior clonagem dos fragmentos obtidos, e sequenciamento dos clones. Um total de 148 sequências únicas foram obtidas de 21 taxa diferentes, incluindo três espécies de Calibrachoa e uma espécie de Fabiana, ambos os gêneros relacionados à Petunia. Análises de relacionamento entre as sequências sugerem a classificação dessas em dez diferentes famílias de retrotransposons com LTR do tipo Copia (RLC), muitas com baixa diferenciação entre as sequências de uma mesma família. Entre essas, uma família de sequências quase que exclusiva de taxa encontrados em substrato com baixa umidade. Para uma visão mais completa, representantes dos diferentes grupos de Tnt1, Retrolyc1, e Retrosol foram incluídos na análise. Foi possível observar que as sequências obtidas no presente trabalho não são compartilhadas entre os elementos dos demais gêneros incluídos. As diferentes sequências aqui obtidas possibilitaram estudos de relacionamento e diversidade, e abrem portas para a utilização desses elementos em estudos subsequentes nos gêneros em questão, assim como em outros gêneros relacionados, uma vez que a conservação de partes do elemento é bastante grande. / Transposable elements are characterized as segments of DNA capable of moving across different parts of the host genome. Diversity and abundance of these elements vary from species to species, and distribution within a genome is usually neither random nor uniform. The amount of information resulting from genome projects demands a universal system for transposable elements’ classification. Nowadays, these elements are classified into two classes, with class I elements, or retrotransposons, being divided into five orders. The most abundant order in plants is the LTR retrotransposons order, in which the Ty1/Copia superfamily is classified. Ty1/Copia presents several families, being the Tnt1 family one of them. Tnt1 was the first transposable element characterized in Solanaceae, being the most well known retrotransposon in plants. Originally isolated from Nicotiana tabacum, Tnt1-related elements have been reported in peppers, eggplant, tomato, potato, and petunias. Therefore, the aim of this work was to characterize the diversity of LTR retrotransposons from the Tork clade of the Copia superfamily, related to Tnt1 elements, in wild Petunia species. Thereunto, sequences were retrieved from PCR reactions with primers previously described, cloned into competent cells. A total of 148 unique sequences were obtained from 21 different taxa, including three Calibrachoa and one Fabiana species, both genera closely related to Petunia. Relationship analysis among sequences suggests their classification into ten families of retrotransposons with LTR from Copia superfamily (RLC), most of low sequence diversity within a family. Among all families, one clade of sequences presented almost exclusively sequences of taxa find under substrates of low humidity conditions. For a more complete view, Tnt1, Retrolyc1, and Retrosol representatives were included in the analysis. Sequences retrieved in the present work are not shared among elements of remaining genera included. The diversity of sequences obtained here made relationship and diversity studies possible, and may be used in further investigations of the genera here studied, as well as in other related genera, since there are conserved fragments along these elements.

As ribonucleases catalisam a clivagem do RNA e são componentes ubíquos das células, desde procariotos até eucariotos. A família T2 é a classe de RNases mais amplamente distribuída entre os organismos vivos. A ampla distribuição desta família sugere que ela deve ter um papel funcional muito importante na biologia celular destes organismos. Em Solanaceae, há basicamente dois grupos destas proteínas, um representado pelas S-RNases, as quais estão envolvidas com a rejeição do pólen na autoincompatibilidade gametofítica e um outro grupo mais diverso que é denominado de S-like RNases, com funções muito diversificadas. As S-RNases se apresentam na forma de um gene multialélico, altamente polimórfico, que está contido no lócus S. O lócus S é composto por uma combinação de proteínas SLF (S-locus F-box), responsáveis pela determinação do fator polínico, e uma S-RNase produzida apenas no pistilo, de forma que estes genes estão fortemente ligados formando o haplótipo S. Esses produtos gênicos interagem possibilitando a rejeição do auto-pólen num fenômeno denominado distinção colaborativa do pólen não próprio. No Capítulo II, foram utilizados métodos filogenéticos para determinar os principais agrupamentos de alelos na genealogia de S-RNases do gênero Solanum. A topologia da árvore não mostrou sinal filogenético para espécies, contudo, isso era esperado uma vez que a diversificação destes alelos ocorreu anteriormente à diversificação das espécies, gerando um fenômeno denominado de polimorfismos trans-específicos. Além disso, foram realizadas análises de seleção positiva, as quais encontraram um alto número de resíduos com altas probabilidades, indicando que estão sob pressão de seleção positiva darwiniana. Com o intuito de compreender a diversidade estrutural destes alelos, foram construídos modelos teóricos com base em modelagem por homologia dos principais clados da filogenia, já que estas sequências apresentam um elevado grau de polimorfismo. Os resultados mostraram grande variação estrutural na região hipervariável destas sequências, enquanto que regiões conservadas não apresentaram grandes mudanças estruturais e com estruturas secundárias características. No Capítulo III, foram realizadas diversas análises com o objetivo de compreender a diversificação estrutural e funcional de RNases T2 na família Solanaceae. As análises filogenéticas mostraram a formação de três principais grupos, sendo um de S-RNases, e os outros dois de S-like RNases. Com relação ao Clado 2, podemos inferir que houveram ao menos dois eventos de duplicação gênica. Além disso, também foram utilizados os métodos de NSsites e branch-site para inferência de seleção positiva como uma forma de identificar possíveis sinais de diversificação molecular. Muitos resíduos parecem estar sob seleção em ambos os métodos, embora um número maior fosse encontrado no NSsites (41), com estes resíduos localizando-se em regiões mais flexíveis da proteína, enquanto que os aqueles selecionados de acordo com o brach-site (8) estavam situados em posições mais rígidas da estrutura. Em súmula, os resultados encontrados nos capítulos que compreendem esta tese demonstram que análises teóricas podem contribuir efetivamente de inúmeras maneiras com o intuito de desenvolver uma melhor compreensão dos fenômenos biológicos relacionados com a evolução molecular de famílias multigênicas, além de também contribuir no entendimento dos processos de diversificação de genes multialélicos, utilizando como modelo de estudo a família gênica RNase T2. / The ribonucleases catalyze the cleavage of RNA and are ubiquitous components of cells, from prokaryotes to eukaryotes. The T2 family is the most widely category of RNases distributed among living organisms. The wide distribution of this family suggests that it should play an important functional role in cell biology of these organisms. Basically, there are two groups of these proteins in Solanaceae, one represented by SRNases, which are involved in the rejection of pollen in gametophytic self-incompatibility and a more diverse group, which is termed S-like RNases with very diverse functions. SRNases are a highly polymorphic and multiallelic gene contained in the S locus. The S locus consists of a combination of SLF proteins (F-box S-locus), responsible for the pollen factor, and one S-RNase expressed only in the pistil, and those genes are tightly linked as an S-haplotype. Products of these genes interact enabling the rejection of self-pollen in a phenomenon called collaborative non-self recognition. In Chapter II, we used phylogenetic methods to determine the main clusters of alleles in the genealogy of SRNase in the Solanum genus. The topology of the tree showed no phylogenetic sign to species delimitation, but it was expected since the diversification of these alleles occurred previously the diversification of the species, generating a phenomenon called trans-specific polymorphism. In addition, analyzes of positive selection were carried out, and it resulted in a significant number of residues with high probability, indicating they are under Darwinian positive selection. In order to understand the structural diversity of alleles, theoretical models were constructed based on homology modeling of the major clades found in the phylogeny, since it has a high degree of polymorphism in these sequences. The results showed that major structural variations are located in the hypervariable regions of these sequences, while conserved regions performed without major structural changes and showed stable secondary structures. In Chapter III, we used several analyzes to understand the structural and functional diversification of RNase T2 in the Solanaceae family. Phylogenetic analyses showed the clustering of three main groups, one with just SRNases and the two others composed by S-like RNases. Regarding to Clade 2, we could infer that at least two gene duplication events have occurred. In addition, we used two methods for inference of positive selection, NSsites and branch-site, as a mean to identify possible signals of molecular diversification. Many residues seem to be under selection in both methods, although a higher number was found in NSsites (41), and these residues were located in more flexible regions of the protein, while those selected according to the brach-site (8) were located at more rigid positions of the structure. In summary, the results found in the chapters of this thesis show that theoretical analyses could effectively contribute in many ways in order to develop a better understanding of biological phenomena related to the molecular evolution of gene families. Also, it contributes to the understanding of the processes related to multiallelic genes diversification, using gene family RNase T2 as a model.

O Bioma Pampa é um dos seis grandes biomas brasileiros, estendendo-se também para a Argentina e o Uruguai. Em termos geomorfológicos, é uma região complexa, pois inclui diversas unidades geradas em contextos tectônicos e paleogeográficos distintos, sendo que é bem conhecida a continuidade geológica entre o Uruguai e RS. A conservação dos campos tem sido negligenciada; ameaçada pelo aumento das áreas com agricultura e silvicultura (pinus e eucalipto), e por uma aplicação leniente da legislação ambiental, como se tais formações naturais abertas não tivessem a mesma importância das florestas. O gênero Petunia Juss. (Solanaceae) tem uma longa história de cruzamentos artificiais, sendo os híbridos de P. axillaris e P. integrifolia mundialmente disseminados como plantas ornamentais conhecidos como petúnias de jardim. P. axillaris possui ampla distribuição geográfica, ocorrendo em todo Bioma Pampa, geralmente em afloramentos rochosos em beira de estrada. Através de caracteres morfológicos da flor, a espécie é dividida em três subespécies: P. axillaris ssp. axillaris, P. axillaris ssp. parodii e P. axillaris ssp. subandina. Nesse trabalho foram realizadas análises moleculares, morfológicas e ecológicas, através do sequenciamento dos espaçadores plastidiais trnS-trnG e trnH-psbA, da medida dos caracteres florais e da utilização de dados climáticos. O trabalho foi realizado com populações naturais abrangendo a área de distribuição da espécie. Os limites geográficos das subespécies são amplamente equivalentes entre os critérios morfológicos e ecológicos; para as subespécies axillaris e parodii, os dados suportam os dois grupos, já em relação às subespécies axillaris e subandina, esta separação é fraca, porque apesar de serem ecologicamente distintas, essas populações não são morfologicamente distintas uma da outra. Os dados de cpDNA não suportam os diferentes grupos, visto que as subespécies compartilham haplótipos, o que sugere divergência recente e retenção de polimorfismo ancestral. Apesar da falta de resolução genealógica e de apresentar estruturação geográfica pouco definida, os dados de cpDNA fornecem informações relevantes em relação à biogeografia da espécie, a qual teria tomado uma vasta proporção geográfica durante os períodos frio e seco do Quaternário, período de expansão dos campos. Os padrões de variação em P. axillaris, principalmente em relação à morfológica, são congruentes com a continuidade geológica entre RS e Uruguai. Mais estudos, com outras espécies, serão 14 relevantes para determinar se existe um padrão geográfico de distribuição das espécies nessa região. / The Pampa is one of the six major Brazilian Biome, covering also the Argentina and Uruguay Countries. Concerning to geomorphology, it is a complex region because includes several units generates in different tectonic and paleogeographic contexts and the geological continuity between Uruguay and Rio Grande do Sul (RS) State is very well known. This Biome is endangered because the increase of agriculture and forestry areas and its conservations has been neglected. There is lax enforcement of environmental legislation and has been given less importance than the rain forests. The genus Petunia Juss. (Solanaceae) has a long history of artificial breeding being the hybrids of the P. axillaris e P. integrifolia worldwide disseminated as ornamental plants and are known as P. X hybrida or garden petunia. P. axillaris has a wide geographic distribution, occurring throughout the Pampa Biome, usually in outcrops and in roadside. Based on morphological characters of the flowers, this species is separated in three subspecies: P. axillaris ssp. axillaris, P. axillaris ssp. parodii e P. axillaris ssp. subandina. In this work were carried out molecular, morphological and ecological analysis by sequencing of cpDNA trnS-trnG e trnH-psbA intergenic spacers, measurement of the floral traits and use of climate data. Natural populations were studied in the whole area of species distribution. The geographical limits of the subspecies are in agreement with morphological and ecological criteria and for ssp. axillaris e ssp. parodii, the data support the two groups. The separation between the ssp. axillaris e ssp. subandina is weak because although they are ecologically distinct, they are not morphologically different. The cpDNA data do not support the exclusivity of these groups since haplotypes were sharing among the three groups, suggesting recent divergence and ancestral polymorphism retention. Despite the lack of genealogical resolution and unclear geographical structure, the cpDNA data provide relevant information about the biogeographic history of this species, which would have occupied a large geographical area during the cold and dry in Quaternary when there was grassland expansion. The patterns of variation in P. axillaris, especially morphological variations, are consistent with the geological continuity between RS and Uruguay. Further studies including others species will be important to determine the existence of a geographic pattern of the species distribution in this region.

Os gêneros Athenaea e Aureliana (Solanaceae) são compostos por sete e oito espécies, respectivamente, e os mesmo são distintos pela presença do cálice acrescente, que envolve o fruto, nas espécies de Athenaea. Suas plantas são arbustos com flores brancas com máculas esverdeadas ou roxas. A espécie mais abundante do grupo é Aureliana fasciculata, que ocorre ao longo de toda a Mata Atlântica. As demais espécies são raras. Athenaea e Aureliana são considerados gêneros irmãos, de acordo com a mais recente análise filogenética da família Solanaceae, e pertencem à subtribo Withaninae. Esta subtribo apresenta uma distribuição intrigante, pois é composta por apenas sete gêneros que ocorrem na América do Sul, Eurásia, norte da África e Ásia, além do arquipélago do Havaí, da Ilha de Santa Helena e das Ilhas Canárias. O objetivo geral deste trabalho foi contribuir para o conhecimento das relações evolutivas entre as espécies dos gêneros Aureliana e Athenaea. Para isso, foram realizadas a análise filogenética e a datação a partir de dados moleculares dos gêneros Athenaea e Aureliana, incluindo os demais gêneros da subtribo Withaninae, além da análise filogeográfica de Aureliana fasciculata. Para as análises filogenéticas foram sequenciadas cinco regiões do genoma plastidial (gene ndhF, intron trnL e os espaçadores plastidiais trnL-trnF, psaI-accD e trnC-ycf6). Os resultados obtidos indicam que a diversificação das espécies dos gêneros Athenaea e Aureliana a partir de um ancestral comum ocorreu cerca de 3,9 milhões de anos atrás. Não foram detectados clados correspondentes a cada um dos gêneros. Para a análise filogeográfica de Aureliana fasciculata foram sequenciados os espaçadores plastidiais trnH-psbA e trnS-trnG. Foram detectados quatorze haplótipos em 112 indivíduos da espécie, que também apresentou sinais de estruturação geográfica, com moderado isolamento por distância. Uma putativa barreira Norte/Sul entre os haplótipos, localizada ao sul do rio Doce (Espírito Santo, Brasil) também foi inferida. Uma expansão populacional há cerca de 50–60 mil anos atrás foi detectada, o que coincide com registros palinológicos de expansão da área florestal na Mata Atlântica. Os eventos históricos que moldaram a distribuição e demografia atual de Aureliana fasiculata são anteriores ao último máximo glacial e parecem estar relacionados a eventos climáticos do Pleistoceno. Por último, foi construída e validada uma biblioteca enriquecida em microssatélites de Aureliana fasciculata. Foram descritos sete pares de ―primers‖ polimórficos, com três alelos por locus, em média, e 6 heterozigosidade observada entre 0,05 e 1,00. A ampliação da amostragem e a utilização de marcadores moleculares de evolução mais rápida poderão trazer informações ainda mais completas sobre a taxonomia e história evolutiva dos gêneros Athenaea e Aureliana. / Athenaea and Aureliana (Solanaceae) genera are composed by seven and eight species, respectively. The character that distinguishes both genera is the presence of acrescent calyx, which involves the fruit, in Athenaea species. The plants are shrubs with white flowers and green or purple stains. The most abundant species of the group is Aureliana fasciculata, which occurs along the Atlantic Rainforest. All remaining species are rare. Both genera are considered as sister groups, according to the most recent phylogenetic analysis of Solanaceae family, and they both belong to subtribe . This group presents a puzzling distribution. It is composed by seven genera that occur in South America, Eurasia, North of Africa and Asia, plus Hawaiian Archipelago and St. Helena and Canary Islands. The main goal of the present study is to contribute to the knowledge of the evolutive relationship among the species of Athenaea and Aureliana. In order to do this, a phylogenetic analysis and molecular dating based on molecular data was performed, including Athenaea and Aureliana species, plus subtribe Withaninae representatives. The phylogeography of Aureliana fasiculata was also investigated. Five plastidial genomic regions (ndhF gene, trnL intron, and trnL-trnF, psaI-accD and trnC-ycf6 intergenic spacers) were employed to the phylogenetic analysis. The obtained result indicates that the diversification of Athenaea and Aureliana species from their common ancestor occurred circa 3.9 million years ago. Clades corresponding to each genus were not detected. The trnH-psbA and trnS-trnG plastidial spacers were employed to perform phylogeographic analysis of Aureliana fasciculata. Fourteen haplotypes were detected among 112 individuals. The species displayed signs of geographic structure and moderate isolation by distance. A putative barrier among North/South haplotypes, located south of the Doce River (Espírito Santo, Brazil), was also inferred. A populational expansion circa 50 – 60 thousand years ago was detected, which agrees with palinological information regarding forest area expansion at the same period at the Atlantic Rainforest. The historical events that shaped the present geographic pattern and domography are older than the Last Glacial Maximum, and they seem to be related to Pleistocene climatic events. At last, a microsatellite-enriched library was constructed and validated to Aureliana fasciculata. Seven pairs of polymorphic microsatellite primers were described, which displayed three alleles per locus, on average, and observed heterozygosity that ranged from 0.05 to 1.00. A broader sampling and the use of rapdly evolving molecular markers may provide more 8 complete information about the taxonomy and evolutive history of Athenaea and Aureliana genera.

Elementos de transposição são caracterizados como segmentos de DNA capazes de mover-se no genoma em que estão inseridos. A diversidade e abundância desses elementos variam de espécie para espécie, sendo sua distribuição nem uniforme, nem aleatória. Com a grande quantidade de informações provenientes de projetos genoma, a busca de um sistema universal para classificação desses elementos é uma constante. Atualmente, elementos de transposição são divididos em duas classes, sendo os elementos da classe I, ou retrotransposons, divididos em cinco ordens. A ordem mais abundante em plantas é a dos LTR retrotransposons, no qual se insere a superfamília Ty1/Copia. Essa superfamília apresenta diversas famílias de elementos, dentre elas a família Tnt1. Tnt1 foi o primeiro elemento de transposição caracterizado na família Solanaceae, sendo um dos retrotransposons mais bem estudados em plantas. Originalmente isolado do genoma de Nicotiana tabacum, elementos similares a Tnt1 já foram encontrados em pimenta, berinjela, tomate, batata, e em petúnias de jardim. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar a diversidade dos retrotransposons com LTR do clado Tork da superfamília Copia, relacionados ao elemento Tnt1, em espécies nativas do gênero Petunia. Para tanto, sequências foram obtidas a partir de reação de PCR com primers já descritos na literatura, com posterior clonagem dos fragmentos obtidos, e sequenciamento dos clones. Um total de 148 sequências únicas foram obtidas de 21 taxa diferentes, incluindo três espécies de Calibrachoa e uma espécie de Fabiana, ambos os gêneros relacionados à Petunia. Análises de relacionamento entre as sequências sugerem a classificação dessas em dez diferentes famílias de retrotransposons com LTR do tipo Copia (RLC), muitas com baixa diferenciação entre as sequências de uma mesma família. Entre essas, uma família de sequências quase que exclusiva de taxa encontrados em substrato com baixa umidade. Para uma visão mais completa, representantes dos diferentes grupos de Tnt1, Retrolyc1, e Retrosol foram incluídos na análise. Foi possível observar que as sequências obtidas no presente trabalho não são compartilhadas entre os elementos dos demais gêneros incluídos. As diferentes sequências aqui obtidas possibilitaram estudos de relacionamento e diversidade, e abrem portas para a utilização desses elementos em estudos subsequentes nos gêneros em questão, assim como em outros gêneros relacionados, uma vez que a conservação de partes do elemento é bastante grande. / Transposable elements are characterized as segments of DNA capable of moving across different parts of the host genome. Diversity and abundance of these elements vary from species to species, and distribution within a genome is usually neither random nor uniform. The amount of information resulting from genome projects demands a universal system for transposable elements’ classification. Nowadays, these elements are classified into two classes, with class I elements, or retrotransposons, being divided into five orders. The most abundant order in plants is the LTR retrotransposons order, in which the Ty1/Copia superfamily is classified. Ty1/Copia presents several families, being the Tnt1 family one of them. Tnt1 was the first transposable element characterized in Solanaceae, being the most well known retrotransposon in plants. Originally isolated from Nicotiana tabacum, Tnt1-related elements have been reported in peppers, eggplant, tomato, potato, and petunias. Therefore, the aim of this work was to characterize the diversity of LTR retrotransposons from the Tork clade of the Copia superfamily, related to Tnt1 elements, in wild Petunia species. Thereunto, sequences were retrieved from PCR reactions with primers previously described, cloned into competent cells. A total of 148 unique sequences were obtained from 21 different taxa, including three Calibrachoa and one Fabiana species, both genera closely related to Petunia. Relationship analysis among sequences suggests their classification into ten families of retrotransposons with LTR from Copia superfamily (RLC), most of low sequence diversity within a family. Among all families, one clade of sequences presented almost exclusively sequences of taxa find under substrates of low humidity conditions. For a more complete view, Tnt1, Retrolyc1, and Retrosol representatives were included in the analysis. Sequences retrieved in the present work are not shared among elements of remaining genera included. The diversity of sequences obtained here made relationship and diversity studies possible, and may be used in further investigations of the genera here studied, as well as in other related genera, since there are conserved fragments along these elements.

As ribonucleases catalisam a clivagem do RNA e são componentes ubíquos das células, desde procariotos até eucariotos. A família T2 é a classe de RNases mais amplamente distribuída entre os organismos vivos. A ampla distribuição desta família sugere que ela deve ter um papel funcional muito importante na biologia celular destes organismos. Em Solanaceae, há basicamente dois grupos destas proteínas, um representado pelas S-RNases, as quais estão envolvidas com a rejeição do pólen na autoincompatibilidade gametofítica e um outro grupo mais diverso que é denominado de S-like RNases, com funções muito diversificadas. As S-RNases se apresentam na forma de um gene multialélico, altamente polimórfico, que está contido no lócus S. O lócus S é composto por uma combinação de proteínas SLF (S-locus F-box), responsáveis pela determinação do fator polínico, e uma S-RNase produzida apenas no pistilo, de forma que estes genes estão fortemente ligados formando o haplótipo S. Esses produtos gênicos interagem possibilitando a rejeição do auto-pólen num fenômeno denominado distinção colaborativa do pólen não próprio. No Capítulo II, foram utilizados métodos filogenéticos para determinar os principais agrupamentos de alelos na genealogia de S-RNases do gênero Solanum. A topologia da árvore não mostrou sinal filogenético para espécies, contudo, isso era esperado uma vez que a diversificação destes alelos ocorreu anteriormente à diversificação das espécies, gerando um fenômeno denominado de polimorfismos trans-específicos. Além disso, foram realizadas análises de seleção positiva, as quais encontraram um alto número de resíduos com altas probabilidades, indicando que estão sob pressão de seleção positiva darwiniana. Com o intuito de compreender a diversidade estrutural destes alelos, foram construídos modelos teóricos com base em modelagem por homologia dos principais clados da filogenia, já que estas sequências apresentam um elevado grau de polimorfismo. Os resultados mostraram grande variação estrutural na região hipervariável destas sequências, enquanto que regiões conservadas não apresentaram grandes mudanças estruturais e com estruturas secundárias características. No Capítulo III, foram realizadas diversas análises com o objetivo de compreender a diversificação estrutural e funcional de RNases T2 na família Solanaceae. As análises filogenéticas mostraram a formação de três principais grupos, sendo um de S-RNases, e os outros dois de S-like RNases. Com relação ao Clado 2, podemos inferir que houveram ao menos dois eventos de duplicação gênica. Além disso, também foram utilizados os métodos de NSsites e branch-site para inferência de seleção positiva como uma forma de identificar possíveis sinais de diversificação molecular. Muitos resíduos parecem estar sob seleção em ambos os métodos, embora um número maior fosse encontrado no NSsites (41), com estes resíduos localizando-se em regiões mais flexíveis da proteína, enquanto que os aqueles selecionados de acordo com o brach-site (8) estavam situados em posições mais rígidas da estrutura. Em súmula, os resultados encontrados nos capítulos que compreendem esta tese demonstram que análises teóricas podem contribuir efetivamente de inúmeras maneiras com o intuito de desenvolver uma melhor compreensão dos fenômenos biológicos relacionados com a evolução molecular de famílias multigênicas, além de também contribuir no entendimento dos processos de diversificação de genes multialélicos, utilizando como modelo de estudo a família gênica RNase T2. / The ribonucleases catalyze the cleavage of RNA and are ubiquitous components of cells, from prokaryotes to eukaryotes. The T2 family is the most widely category of RNases distributed among living organisms. The wide distribution of this family suggests that it should play an important functional role in cell biology of these organisms. Basically, there are two groups of these proteins in Solanaceae, one represented by SRNases, which are involved in the rejection of pollen in gametophytic self-incompatibility and a more diverse group, which is termed S-like RNases with very diverse functions. SRNases are a highly polymorphic and multiallelic gene contained in the S locus. The S locus consists of a combination of SLF proteins (F-box S-locus), responsible for the pollen factor, and one S-RNase expressed only in the pistil, and those genes are tightly linked as an S-haplotype. Products of these genes interact enabling the rejection of self-pollen in a phenomenon called collaborative non-self recognition. In Chapter II, we used phylogenetic methods to determine the main clusters of alleles in the genealogy of SRNase in the Solanum genus. The topology of the tree showed no phylogenetic sign to species delimitation, but it was expected since the diversification of these alleles occurred previously the diversification of the species, generating a phenomenon called trans-specific polymorphism. In addition, analyzes of positive selection were carried out, and it resulted in a significant number of residues with high probability, indicating they are under Darwinian positive selection. In order to understand the structural diversity of alleles, theoretical models were constructed based on homology modeling of the major clades found in the phylogeny, since it has a high degree of polymorphism in these sequences. The results showed that major structural variations are located in the hypervariable regions of these sequences, while conserved regions performed without major structural changes and showed stable secondary structures. In Chapter III, we used several analyzes to understand the structural and functional diversification of RNase T2 in the Solanaceae family. Phylogenetic analyses showed the clustering of three main groups, one with just SRNases and the two others composed by S-like RNases. Regarding to Clade 2, we could infer that at least two gene duplication events have occurred. In addition, we used two methods for inference of positive selection, NSsites and branch-site, as a mean to identify possible signals of molecular diversification. Many residues seem to be under selection in both methods, although a higher number was found in NSsites (41), and these residues were located in more flexible regions of the protein, while those selected according to the brach-site (8) were located at more rigid positions of the structure. In summary, the results found in the chapters of this thesis show that theoretical analyses could effectively contribute in many ways in order to develop a better understanding of biological phenomena related to the molecular evolution of gene families. Also, it contributes to the understanding of the processes related to multiallelic genes diversification, using gene family RNase T2 as a model.

A cultura da batata (Solanum tuberosum L.) é a terceira fonte principal de alimento humano do mundo, posteriormente ao trigo e arroz. No Brasil, é a olerícola com maior área plantada e gera cerca de 160 mil empregos diretos e indiretos. A batateira é afetada por doenças transmitidas por patogénos do solo, ocasionando a migração da cultura para áreas nunca cultivadas ou sem o plantio de Solanaceae de dois a cinco anos consecutivos. A murcha bacteriana, causada pelo complexo de bactérias da Ralstonia spp., é uma das principais doenças que afetam a cultura da batata no mundo. No Brasil, o sistema convencional de produção de batata, adotado em quase totalidade nacional, gera condições ambientais ideias para a proliferação e desenvolvimento do complexo da Ralstonia ssp.. Dessa forma, precisam ser estudados sistemas alternativos de produção que reduzam a incidência de murcha bacteriana e cessem a migração contínua da cultura da batata. O aumento da biodiversidade e abundância dos microrganismos no solo é capaz de suprimir a ação dos patógenos nativos do solo. Para isso, são necessárias práticas de manejo que aumentem ou mantenham a matéria orgânica do solo, como a rotação e sucessão de culturas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade supressiva do solo à murcha bacteriana nos sistemas alternativos de produção de batata, Paces e orgânico, em comparação ao sistema convencional, sistema não-perturbado sob vegetação natural e solo esterilizado. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, com três repetições, em esquema fatorial 4 x 4 + 1; o primeiro fator representou os solos sob diferentes sistemas de produção, enquanto o segundo correspondeu às doses de 0,25, 50 e 75% de solo contaminado com R. solanacearum adicionadas a cada tratamento. O tratamento adicional constituiu-se do solo do sistema convencional com alta incidência de R. solanacearum. Concluiu-se que a dose de 75% foi a que melhor representou a capacidade supressiva do solo à murcha bacteriana para todos os tratamentos. Nessa dose, as maiores incidências de plantas com sintomas de murcha foram para os solos autoclavado e convencional, que não diferiram entre si. O Sistema Paces, dentre todos os estudados, foi o que apresentou maior potencial de supressividade do solo à murcha bacteriana na batateira. / The potato crop (Solanum tuberosum L.) is the third most important source of human food in the world, after wheat and rice. In Brazil, it is the vegetable with largest area of growing and generates about 160 thousand direct and indirect jobs. The potato is affected by diseases transmitted by soil pathogens, causing the migration of the crop to areas never cultivated or without Solanaceaes from two to five consecutive years. The bacterial complex of Ralstonia spp., is one of the major diseases affecting the potato culture in the world. In Brazil, the conventional system of potato production, adopted in almost national conditions, promotes environmental conditions for the proliferation and development of the Ralstonia ssp. complex. In this way, alternative systems of production that reduce the incidence of bacterial wilt and decrease the intensity of the culture should be studied. Increased biodiversity and abundance of microorganisms in the soil is capable of suppressing an action of native soil pathogens. For this, management practices are applied that increase or decrease the production of soil extracts and of expression in bacteria in the alternative systems of production of potatoes, Paces and organic, were compared to conventional, unperturbed system in natural vegetation and sterilized soil. The experimental design was a randomized block design with three replications, in a 4 x 4 + 1 factorial scheme, the first factor represented the soils under different systems of production, while the second corresponded to the doses of 0.25, 50 and 75% of soil contaminated with R. solanacearum added to each action. The additional was conventional soil with high incidence of R. solanacearum. It was concluded that a dose of 75% was the one that best represented a suppressiveness capacity of the soil to bacterial wilt in all the treatments, to the extent that the incidence of plants with wilt were for the treatments of autoclaved and conventional soil, that did not differ each other. The Paces System, was the one that had the greater potential of soil suppressiveness to the bacterial wilt in the potato.

Solanum sisymbriifolium (sticky nightshade) is a shrubby weed of South American origin that was introduced to South Africa at the turn of the century. Despite being indicative of disturbed habitats, the weed was found to be invasive in conservation, agricultural recreational and suburban areas; this, coupled with the failure of both chemical and mechanical control attempts suggested that the weed was a good candidate for biological control. A biological control programme which followed a standard protocol was initiated. Observations suggested that S. sisymbriifolium dispersed primarily by seeds. Plants produced large quantities of fleshy fruit, favoured by frugivorous birds, which facilitated the rapid spread of the weed into new habitats. The seeds germinated quickly, especially in disturbed soil, often below the parent plant where they dropped from burst fruit, and along fences where birds roost. The pre-introductory survey of the weed revealed that S. sisymbriifolium was attacked by a relatively small number of, mainly polyphagous, herbivorous insects. These were localised and sporadic in incidence and inflicted very little observable damage. The herbivore fauna of S. sisymbriifolium was depauperate even in relation to two other exotic weeds, S. elaeaglllfolium and S. mauritianum, in South Africa. The paucity of native herbivores on S. sisymbriifoliwn was ascribed to a combination of the weed's taxonomic distinctness from South African Solanum species, and the dense covering of glandular trichomes on its leaves. Although it was shown that the exudate produced by these glandular trichomes of S. sisymbriifolium seriously impeded the movement and feeding of native herbivores, there was not enough evidence to suggest that the glandular trichomes, alone could have been responsible the lack of herbivores on the weed. Two leaf-feeding Cassidinae Gratiana spadicea and MetJ-iona elatior were screened as agents for the biological control of S. sisymbrilfolium. Favourable biological characteristics for both species included a high rate of increase, long-lived adults, many generations per year, and a high per capita feeding rate. Host range was investigated in larval survival tests and adult choice tests. The larvae of both species were reared through to the adult stage on several of the native Solanum species tested, and also on eggplant (S. melongena). However, the survival of G. spadicea on the majority of these species was very low, suggesting that the beetles would be unlikely to attack them in the field. This was supported by the adult choice tests, where G. spadicea females displayed, a strong oviposition preference for their natural host. In contrast, M. elatior larvae survived well on non-host plants, and the females selected several non-host species, including eggplant for oviposition. It was argued that the conflict of interests involving eggplant was overrated because eggplant is subjected to a stringent insecticide spray regime. Based on this evidence, permission for release was granted for G. spadicea. The impact of native parasitoid host range extensions to weed biological control agents in South Africa was investigated. Native parasitoids were recorded from nearly half of the agent species that had established on their target weed. The level of concealment and taxon influenced susceptibility of the agents to parasitoid attack Poorly concealed endophagous agents were most susceptible to attack, while exposed feeders were fairly free from attack. However, native parasitoids were reported not to strongly influence weed biological control agent populations and it was concluded that no agent should be rejected based only on its susceptibility to native parasitoid attack. Finally, several predictions are made as to the potential success of G. spadicea on S. sisymbriifolium and some of the challenges facing the biological control of weeds are discussed.

Call number: LD2668 .T4 1948 M33 / Master of Science

As vitafisalinas sÃo lactonas esteroidais (C28), estruturalmente baseadas no esqueleto do ergostano, comumente encontradas em plantas da famÃlia Solanaceae. A fim de avaliar as propriedades anticÃncer desses compostos, cinco vitafisalinas [O, F, M, N e (17S, 20R, 22R) -5 β, 6β :18,20-2-diepÃxi β-4, 18 - diidrÃxi-1 - oxovita-3-24-enolido] isoladas da Acnistus arborescens, planta tÃpica do nordeste brasileiro, foram analisadas utilizando diversos modelos biolÃgicos. Todas as cinco vitafisalinas mostraram efeitos citotÃxicos em linhagens de cÃlulas tumorais, sendo a vitafisalina O a mais potente e a vitafisalina (17S, 20R, 22R) -5 β, 6β :18,20-2-diepÃxi β-4, 18 - diidrÃxi-1-oxovita-3 - 24-enolido) a menos potente. Ao compararmos as estruturas quÃmicas das vitafisalinas e suas atividades, foi observado que a ligaÃÃo dupla entre os carbonos 2 e 3 à essencial para os efeitos citotÃxicos desses compostos. No entanto, as vitafisalinas (O, F e N) nÃo mostraram qualquer especificidade para linhagens tumorais, jà que tambÃm apresentaram efeitos citotÃxicos e genotÃxicos, semelhantes, em cÃlulas leucÃmicas (HL-60) e em cÃlulas normais (PBMC). A viabilidade celular e curvas de crescimento foram determinadas, para as linhagens de HL-60 e K-562, utilizando o ensaio de exclusÃo de azul de tripan. As vitafisalinas O, F, M e N reduziram o nÃmero de cÃlulas viÃveis de modo dose e tempo dependente, apresentando valores de CI50 variando de 0,7 a 3,5 μM apÃs 72 horas de incubaÃÃo. Nas mesmas linhagens leucÃmicas, as vitafisalinas tambÃm inibiram a sÃntese de DNA, causaram alteraÃÃes morfolÃgicas tÃpicas de apoptose, e apenas na linhagem HL-60 induziram a ativaÃÃo da caspase-3. AlÃm disso, foi realizado, em cÃlulas de HL-60, a anÃlise da integridade da membrana celular, distribuiÃÃo do ciclo celular, fragmentaÃÃo de DNA e o potencial transmembrÃnico de mitocÃndria, utilizando citometria de fluxo. Nestes experimentos, as vitafisalinas O e F, somente na concentraÃÃo de 10 μM, reduziram o nÃmero de cÃlulas viÃveis para 60 e 40%, respectivamente. Na anÃlise do ciclo celular, ambas vitafisalinas, na concentraÃÃo de 5 μM, causaram um acÃmulo de cÃlulas na fase G2/M do ciclo celular. Ambas vitafisalinas tambÃm causaram um aumento significativo do nÃmero de cÃlulas apresentando fragmentaÃÃo de DNA. Os resultados da anÃlise do potencial transmembrÃnico de mitocÃndria mostraram um aumento na despolarizaÃÃo de 4,7, 17,5 e 9,1% causado pela vitafisalina O e de 7,6, 16,6 e 5,6% pela vitafisalina F. O efeito antitumoral (in vivo) da vitafisalina F foi analisado em camundongos transplantados com o tumor Sarcoma 180, nas doses de 5, 10 e 20 mg/Kg/dia por via intraperitoneal e na dose de 20 mg/Kg/dia por via oral. O crescimento do tumor foi inibido em mais de 76% na maior doses testada (20mg/Kg/dia), tanto por via intraperitoneal quanto por via oral. A anÃlise histopatolÃgica dos ÃrgÃos dos animais mostraram que a vitafisalina F provoca efeitos tÃxicos moderados, principalmente no fÃgado e nos rins, mas esses podem ser considerados como reversÃveis. Tendo em vista todos estes dados, pode concluir-se que as vitafisalinas podem ser consideradas como uma classe emergente de novos compostos anticÃncer. / Withaphysalins are C28-steroidal lactones structurally based on the ergostane skeleton commonly found in Solanaceae species. In order to evaluate the anticancer properties of these compounds, five withaphysalins [O, F, M, N and (17S,20R,22R)-5β,6β: 18,20-diepoxy-4β,18-dihydroxy-1-oxowitha-24-enolide] isolated from Acnistus arborescens, a plant from the northeastern Brazilian flora, were analyzed in several biological models. All five withaphysalins showed cytotoxic effects against tumor cell lines, being withaphysalin O the most potent and withaphysalin (17S,20R,22R)-5β,6β: 18,20-diepoxy-4β,18-dihydroxy-1-oxowitha-24-enolide, the less potent. Based on these results, its shown that a double-bond between carbons 2 and 3 is essential for the cytotoxic activity of withaphysalins. Withaphysalins (O, F and N) did not show any specificity to tumor cell lines, showing similar cytotoxic and genotoxic effects against leukemic cells (HL-60) and normal cells (PBMC). Cell viability and growth curves of HL-60 and K-562 treated cells were determined using trypan blue exclusion assay, where all withaphysalins reduced the number of viable cells in a dose-and time-dependent fashion, with IC50 values ranging from 0.7 to 3.5 μM after 72 h of incubation. In HL-60 and K-562 cells, the withaphysalins inhibited DNA synthesis, induced morphological alterations, typical of apoptosis, and only in the HL-60 cell line, and they induced activation of caspase-3. Moreover, it was performed the analyzes of cell membrane integrity, cell cycle distribution, DNA fragmentation and the mitochondrial membrane potential using flow citometry. In these experiments, withaphysalins O and F, only at concentration of 10ÂM, reduced the number of viable cells to 60 and 40% respectively. In the cell cycle analysis, both withaphysalins led to a cell cycle arrest at G2/M, at the concentration of 5μM. Cells treated with both withaphysalins also showed a significant increase in DNA fragmentation when compared to the negative control. Results of the mitochondrial transmembrane potential showed depolarization changes in accordance to the tested concentration (2.5, 5 and 10μg/mL) with 4.7, 17.5 and 9.1% for withaphysalin O and 7.6, 16.6 and 5.6% for withaphysalin F, respectively. The in vivo antitumor effects of withaphysalin F was performed in animals bearing the sarcoma 180 tumor, and at the highest dose tested (20mg/Kg/day), growth tumor was inhibited in 77%. Histopatological analysis of mice organs showed that withaphysalin F causes moderate toxic effects mostly in liver and kidney, but they may be considered reversible effects. Taking in account all these data, it can be concluded that withaphysalins could be considered as an emerging class of new anticancer compounds.