La détection et l’identification de micro-organismes pathogènes est un réel enjeu de santé public tant au niveau alimentaire, que clinique ou d’intérêt national tel qu’illustré en biodéfense. Dans tous ces domaines, il est important d‘avoir des méthodes d’identification et de détection qui soient à la fois rapide, sensible et robuste. Cette thèse a pour objectif de contribuer au développement d’une approche rapide d’identification de micro-organismes sans a priori par spectrométrie de masse en tandem. Cette approche innovante, appelée phylopeptidomique, repose sur l’alliance de la peptidomique, i.e. analyse à large échelle des peptides provenant de la digestion enzymatique d’un échantillon biologique, et de la phylogénie des organismes cellulaires. Après extraction des protéines présentes dans l’échantillon à ausculter, des peptides sont générés et analysés par spectrométrie de masse en tandem. La déconvolution des signaux MS/MS à l’aide du logiciel « µOrg.ID » développé en propre au laboratoire permet d’identifier et quantifier les organismes présents dans l’échantillon en fonction des organismes indexés dans les bases de données. L’étude du protéome de Bacillus atrophaeus, agent simulant de l’anthrax, sous forme sporulée et végétative a permis d’illustrer une méthode d’identification de biomarqueurs protéiques permettant de déterminer le ratio entre les deux formes dans un échantillon. La limite de détection de la phylopeptidomique dans des échantillons purs et des échantillons en mélange équimolaire a été établie sur des bactéries modèles d’intérêts médical et environnemental. La limite de détection de spores de Bacillus atrophaeus en présence de 14 matrices interférentes (alimentaires, environnementales et autres) a permis de mettre en évidence les avantages et limitations de l’approche. Enfin, un mélange artificiel standardisé de 24 organismes a été développé afin d’évaluer les outils de bio-informatique en métaprotéomique. / The detection and identification of pathogenic microorganisms is a real public health issue for the food industry and the clinics or national interest as illustrated in the biodefense field. Thus, it is important to have identification and detection methods that are fast, sensitive and robust. This PhD thesis aims at contributing to the development of a rapid approach to identify microorganisms without any a priori by tandem mass spectrometry. This innovative approach, called phylopeptidomics, is based on the combination of peptidomics, i.e. large scale analysis of peptides derived from the enzymatic digestion of a biological sample, and the phylogeny of cellular organisms. After extraction of the proteins from the sample of interest, peptides are generated and analyzed by tandem mass spectrometry. The deconvolution of MS/MS signals using the "μOrg.ID" software developed in the laboratory enables the identification and quantification of organisms present in the sample according to the organisms indexed in generalist databases. The study of the proteome of Bacillus atrophaeus, a simulant agent of anthrax, in sporulated and vegetative form, has provided an illustration of a new method of identification of protein biomarkers, which allows determining the ratio between both forms. The limit of detection of phylopeptidomics in pure samples and equimolar mixtures was established with model bacteria of medical and environmental interests. The limit of detection of B. atrophaeus spores in the presence of 14 interfering matrices (food, environmental and others) has highlighted the advantages and limitations of the approach. Finally, a standardized artificial mixture of 24 organisms was developed in order to evaluate bioinformatics tools in metaproteomics.

Les α-oléfines linéaires sont des intermédiaires particulièrement importants dans l'industrie chimique et pétrochimique. Elles ont des applications variées mais sont utilisées principalement en tant que co-monomère dans la production de diverses qualités de polyéthylène. Dans ce cadre, ce sont les α-oléfines courtes (butène-1, hexène-1 et octène-1) qui sont les plus intéressantes. Aujourd’hui les α-oléfines sont produites très majoritairement par oligomérisation de l’éthylène en catalyse homogène selon deux types de procédés : Les procédés dits « on-purpose » et ceux dits « full-range ». Les procédés « on-purpose » sont sélectifs vis-à-vis d’une α-oléfine et fonctionnent avec des systèmes au chrome ou au titane. Le mécanisme décrit dans ce cas-là est de type métallacyclique. Les procédés « full-range » quant à eux permettent d’obtenir une large distribution d’α-oléfine et les procédés de ce type font intervenir des catalyseurs de nickel, de fer ou de zirconium. Le mécanisme ici est de type polymérisation dégénérée.L’objectif de cette thèse est de développer un système au Ni qui serait actif en oligomérisation de l’éthylène via un mécanisme de type métallacyclique et qui permettrait donc d’atteindre des sélectivités importantes. Dans le mécanisme métallacyclique l’étape clé est le couplage oxydant de deux molécules d’éthylène dans laquelle le degré d’oxydation du métal passe de n à n+2. Dans cette thèse les couples Ni 0/Ni II et Ni I/Ni III ont été considérés. Des précurseurs de Ni0 et NiI possédants des ligands aux propriétés variées ont été synthétisés et testés en réacteur sous forte pression d’éthylène selon différentes méthodes d’activations. Des études mécanistiques ont été réalisées grâce à différentes techniques analytiques à savoir les spectroscopies RMN et RPE, et un développement important a été réalisé en spectrométrie de masse afin de pouvoir observer des intermédiaires réactionnels. La majorité des résultats expérimentaux ont pu être rationnalisés à travers des études théoriques (DFT) permettant de faire émerger des systèmes catalytiques originaux associés à des voies d’accès et des chemins réactionnels différentiant. / Linear α-olefins are very important intermediates in the chemical and petrochemical industries. They have various applications but they are mainly used as co-monomers in the production of various grades of polyethylene. In this topic, the short LAOs (1-butene, 1-hexene and 1-octene) are the most interesting. Today LAOs are almost exclusively produced by ethylene oligomérisation with homogenous catalysts and there are two different industrial processes : “On purpose” and “Full-range” processes. “On purpose” processes are selective toward an α-olefin and catalyst used are based on Ti or Cr complexes. The mechanism described with these types of catalysts is a metallacyclic mechanism. On the other hand ethylene oligomérisation with “full-range” processes is done mainly with Ni or Zr catalysts. In these case a large distribution of olefins is obtained and the mechanism described is a degenerative polymerisation mechanism. The aim of this thesis is to develop a Ni-based system which is active in ethylene oligomérisation through a metallacylcic mechanism in order to access good selectivity toward LAOs. In the metallacyclic mechanism the key step is the oxidative coupling of the two ethylene molecules in which the oxidation state of the metal goes from n to n+2. The couples Ni0/NiII and NiI/NiIII has been investigated in this thesis. Ni 0 and Ni I precursors with various ligands have been synthesized and tested in a semi-batch reactor under high pressure of ethylene with various activation methods. Mechanistic studies have been made using various analytical methods such has NMR and EPR spectroscopies and a big effort has been made in the development of a mass spectrometry method to observe reactive intermediates. In addition, almost all the experimental observations have been rationalized thanks to molecular modeling by DFT.

En raison du vieillissement de la population, la maladie d’Alzheimer (MA) est devenue un problème majeur en santé public. Le dosage des biomarqueurs présents dans le liquide céphalorachidien (Ab 1-42, tau et hepcidine) étant de bons indicateurs précoces de l’apparition et de l’évolution de la MA, il paraît essentiel de disposer de mesures fiables. Etablir la traçabilité métrologique des résultats aux unités du système international par le biais de méthodes de référence primaires ou de matériaux de référence certifiés d’ordre supérieur est un moyen privilégié pour évaluer et améliorer la fiabilité et la comparabilité des résultats dans le temps et entre les laboratoires. Des méthodes de dosages par LC-MS/MS pour ces trois biomarqueurs ont été développées et validées. Pour le dosage de l’hepcidine, la pureté de l’étalon peptidique a fait l’objet d’une caractérisation approfondie par spectrométrie de masse haute résolution qui permettra de standardiser les dosages de routine à l’échelle internationale.Mots clés : Peptides b amyloïdes, Protéine tau, Hepcidine, Biomarqueurs, Protéomique Clinique, Traçabilité métrologique, Spectrométrie de masse / Due to the aging of population, Alzheimer’s disease (AD), is becoming a major public health concern. Measurement of biomarkers (Amyloid Beta, tau and hepcidin) in cerebrospinal fluid being early diagnostic indicators of AD, reliable measurements are needed to detect and quantify them accurately. Establishing metrological traceability of results to the International System of Units through primary reference methods or higher-order certified reference materials is a privileged mean to assess and improve results accuracy and comparability across laboratories. Assays for these three biomarkers were set up and validated by LC-MS/MS. The hepcidin standard was further characterized by high resolution mass spectrometry, paving the road toward standardization at the international scale of results.Key words : b amyloids peptides, Tau protein, Hepcidin, Biomarkers, Clinical proteomic, Metrological traceability, Mass spectrometry

La forme la plus sévère de paludisme est causée par le parasite unicellulaire P. falciparum. Lors de la phase intra-érythrocytaire de son développement, P. falciparum met en place des fonctions métaboliques nécessaires à son développement dans l'érythrocyte, à sa multiplication et enfin à sa dissémination vers d'autres érythrocytes. Comprendre et élucider les structures et les dynamiques du réseau métabolique chez le parasite, permettent de découvrir de nouvelles voies métaboliques et des étapes clefs qui peuvent jouer un rôle important dans le développement du parasite. Elles permettent également de déterminer le mécanisme d'action des agents antipaludiques et de mieux comprendre les résistances associées aux traitements existants. Dans cet objectif, une approche métabolomique ciblée, utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) a été utilisée. Cette approche consiste en une quantification absolue de métabolites impliqués dans les voies de biosynthèse des phospholipides membranaires du parasite mais également d'autres métabolites qui reflètent son statut métabolique. Nous avons dans un premier temps, déterminé les distributions et les quantités absolues des métabolites présents dans un érythrocyte infecté par P. falciparum en comparaison avec un érythrocyte sain. Nous avons également mis en évidence les perturbations causées par cette infection sur le métabolisme de l'érythrocyte humain ainsi que les différents échanges qu'entretien le parasite avec sa cellule hôte mais également avec le milieu extracellulaire. Le métabolisme phospholipidique de Plasmodium est complexe car il possède plusieurs voies de synthèses opérant à partir de précurseurs initiaux distincts et conduisant à la synthèse d'un même produit final. Dans l'objectif d'étudier la contribution relative des différentes voies métaboliques dans la biosynthèse des phospholipides majoritaires chez P. falciparum (PC et PE), nous avons développé une approche qui consiste à incuber les érythrocytes infectés en présence de précurseurs marqués. / The most severe form of malaria is caused by the single-celled parasite P. falciparum. During the intra-erythrocytic stage of its development, P. falciparum implements several metabolic functions necessary for its development in the erythrocyte, its multiplication and finally to its spread to other erythrocytes. Understand and elucidate the structures and the dynamics of the parasite's metabolic network is useful to discover new metabolic pathways and key steps that may play an important role in the development of the parasite. They also help determine the mechanism of action of antimalarial agents and better understand the resistances associated with available treatments. For this purpose, a targeted metabolomics approach, using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was used. This approach consists of an absolute quantitation of metabolites involved in the biosynthesis of membrane phospholipids of the parasite but also other metabolites that reflect its metabolic status. We initially determined the distributions and the absolute amounts of metabolites in infected erythrocytes in comparison with healthy erythrocytes. We also highlighted the disruption caused by this infection on the metabolism of the human erythrocyte and the various interactions between the parasite and its host cell as well as the extracellular medium. The phospholipids metabolism of Plasmodium is complex because it has several synthetic pathways operating from separate initial precursor and leading to the synthesis of a single end product. With the aim to study the relative contribution of these different metabolics pathways in the biosynthesis of the most important phospholipids in P. falciparum (PC and PE), we have developed an approach that involves incubation of infected erythrocytes in the presence of labeled precursors.

L'écosystème aquatique est le résultat d'un équilibre entre l'environnement naturel et les organismes qui s'y développent. Cet équilibre peut être modifié par l'introduction de substances chimiques dues aux activités humaines. Aujourd'hui, l'impact de cette micropollution est encore mal connu, particulièrement pour les organismes constituant les premiers maillons des chaînes trophiques qui requièrent des efforts analytiques importants en raison de leur faible taille. L'objectif de ces travaux est centré sur le développement, la validation et l'application d'outils analytiques permettant d'étudier la bioaccumulation et la biotransformation de polluants émergents chez des invertébrés benthiques. Cette étude s'est focalisée sur 3 organismes aquatiques d'eau douce : C. riparius, G. fossarum et P. antipodarum. Une méthode analytique pour la quantification de 35 polluants émergents chez les 3 espèces sélectionnées a ainsi été développée. Elle permet d'accéder aux premières données de bioaccumulation des substances d'intérêts à l'échelle d'un individu grâce à la mise en oeuvre d'une stratégie analytique entièrement miniaturisée, incluant une extraction MicroQuEChERS suivie d'une analyse par nanochromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Afin de mieux comprendre l'impact d'une telle pollution sur les espèces sélectionnées et d'obtenir une vue globale des capacités de biotransformation de celles-ci, une approche métabolomique a été mise en place. Enfin, un nouveau mode de quantification par MRM3 a été utilisé pour dépasser la complexité de telles matrices, et fournir une évaluation fiable des cinétiques de bioaccumulation de potentiels traceurs de pollution anthropique / The aquatic ecosystem is the result of a balance between the natural environment and the organisms that inhabit it. This balance can be modified by the input of excessive amount of substances generated from human activities. Nowadays, the impact of this pollution is still little known, especially regarding the risk of bioaccumulation in the first trophic levels. This lack of data could be partially explained by the lack of suitable analytical method for small organisms. In this context, the aim of this study is to establish the development, the validation and the application of analytical tools for the assessment of bioaccumulation and biotransformation of emerging pollutants in freshwater invertebrates. Three benthic invertebrates are chosen for this project: C. riparius, G. fossarum and P. antipodarum. Analytical method has been developed for the quantification of 35 emerging pollutants in the selected species. This method provides the first bioaccumulation data of targeted substances in individual scale through the implementation of miniaturized analytical strategy, including an extraction step based on MicroQuEChERS followed by nanoliquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry analysis. To better understand the impact of such pollution and to obtain a global view of the biotransformation capacities of the selected organisms, metabolomics approach has been put in place. Finally, a new quantification mode based on MRM3 was used to overcome biotic matrix complexity and assess the bioaccumulation kinetics of potential tracers of anthropic pollution

La sonde spatiale européenne Rosetta, après un voyage de dix années, a rejoint le 6 août 2014 son objet d’étude, la comète 67P/Churyumov-Gerasimenko (67P/C-G). Afin de l’étudier de manière intensive durant deux ans, un total de 21 instruments était embarqué sur l’orbiteur Rosetta et l’atterrisseur Philae. Le spectromètre de masse d’ions secondaires à temps de vol, COSIMA (COmetary Secondary Ions Mass Analyzer), était l’un des instruments de l’orbiteur et a été conçu pour analyser in situ la composition chimique des particules solides éjectées de la comète 67P/C-G. L’objectif de cette thèse est de caractériser la composante organique réfractaire contenue dans les poussières cométaires, à l’aide de l’instrument COSIMA. Dans le cadre de ces travaux, j’ai mis au point au point et appliqué une méthodologie pour analyser les spectres de masse cométaires, plus particulièrement dans le mode positif de l’instrument. A l’aide de cette méthodologie, cinq ions organiques d’origine cométaire ont été détectés et identifiés : C+ (m/z = 12,00), CH+ (m/z = 13,01), CH2+ (m/z = 14,02), CH3+ (m/z = 15,02) et C2H3+ (m/z = 27,02). La caractérisation de cette composante organique a été effectuée à l’aide de spectres de masse de calibration. Les composés de référence utilisés dans ces travaux de thèse incluent des molécules organiques pures et des analogues de la matière organique cométaire, tels que des échantillons naturels (des météorites carbonées, une micrométéorite ultracarbonée, de la matière organique insoluble extraite de météorites carbonées) et un échantillon synthétisé en laboratoire. La matière organique insoluble extraite des chondrites carbonées est, à ce jour, le meilleur analogue à la matière organique réfractaire contenue dans les particules de 67P/C-G. Ainsi, la matière organique cométaire serait de haut poids moléculaire et le carbone lié dans de grandes structures macromoléculaires. Le carbone est également l’un des éléments le plus abondant dans les particules avec un rapport C⁄Si = 5,5 (+1,4/-1,2). La comète 67P/C-G figure ainsi parmi les corps les plus riches en carbone du système solaire. Enfin, un composé spécifique a été recherché, le polyoxyméthylène. Cependant, les indicateurs développés et appliqués aux données cométaires ne permettent pas de conclure quant à sa présence dans les particules analysées par COSIMA / After a ten-year journey, the European spacecraft Rosetta arrived at comet 67P/Churyumov-Gersasimenko (67P/C-G) on August 6, 2014. In order to conduct intensive research for two years, a total of 21 instruments were on board the Rosetta orbiter and the Philae lander. The time-of-flight secondary ions mass spectrometer, COSIMA (COmetary Secondary Ions Mass Analyzer), was one of the orbiter instruments and was designed for in situ analysis of the chemical composition of cometary particles ejected from the comet 67P/C-G. This thesis aims to characterize the refractory organic component of the cometary dust, with the COSIMA instrument. As part of this work, I have developed and applied a methodology to analyze the cometary mass spectra, more specifically in the positive mode of the instrument. Using this methodology, five organic ions of cometary origin were detected and identified: C+ (m/z = 12.00), CH+ (m/z = 13.01), CH2+ (m/z = 14.02), CH3+ (m/z = 15.02) and C2H3+ (m/z = 27.02). The characterization of this organic component has been carried out with calibration mass spectra. The reference compounds used during this thesis include pure organic molecules and cometary organic matter analogs, such as natural samples (carbonaceous chondrites, ultracarbonaceous micrometeorite, insoluble organic matter extracted from carbonaceous chondrites) and one sample synthetized in the laboratory. The best analogue found so far to the refractory component of 67P/C-G particles is the insoluble organic matter extracted from carbonaceous chondrites. The cometary organic matter would be of high-molecular-weight and the carbon bounded in very large macromolecular compounds. Carbon is also one of the most abundant element in the dust particles with an elemental ratio of C⁄Si = 5.5 (+1.4/-1.2). Comet 67P/C-G is among the most carbon-rich bodies of the solar system. Finally, a specific compound was sought, the polyoxymethylene. However, indicators developed and applied to the cometary data do not allow to conclude on the presence of polyoxymethylene in the particles analyzed by COSIMA

Ces travaux de thèse sont consacrés à l’étude de cathodes performantes pour batteries lithium/air. Les performances de ce type de batteries sont principalement limitées par les phénomènes de diffusion d’oxygène dans la cathode et l’électrolyte ainsi que par la formation d’oxydes de lithium bouchant progressivement les pores de la cathode. Ainsi on ne peut envisager le développement de l’électrode à air sans prendre en compte l’influence de l’électrolyte organique et celui-ci a également était considéré dans cette étude. La porosité de l’électrode et la nature du catalyseur employé joue un grand rôle sur les performances de l’électrode. Les électrodes à base de tissus de carbone et contenant des nanofils de α-MnO2 ont fourni les meilleurs résultats au regard de la capacité et de la tenue au cyclage. Par ailleurs, des mesures de spectroscopie de masse in situ ont permis d’analyser la formation des produits gazeux lors de la charge. Le TEGDME est un électrolyte prometteur; néanmoins, la formation de dioxyde de carbone (CO2) est détectée dès 3,7 V vs. Li/Li+. / In this thesis, high-performance cathodes for lithium/air batteries have been investigated. The main limitations for lithium/air batteries are oxygen diffusion into the cathode and in the electrolyte and the progressive clogging of cathode pores by lithium oxide. The development of the air cathode is strongly dependant on the organic electrolyte used, thus the nature of the electrolyte has been here considered. Electrode porosity and the kind of catalyst employed influence the cathode performance. Promising results were obtained with carbon cloth based electrodes containing α-MnO2 nanotubes as catalyst with regards to capacity and cycle stability. Furthermore, formation of gaseous products during charging has been studied thanks to mass spectroscopy experiments. TEGDME is a promising electrolyte; nevertheless, carbon dioxide (CO2) has been detected up to 3.7 V vs. Li/Li+.

Toxoplasma gondii, comme Plasmodium falciparum appartiennent au phylum des Apicomplexes. Ce groupe de parasites ont comme dénominateurs communs, trois organites apicaux : rhoptries, micronèmes et granules denses contenant des facteurs indispensables pour la reconnaissance, l’entrée et la survie du parasite au sein de la cellule hôte. Le récepteur transmembranaire de type 1 appelé TgSORTLR ("Toxoplasma gondii Sortilin-Like Receptor") est nécessaire à la biogenèse des organelles de sécrétion rhoptrie et micronème (Sloves et al., 2012). Le domaine C-terminale de la TgSORTLR, lie TgVps26 et TgVps35 deux protéines appartement au complexe Rétromère essentiel au recyclage protéique chez les mammifères et S. cerevisiae. Nous avons construit le premier interactome du CRC de T. gondii et des autres Apicomplexes. Contrairement aux mammifères, le Rétromère de T. gondii est composé du CRC (Complexe de Reconnaissance du Cargo) TgVps35-TgVps26-TgVsp29 et l’absence du dimère de Sorting Nexin (SNX). Nous avons identifié plusieurs protéines connues de l’ELC (Endosomal-like compartment) ainsi que des protéines parasitaires spécifiques. La déplétion conditionnelle de TgVps35 démontre que le complexe Rétromère n’est pas seulement crucial pour la biogenèse des rhoptries, micronèmes et granules denses, mais aussi pour l’architecture et l’intégrité du parasite. Nous avons montré que le recyclage de la TgSORTLR entre l’ELC et le TGN (Tans-Golgi-Network) est essentiel au trafic des protéines de sécrétion rhoptries et micronèmes. Par ailleurs nous avons décrit deux nouvelles protéines hypothétiques TgHP12 et TgHP03 pouvant être impliquées respectivement dans le trafic vers l’ELC et vers la membrane plasmique. Afin nous avons identifié et caractérisé une protéine chimérique TgHP25 avec les domaines BAR et SBF2, pouvant être impliquée dans la biogenèse de l’organite rhoptrie. En somme notre travail souligne l’importance du recyclage protéique et l’implication de protéines spécifiques dans la maturation des organites et l’intégrité du parasite. / Toxoplasma gondii, like Plasmodium falciparum are belong to the Apicomplexan phylum. This group of parasites have as a common denominator, three apical organelles: rhoptries, micronemes and dense granules containing the essential factors for recognition, entry and survival into the host cell. The Toxoplasma gondii Sortilin-Like Receptor (TgSORTLR), is essential for the biogenesis of apical secretory organelles rhoptries and micronemes (Sloves et al., 2012). The C-terminal tail of TgSORTLR specifically binds to TgVps26 and TgVps35 proteins, two components of a pentameric complex called retromer (RC), and known to play an essential role in retrograde transport in yeast and mammals. We now report the first retromer-trafficking interactome in T. gondii and other apicomplexan parasites. In contrast to yeast and mammals, T. gondii RC harbors a singular architecture typified by a Vps35-Vps26-Vps29 trimer complex and the absence of the dimer of sorting nexins. Rather, we identified several known endosomal-like compartment (ELC) proteins and unrelated parasite-specific proteins. The conditional ablation of TgVps35 demonstrates that the Retromer complex is not only crucial for the biogenesis of rhoptries, micronemes and dense granules but also for maintaining a proper parasite architecture and integrity. We showed that the recycling of TgSORTLR between ELC and Trans-Golgi Network (TGN), is essential for proper protein trafficking to secretory organelles rhoptries and micronemes. Furthermore, we will describe two novel parasite-specific proteins TgHP12 and TgHP03, whose functions are likely related to ELC and plasma membrane. So we identified and characterized a chimeric protein TgHP25 with the BAR and SBF2 domains, may be involved in the biogenesis of the organelle rhoptrie. In short our work emphasizes the importance of protein recycling and involvement of specific proteins in the maturation of organelles and integrity of the parasite.

Acteurs des mécanismes moléculaires de signalisation cellulaire, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les espèces réactives de l'azote (RNS) agissent comme des molécules signal transférant des informations extracellulaires ou intracellulaires et induisant des réponses spécifiques. Les ROS/RNS agissent principalement via un ensemble de modifications post-traductionnelles réversibles des résidus thiols sur les protéines parmi lesquelles la nitrosylation et la glutathionylation apparaissent comme des éléments jouant un rôle important dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux et impliqués dans nombre de maladies humaines. Bien que présents chez les organismes photosynthétiques, ces modifications ont été moins étudiées. Mon projet était d'étudier, in vivo, chez l'algue Chlamydomonas reinhardtii, la dynamique de la nitrosylation et de la glutathionylation, en utilisant une combinaison d'approches multidisciplinaires incluant protéomique, biochimie et biologie moléculaire. En réponse au stress nitrosatif, 492 protéines S-nitrosylées in vivo et 392 sites de nitrosylation ont été identifiés par spectrométrie de masse. Ces protéines participent à un large éventail de processus biologiques tels que la photosynthèse et la réponse au stress. Avec une stratégie similaire, l’analyse de la glutathionylation en réponse à des stresses physiologiques de forte lumière et de choc thermique, a révélé des voies spécifiques de réponse au stress. En parallèle, la dépendance redox des mécanismes moléculaires sous-jacents a été examinée pour la GAPDH cytoplasmique et l’isocitrate lyase, mais aussi la triosephosphate isomérase et la phosphoglycérate kinase chloroplastiques. / Actors of the molecular mechanism of cell signaling, reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) act as signaling molecules to transfer extracellular or intracellular information and elicit specific responses. ROS/RNS mainly act through a set of reversible post-translational modifications of thiol residues on proteins among which nitrosylation and glutathionylation have emerged as key elements playing a major role in numerous fundamental cell processes and implicated in a broad spectrum of human diseases. Despite ROS and RNS are present in photosynthetic organisms, such modifications have been less studied. My project was to investigate in the green algae Chlamydomonas reinhardtii, the in vivo dynamics of nitrosylation and glutathionylation, using a combination of multidisciplinary approaches including proteomic, biochemistry and molecular biology. In response to nitrosative stress, 492 in vivo s-nitrosylated proteins and 392 sites of nitrosylation were identified by mass spectrometry. These proteins were found to participate in a wide range of biological processes and pathway such as photosynthesis, stress response and carbohydrate metabolism. Employing a similar strategy, analysis of glutathionylation in response to physiological stresses, specifically high light and heat stress revealed specific stress dependent targeted pathways. In a second part, the redox dependence of the underlying molecular mechanisms was examined for the cytoplasmic GAPDH and ICL, but also the chloroplastic TPI and PGK. This work has highlighted the existence of a strong interplay between these redox modifications. a complex redox network

Ces travaux de thèse présentent une étude des propriétés optiques et de la photofragmentation de protéines en phase gazeuse. Les expériences ont eét effectuées sur un montage couplant la spectroscopie optique (un LASER UV/Vis) à la spectroscopie de masse (un piège linéaire LTQ). Le photodétachement d'électron est utilisé comme sonde d'action pour l'étude des propriétés optiques des biomolécules ou comme initiateur de radicaux pour les expériences d'a-EPD. L'efficacité de la fragmentation a-EPD a été démontrée sur des petites protéines et son application aété étendue aux polymères synthétiques. Une étude comparative de l'a-EPD avec l'EDD a permis de mieux comprendre les mécanismes liés à la fragmentation d'anions radicalaires. Cestravaux de thèse ont également porté sur l'apport de la spectroscopie d'action par photodétachement sur des protéines entières dans le visible et le VUV. Le domaine du visible a été exploré au sein de notre laboratoire sur une métalloprotéine pour montrer l'importance de l'environnement protéique sur les propriétés optique du groupe porphyrine (hème). L'accès au rayonnement synchrotron SOEIL nous a pemis d'enregistrer les spectres d'action de protéines entières dans le VUV, encore inexplorés dans ce domaine de longeur d'onde. Pour la premièère fois sur une protéine anionique, un double détachement direct d'électrons corrélés a pu être observé. Enfin, des expériences de spectroscopie de photoélectrons (PES ont été réalisées en collaborations avec M. Kappes (Karlsruhe) afin d'enregistrer des spectres de photoélectron résolu en conformères et d'étudier ainsi la stabilité de protéines anioniques fortement chargées. / These thesis present a study of the optical properties and photofragmentation of gas phase protein . The experiments were performed on a mounting EET coupling optical spectroscopy ( UV / Vis LASER ) with mass spectroscopy ( linear trap LTQ ) . Photodetachment electron is used as a probe of Action for the study of optical properties of biomolecules or as radical initiator for experiments a- EPD . The efficiency of the fragmentation a-EPD has been demonstrated on small proteins and extended to synthetic polymers. A comparative study was to ESD -EPD has a better understanding of the mechanisms associated with the fragmentation of radical anions . Cestravaux thesis also focused on the contribution of action photodetachment spectroscopy on whole proteins in the visible and VUV . The visible range has been explored in our laboratory on a metalloprotein to show the importance of the protein environment on the optical properties of porphyrin group ( heme ) . Access to synchrotron radiation Soeil a management permit us to record the action spectra of whole proteins in the VUV , unexplored in the field of wave length . For premièère both an anionic protein , a direct double correlated electron detachment was observed . Finally , experiments with photoelectron spectroscopy (PES were carried out in collaboration with M. Kappes (Karlsruhe ) to record photoelectron spectra resolved conformers and thus to study the stability of highly charged anionic proteins .