La mesure de la forme 3D du visage est une problématique qui attire de plus en plus de chercheurs et qui trouve son application dans des domaines divers tels que la biométrie, l'animation et la chirurgie faciale. Les solutions actuelles sont souvent basées sur des systèmes projecteur/caméra et utilisent de la lumière structurée pour compenser l'insuffisance de la texture faciale. L'information 3D est ensuite calculée en décodant la distorsion des patrons projetés sur le visage. Une des techniques les plus utilisées de la lumière structurée est la codification sinusoïdale par décalage de phase qui permet une numérisation 3D de résolution pixélique. Cette technique exige une étape de déroulement de phase, sensible à l'éclairage ambiant surtout quand le nombre de patrons projetés est limité. En plus, la projection de plusieurs patrons impacte le délai de numérisation et peut générer des artefacts surtout pour la capture d'un visage en mouvement. Une alternative aux approches projecteur-caméra consiste à estimer l'information 3D par appariement stéréo suivi par une triangulation optique. Cependant, le modèle calculé par cette technique est généralement non-dense et manque de précision. Des travaux récents proposent la super-résolution pour densifier et débruiter les images de profondeur. La super-résolution a été particulièrement proposée pour les caméras 3D TOF (Time-Of-Flight) qui fournissent des scans 3D très bruités. Ce travail de thèse propose une solution de numérisation 3D à faible coût avec un schéma de super-résolution spatio-temporelle. Elle utilise un système multi-caméra étalonné assisté par une source de projection non-étalonnée. Elle est particulièrement adaptée à la reconstruction 3D de visages, i.e. rapide et mobile. La solution proposée est une approche hybride qui associe la stéréovision et la codification sinusoïdale par décalage de phase, et qui non seulement profite de leurs avantages mais qui surmonte leurs faiblesses. Le schéma de la super-résolution proposé permet de corriger l'information 3D, de compléter la vue scannée du visage en traitant son aspect déformable.

La microscopie optique est un outil indispensable pour la recherche de la neurobiologie et médecine qui permet l’étude des cellules dans leur environnement natif. Les processus sous-cellulaires restent néanmoins cachés derrière les limites de la résolution optique, ce qui rend la résolution des structures plus petites que ~300nm impossible. Récemment, les techniques de la localisation des molécules individuelles (SML) ont permis le suivi des protéines de l’échelle nanométrique grâce à l’ajustement des molécules uniques à la réponse impulsionnelle du système optique. Ce processus dépend de la quantité de lumière recueilli et rend ces techniques très sensibles aux imperfections de la voie d’imagerie, nommé des aberrations, qui limitent l’application de SML aux cultures cellulaires sur les lamelles de verre. Un système commercial d’optiques adaptatives est implémenté pour compenser les aberrations du microscope, et un flux de travail est défini pour corriger les aberrations dépendant de la profondeur qui rend la 3D SML possible dans les milieux biologiques complexes. Une nouvelle méthode de SML est présentée qui utilise deux objectifs pour détecter le spectre d’émission des molécules individuelles pour des applications du suivi des particules uniques dans 5 dimensions (x,y,z,t,λ) sans compromis ni de la résolution spatiotemporelle ni du champ de vue. Pour faciliter les analyses de manière quantitative des Go de données générés, le développement des outils biochimiques, numériques et optiques est présenté. Ensemble, ces approches ont le but d’amener l’imagerie quantitative des molécules uniques dans les échantillons biologiques complexes / Optical microscopy is an indispensable tool for research in neurobiology and medicine, enabling studies of cells in their native environment. However, subcellular processes remain hidden behind the resolution limits of diffraction-limited optics which makes structures smaller than ~300nm impossible to resolve. Recently, single molecule localization (SML) and tracking has revolutionized the field, giving nanometer-scale insight into protein organization and dynamics by fitting individual fluorescent molecules to the known point spread function of the optical imaging system. This fitting process depends critically on the amount of collected light and renders SML techniques extremely sensitive to imperfections in the imaging path, called aberrations, that have limited SML to cell cultures on glass coverslips. A commercially available adaptive optics system is implemented to compensate for aberrations inherent to the microscope, and a workflow is defined for depth-dependent aberration correction that enables 3D SML in complex biological environments. A new SML technique is presented that employs a dual-objective approach to detect the emission spectrum of single molecules, enabling 5-dimensional single particle imaging and tracking (x,y,z,t,λ) without compromising spatiotemporal resolution or field of view. These acquisitions generate ~GBs of data, containing a wealth of information about the localization and environment of individual proteins. To facilitate quantitative acquisition and data analysis, the development of biochemical, software and hardware tools are presented. Together, these approaches aim to enable quantitative SML in complex biological samples.

Le cerveau est composé de neurones et de cellules gliales qui jouent un rôle de soutien et de protection du réseau cellulaire. L’espace extra-cellulaire (ECS) correspond à l’espace qui existe entre ces cellules. Les modifications de sa structure peuvent dépendre de plusieurs paramètres comme l’âge, l’apprentissage ou les maladies neuro-dégénératives. Le volume de l’ECS correspond à environ 20$%$ du volume total du cerveau et les neurotransmetteurs et autres molécules circulent dans cet espace pour assurer une communication neuronale optimale. Cependant, les dimensions et la viscosité locale de cet espace restent encore mal-connues. L’ECS est composé entre autres de protéoglycans, de glycoaminoglycans (acide hyaluronique…) et de fluide cérébrospinal. Nous avons proposé dans cette thèse une stratégie pour mesurer les dimensions et les propriétés rhéologiques de l’espace extra-cellulaire de tranches de cerveaux de rats maintenue en vie à l’aide du suivi de nanotubes de carbone individuels luminescents. Pour ces applications, nous avons étudier la biocompatibilité et le rapport signal sur bruit de nos échantillons de nanotubes afin de les détecter en profondeur dans les tranches de cerveaux et de pouvoir mesurer leurs propriétés de diffusion. / The brain is mainly composed of neurons which ensure neuronal communication and glialcells which play a role in supporting and protecting the neural network. The extracellular space corresponds to the space that exists between all these cells and represents around 20 %of the whole brain volume. In this space, neurotransmitters and other molecules circulate into ensure optimal neuronal functioning and communication. Its complex organization whichis important to ensure proper functioning of the brain changes during aging, learning or neurodegenerative diseases. However, its local dimensions and viscosity are still poorly known.To understand these key parameters, in this thesis, we developed a strategy based on the tracking of single luminescent carbon nanotubes. We applied this strategy to measure the structural and viscous properties of the extracellular space of living rodent brains slices at the nanoscale. The organization of the manuscript is as follows. After an introduction of the photoluminescence properties of carbon nanotubes, we present the study that allowed us to select the optimal nanotube encapsulation protocol to achieve our biological applications. We also present a quantitative study describing the temperature increase of the sample when laser irradiations at different wavelengths are used to detect single nanotubes in a brain slice.Thanks to a fine analysis of the singular diffusion properties of carbon nanotubes in complex environments, we then present the strategy set up to reconstruct super-resolved maps (i.e. with resolution below the diffraction limit) of the brain extracellular space morphology.We also show that two local properties of this space can be extracted : a structural complexity parameter (tortuosity) and the fluid’s in situ viscosity seen by the nanotubes. This led us to propose a methodology allowing to model the viscosity in situ that would be seen, not by the nanotubes,but by any molecule of arbitrary sizes to simulate those intrinsically present or administered in the brain for pharmacological treatments. Finally, we present a strategy to make luminescent ultra-short carbon nanotubes that are not intrinsically luminescent and whose use could be a complementary approach to measure the local viscosity of the extracellular space of the brain.

L’imagerie pondérée en diffusion (DWI) représente un outil prometteur pour augmenter la spécificité de l’IRM mammaire en vue du dépistage du cancer du sein. L’épaisseur de coupe pour une acquisition ayant un rapport signal sur bruit suffisant et couvrant les seins dans un temps compatible avec un examen clinique, reste égale ou supérieur à 3 mm, limitant la possibilité de dépistage. Dans ce travail, une méthode DWI isotrope a été développée pour obtenir des images haute résolution isotropes (1x1x1 mm3) couvrant entièrement les seins. Ces images sont obtenues en combinant : (i) une séquence à train de lecture segmenté (rs-EPI) qui correspond à plusieurs segments de lecture EPI avec écho navigation, permettant d’obtenir de hautes résolutions dans le plan, (ii) une stratégie de super-résolution (SR) consistant à acquérir trois jeux de données avec des coupes épaisses (3 mm) et des décalages de 1 mm dans le sens de coupe entre chaque acquisition et (iii) une méthode de reconstruction dédiée pour obtenir des données isotropes 1x1x1 mm3. Plusieurs schémas de reconstruction basés sur différentes régularisations ont été étudiés. La SR proposée a été comparée aux acquisitions natives de 1x1x1 mm3 sans algorithme SR sur huit sujets sains et des fantômes synthétiques. Pour valider la méthode SR, nous avons utilisé plusieurs méthodes : des simulations Monte-Carlo, des mesures de SNR et des métriques de netteté et enfin le coefficient de diffusion apparent (ADC). Ces validations ont aussi été confirmées par des mesures expérimentales sur fantômes contenant des objets de dimensions et diffusion calibrées. Un nouveau protocole de recherche clinique est proposé pour évaluer l’efficacité de la séquence de diffusion à haute résolution sur le dépistage d’un cancer mammaire, dans le but de remplacer la séquence de perfusion avec injection de produit de contraste utilisée en IRM mammaire. / Diffusion-weighted imaging (DWI) is a promising tool to increase the specificity of MRI for breast cancer screening. However, the field of view covering the breasts makes the DWI at high resolution difficult and the images obtained have low signal-to-noise ratios (SNR). The current DWI techniques are limited by the spatial resolution, mainly a slice thickness greater than or equal to 3 mm. In this work, an isotropic DWI method was developed to obtain high resolution isotropic images (1x1x1 mm3) covering the entire breast. These images are obtained by combining: (i) a readout-segmented DW-EPI sequence (rs-EPI), with several segments of k-space and echo navigator providing high in-plane resolution, (ii) a super-resolution (SR) strategy, which consists of acquiring three datasets with thick slices (3 mm) and 1mm-shifts in the slice direction, (iii) and combining them into a 1x1x1 mm3 dataset using a dedicated reconstruction. Several SR reconstruction schemes were investigated, based on different regularizations. The proposed SR strategy was compared to native 1x1x1 mm3 acquisitions (i.e. with 1 mm slice thickness) on eight healthy subjects, and synthetics phantoms. To validate the SR method, we used several methods: Monte Carlo simulations, SNR measurements and sharpness metrics, the apparent diffusion coefficient (ADC) values in normal breast tissue and breast diffusion/resolution phantom were also compared. A new clinical research protocol is proposed to evaluate the effectiveness of the high resolution diffusion sequence on breast cancer screening. The aim of this protocol is to replace the contrast-enhanced perfusion by the diffusion sequence for screening.

La super-résolution est une technique de traitement d'images qui consiste en la reconstruction d'une image hautement résolue à partir d'une ou plusieurs images bassement résolues.Cette technique est apparue dans les années 1980 pour tenter d'augmenter artificiellement la résolution des images et donc de pallier, de façon algorithmique, les limites physiques des capteurs d'images.Comme beaucoup des techniques de reconstruction en traitement d'images, la super-résolution est connue pour être un problème mal posé dont la résolution numérique est mal conditionnée. Ce mauvais conditionnement rend la qualité des images hautement résolues reconstruites très sensible au choix du modèle d'acquisition des images, et particulièrement à la modélisation de la réponse impulsionnelle de l'imageur.Dans le panorama des méthodes de super-résolution que nous dressons, nous montrons qu'aucune des méthodes proposées par la littérature ne permet de modéliser proprement le fait que la réponse impulsionnelle d'un imageur est, au mieux, connue de façon imprécise. Au mieux l'écart existant entre modèle et réalité est modélisé par une variable aléatoire, alors que ce biais est systématique.Nous proposons de modéliser l'imprécision de la connaissance de la réponse impulsionnelle par un ensemble convexe de réponses impulsionnelles. L'utilisation d'un tel modèle remet en question les techniques de résolution. Nous proposons d'adapter une des techniques classiques les plus populaires, connue sous le nom de rétro-projection itérative, à cette représentation imprécise.L'image super-résolue reconstruite est de nature intervalliste, c'est à dire que la valeur associée à chaque pixel est un intervalle réel. Cette reconstruction s'avère robuste à la modélisation de la réponse impulsionnelle ainsi qu'à d'autres défauts. Il s'avère aussi que la largeur des intervalles obtenus permet de quantifier l'erreur de reconstruction. / Super-resolution is an image processing technique that involves reconstructing a high resolution image based on one or several low resolution images. This technique appeared in the 1980's in an attempt to artificially increase image resolution and therefore to overcome, algorithmically, the physical limits of an imager.Like many reconstruction problems in image processing, super-resolution is known as an ill-posed problem whose numerical resolution is ill-conditioned. This ill-conditioning makes high resolution image reconstruction qualityvery sensitive to the choice of image acquisition model, particularly to the model of the imager Point Spread Function (PSF).In the panorama of super-resolution methods that we draw, we show that none of the methods proposed in the relevant literature allows properly modeling the fact that the imager PSF is, at best, imprecisely known. At best the deviation between model and reality is considered as being a random variable, while it is not: the bias is systematic.We propose to model scant knowledge on the imager's PSF by a convex set of PSFs. The use of such a model challenges the classical inversion methods. We propose to adapt one of the most popular super-resolution methods, known under the name of "iterative back-projection", to this imprecise representation. The super-resolved image reconstructed by the proposed method is interval-valued, i.e. the value associated to each pixel is a real interval. This reconstruction turns out to be robust to the PSF model and to some other errors. It also turns out that the width of the obtained intervals quantifies the reconstruction error.

Dans cette thèse, nous avons construit et optimisé des méthodes de microscopie de fluorescence super-résolue stochastique, polarisée et quantitative qui nous permettent d'imager l'orientation moléculaire dans des environnements dynamiques et statiques a l’échelle de la molécule unique et avec une résolution nanoscopique. En utilisant un montage de microscopie super-résolue à lecture stochastique en combinaison avec une détection polarisée, nous avons pu reconstruire des images d'anisotropie de fluorescence avec une résolution spatiale de 40 nm. En particulier, nous avons pu imager l'ordre orientationnel d'assemblages biomoléculaires et cellulaires. Pour l'imagerie cellulaire, nous avons pu étudier la capacité d'étiquettes de marquer fluorophoresde reporter quantifier l'orientation moléculaire dans l'actine et les microtubules dans des cellules fixées. Nous avons également mis à profit la meilleure résolution et la détection polarisée pour étudier l'ordre moléculaire d’agrégats d’amyloïdes a l’échelle nanoscopique. Enfin, nous avons étudié l'interaction de la protéine de réparation RAD51 avec l'ADN par microscopie de fluorescence polarisée super-résolue pour quantifier l'ordre orientationnel de l'ADN et de la protéine RAD51 afin de comprendre la recombinaison homologue du mécanisme de réparation de l'ADN. / .In this thesis we built and optimized quantitative polarized stochastic super-resolution fluorescence microscopy techniques that enabled us to image molecular orientation behaviors in static and dynamic environments at single molecule level and with nano-scale resolution. Using a scheme of stochastic read-out super resolution microscopy in combination with polarized detection, we can reconstruct fluorescence anisotropy images at a spatial resolution of 40 nm. In particular, we have been able to use the techniques to quantify the molecular orientationalorder in cellular and bio-molecular assemblies. For cellular imaging, we could quantify the ability of fluorophore labels to report molecular orientation of actin and microtubules in fixed cells. Furthermore, we used the improvements of resolution and polarization detection to study molecular order of amyloid aggregates at a nanoscopic scale. Also, we studied repair protein RAD51` s interaction with DNA by using dual color polarized fluorescence microscopy, to quantify the orientational order of DNA and RAD51 to understand the homologous recombination of DNA repair mechanism.

La motilité cellulaire est un processus intégré essentiel à de nombreux phénomènes physiologiques tels que la formation du cône de croissance et la plasticité synaptique. Des dérégulations de la motilité cellulaire peuvent être à l’origine de la formation de métastases ou de pathologies neuropsychiatriques comme la schizophrénie et l'autisme. La compréhension des mécanismes régulant la migration cellulaire est donc un enjeu majeur. La motilité cellulaire repose sur la formation de diverses structures constituées de réseaux d’actine branchés telles que le lamellipode. La formation du lamellipode nécessite l’intervention de protéines régulatrices de l’actine telles que Rac1 et les complexes Wave et Arp2/3. Grâce à l’utilisation de suivi de protéine unique, nous avons pu comprendre comment la coordination spatio-temporelle de ces régulateurs contrôle la formation et la morphologie des lamellipodes de cellules migrantes. Nous avons ainsi découvert que l’activation et la localisation du complexe Wave étaient régulées de manière enzymatique mais également mécanique. Dans une première étude, nous avons montré que la RhoGTPase Rac1 active le complexe Wave spécifiquement à l’extrémité du lamellipode. Dans une seconde étude, nous avons révélé que la localisation du complexe Wave est régulée par la dynamique des filaments des réseaux branchés d’actine. Ces données soulignent l’importance du complexe Wave dans la formation du lamellipode et révèlent l’existence d’une régulation mécanique de la localisation du complexe Wave. / Cell motility is an integrated process involved in critical phenomena such as axonal pathfinding and synaptic plasticity. Dysregulation of cell motility can induce metastasis and abnormal spine shapes observed in neuropsychiatric disorders like autism and schizophrenia. Therefore it is essential to understand how cell motility is regulated. Cell motility requires the formation of branched actin networks propelled by actin polymerization that lead to the formation of membrane protrusions such as the lamellipodium. Several actin regulatory proteins are involved in this process, such as Rac1 and the WAVE and ARP2/3 complexes. Using single protein tracking, we revealed key phenomena concerning the spatio-temporal regulation of lamellipodium formation by actin regulatory proteins. We found that the localization and activation of the WAVE complex was enzymatically regulated, but also mechanically. First, we showed that the Rac1 RhoGTPase activates the WAVE complex specifically at the tip of the lamellipodium. We also showed that WAVE complex localization is regulated by the dynamics of branched-network actin filaments. This study confirms the crucial role of the WAVE complex in lamellipodium formation and reveals the existence of a mechanical regulation of the localization of this complex in the cell.

Nous avons développé un microscope tomographique diffractif en réflexion, qui permet d’observer la surface d’un échantillon avec une résolution latérale améliorée comparée à un microscope holographique conventionnel. À partir des même données expérimentales (les hologrammes acquis sous différents angles d’illumination), des mesures à haute précision longitudinale peuvent être réalisées sur la surface d’un échantillon purement réfléchissant, par reconstruction du profil de hauteur à partir de la phase. Cette méthode d’imagerie multimodale présente plusieurs avantages comparée aux mesures en holographie interférométrique classique : amélioration de la résolution latérale sur la partie diffractive, déroulement de phase facilité, réduction du bruit cohérent, l’ensemble étant associé à la grande précision longitudinale fournie par les mesures de phase. Nous montrons ces possibilités en imageant divers échantillons minces. / We have developed a tomographic diffractive microscope in reflection, which permits observation of sample surfaces with an improved lateral resolution, compared to a conventional holographic microscope. From the same set of data, high-precision measurements can be performed on the shape of the reflective surface by reconstructing the phase of the diffracted field. doing so allows for several advantages compared to classical holographic interferometric measurements: improvement in lateral resolution, easier phase unwrapping, reduction of the coherent noise, combined with the high-longitudinal precision provided by interferometric phase measurements. We demonstrate these capabilities by imaging various test samples.

La tomographie par émission de positons (TEP) est une modalité d'imagerie fonctionnelle incontournable pour le diagnostic et le suivi thérapeutique en oncologie. De nouvelles applications telles que la radiothérapie guidée par l'imagerie fonctionnelle sont en cours d'investigation. Les images TEP souffrent toutefois d'une faible résolution spatiale, encore dégradée par les effets du mouvement respiratoire du patient dans le thorax et l'abdomen. La grande majorité des solutions proposées pour la correction de ce mouvement respiratoire reposent sur l'enregistrement du signal respiratoire pendant l'acquisition TEP et de la synchronisation de l'acquisition avec ce signal respiratoire. Les données peuvent ainsi être séparées selon la partie du cycle respiratoire pendant laquelle elles ont été acquises. Les données correspondant à une même position peuvent ensuite être sommées et reconstruites. Les images résultantes sont cependant de qualité réduite, car elles ne contiennent qu'une portion de l'information. Il est donc nécessaire de les combiner. Les solutions disponibles actuellement proposent de recaler et sommer les données synchronisées, avant, pendant, ou après leur reconstruction, ce qui produit une image sans mouvement de qualité proche de celle qui aurait pu être obtenue en l'absence de mouvement respiratoire. La super-résolution vise à améliorer la résolution d'une image appartenant à une séquence d'images représentant différentes vues de la même scène. Elle exploite le mouvement présent dans cette séquence afin d'obtenir une image d'une résolution supérieure à celle permise par le système d'imagerie et ne contenant pas de recouvrement de spectre. Le but de cette thèse est d'appliquer une telle technique pour compenser le mouvement respiratoire. Nous avons d'abord appliqué un algorithme de super-résolution déjà existant à une séquence d'images TEP synchronisées avec la respiration, ce qui représente une application inédite. Cette technique permet de corriger efficacement les effets du mouvement respiratoire. Les méthodes de correction du mouvement respiratoire sont souvent plus performantes lorsqu'elles sont incorporées à la reconstruction plutôt qu'appliquées aux images reconstruites. C'est pourquoi nous avons ensuite développé de nouveaux algorithmes de reconstruction TEP incorporant la super-résolution. Les images ainsi reconstruites sont de meilleure qualité que celles corrigées par super-résolution après reconstruction. Enfin, nous avons montré que la correction du mouvement respiratoire par super-résolution permet une précision accrue dans la planification du traitement par radiothérapie.

Les récentes avancées en microscopie de fluorescence (augmentation de résolution spatiale, correction des aberrations induites par l'échantillon...) ouvrent de nombreuses perspectives en imagerie biologique. Mais pour que ces techniques se répandent, il est nécessaire de réduire les contraintes qu'elles imposent sur la préparation des échantillons, sur les sondes fluorescentes, sur la complexité de mise en oeuvre ou la cadence d'acquisition. Pendant ma thèse, j'ai travaillé sur le développement et l'amélioration de quelques-unes de ces techniques. Dans un premier temps, deux systèmes d'illumination structurée ont été réalisés dans le but d'accélérer la cadence de réalisation de coupes optiques pour l'observation d'échantillons épais vivants. Une deuxième partie de mon travail a concerné la mise en place d'une nouvelle approche de reconstruction en illumination structurée afin de dépasser la limite de résolution imposée par le microscope. Cet outil permet de réduire le nombre d'images requises pour la reconstruction d'une image super-résolue, ce qui ouvre la voie à une augmentation de la cadence de réalisation de ces images. Un montage d'optique adaptative a également été développé afin de corriger les aberrations introduites par les échantillons épais, permettant une amélioration des capacités d'imagerie en profondeur. L'accent a été mis sur la protection de l'échantillon, grâce à l'utilisation de billes fluorescentes pour déterminer la correction à appliquer sans illuminer l'échantillon. Enfin, un instrument de mesure du rendement quantique de fluorescence dédié à la caractérisation de fluorophores infrarouges a été mis en oeuvre afin de pallier les limitations des méthodes de mesure classiques dans le proche infrarouge.