Tübingen, Univ., Diss., 2007.

Univ., Diss., 2009--Marburg.

Erlangen, Nürnberg, Univ., Diss., 2010.

Universiẗat, Diss., 2004--Würzburg.

Die Multiple Sklerose und die entzündlichen Muskelerkrankungen Polymyositis und Einschlusskörperchenmyositis sind Autoimmunerkrankungen, in denen T-Lymphozyten in das Gehirn bzw. den Muskel eindringen und dort körpereigenes Gewebe zerstören. Die Pathogenese dieser Krankheiten ist bis jetzt noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die ins Zielgewebe eingedrungenen autoaggressiven T-Lymphozyten aus gefrorenem Biopsiegewebe zu isolieren, ihren ab-T-Zell-Rezeptor zu analysieren und diesen rekombinant zu exprimieren. Folgeversuche mit den TZR-Transfektanten sollten erste Hinweise auf ein mögliches Antigen liefern. Um autoaggressive T-Zellen von irrelevanten zu unterscheiden, konzentrierten wir uns auf Zellen, die zum einen im Zielgewebe klonal expandiert vorlagen, zum anderen einen direkten morphologischen Kontakt mit der Zielzelle aufwiesen. Wir untersuchten das T-Zell-Repertoire verschiedener Patienten auf klonal expandierte Populationen durch CDR3-Spektratyping und isolierten positiv gefärbte Kandidatenzellen durch Lasermikrodissektion aus dem Gewebe. Anschließend wurden die T-Zell-Rezeptoren mit einer speziellen, im Rahmen der Arbeit entwickelten Einzelzell-Muliplex-RT-PCR analysiert. Bisher war es nicht möglich, die a- und b-Kette desselben T-Zell-Rezeptors aus Biopsiematerial zu identifizieren. Dies lag an der geringen Anzahl verfügbarer anti-a-Ketten-Antikörper sowie an der wesentlich höheren Variabilität der a-Ketten-Gene. Aus dem Biopsiegewebe eines Patienten isolierten wir 23 ab-TZR-Pärchen, welche alle die identische expandierte TZR-b-Kette zeigten. 20 der 23 Zellen wiesen eine identische a-Kette auf. Die Dominanz des TZR ist ein Hinweis auf die pathogene Relevanz dieses T-Zell-Klons. Die anderen drei Zellen zeigten drei unterschiedliche funktionelle a-Ketten. Aus der Biopsie eines zweiten Patienten isolierten wir zwei weitere ab-TZR-Pärchen. Die vier Rezeptoren des ersten Patienten wurden in einer T-Zell Hybridom Zellinie exprimiert. Vorläufige Versuche, ein mögliches Antigen zu detektieren, zeigten, dass es sich wahrscheinlich weder um ein muskelspezifisches Antigen noch um ein ubiquitär exprimiertes Selbst-Antigen handelt. Die hier beschriebene Methode der Isolierung und Analyse von autoaggressiven T-Lymphozyten kann man nicht nur zur Untersuchung des TZR-ab-Repertoires von Myositis- oder MS-Patienten einsetzen. Sie ist ebenfalls geeignet, andere Autoimmunerkrankungen sowie Tumor- oder Infektionserkrankungen zu untersuchen. / Multiple sclerosis and the inflammatory muscle diseases polymyositis and inclusion body myositis are autoimmune diseases. T cells invade and destroy brain tissue or muscle fibers, respectively. The pathogenesis of these diseases is still unknown. The aim of this thesis was to isolate tissue invading autoaggressive T-lymphocytes from frozen biopsy specimens, to analyse their T cell receptor a-and b-chains and to express the receptors in a recombinant expression system. This may provide a tool to search for possible antigens. To distinguish pathogenic from irrelevant bystander cells we used two criteria: the clonal expansion in the target tissue triggered by antigen induced proliferation and the direct morphological contact with a target cell. We analysed the T cell repertoire of different patients by CDR3-spectratyping to find clonal expanded populations and isolated immunohistochemically stained candidate cells by laser microdissection. Then we identified coexpressed pairs of a- and b-chains by a newly developed multiplex PCR protocol. The detection of matching a- and b-chains in histological sections has not been achieved until now. The a-chain analysis has been a great problem because of the paucity of available a-chain antibodies and the great variability of the a-chain genes. From the tissue of one patient we isolated 23 ab-T cell receptor pairs which expressed the same expanded T cell receptor b-chain. 20 of these 23 a-chains were identical, suggesting a pathogenic relevance of this T cell clone. The a-chains of the three other T cells were different. We characterized two further clones from another patient. The receptors from the first patient were expressed in a T hybridoma cell line. Initial studies to identify possible antigens revealed that the T cell receptors did not recognize a muscle specific antigen nor a widely expressed self-antigen. This method for the analysis and reconstruction of tissue-infiltrating ab-T cells can be applied to many other autoimmune diseases as well as tumors or infectious diseases.

In radiation accidents biological methods are used in dosimetry, if the radiation dose could not be measured by physical methods. The knowledge of individual dose is a prerequisite for planning a medical treatment and for health risk evaluations. In the present work two biodosimetrical assays were calibrated in young patients who were treated with radioiodine for thyroid cancer. Patients were from Belarus. They suffered from radiation induced thyroid cancer as a consequence of the Chernobyl reactor accident. In radioiodine therapy (RIT) bone marrow and lymphatic organs are exposed to ionizing radiation at doses of 0.1 to 0.75 Sv within about 2 days. Since several RIT have to be applied with interval between each of them from 6 months up to approximately 1 year, total dose can be up to 2 Sv within 2 to 3 years. The dose for thyroid tissue is approximately 1000 times higher. The dose-response relationship was measured by the T-cell receptor test (TCR test) in T4 lymphocytes with and without in vitro incubation or by the micronucleus assay in transferrin receptor positive reticulocytes (MN-Tf-Ret test). In all these assays, the frequency of radiation-induced mutants of blood cells is measured using flow cytometry. The TCR test is a cumulative biodosimeter, which measures the total radiation dose within the last 5 to 10 years, whereas the result of the MN-Tf-Ret test reflects the radiation dose of approximately 24 hours interval. It takes 8 hours and 3 days to perform TCR and MN-Tf-Ret tests respectively. Calibration curves based on radioiodine treated patients can be used for dose estimation in humans, if the radiation conditions correspond to those in RIT. This limits their applicability to low dose-rate β- and γ-irradiation and to doses per session not higher than about 0.5 Sv. If higher doses or dose-rates as well as the other types of ionizing radiation are involved, calibration curves in animals are indispensable. In the case MN-Tf-Ret test mouse models are established and may be used. The TCR assay was performed in 72 thyroid cancer patients aged between 14 and 25. T-cell mutant frequency (Mf) reaches its maximum only after half a year following the RIT. Then it declines exponentially. This decline could be described by the 3 parameter single exponential decay function. Based on this equation, the radiation dose could be calculated when the Mf and the time interval since exposure are known. Furthermore, the experimentally measured Mf value, which significantly exceeds the corresponding calculated Mf value would indicate an individual with higher radiosensitivity. However, among our patients there were none. The reticulocytes micronuclei test (MN-Tf-Ret) was performed in 46 radioiodine treated patients. When measuring the MN frequency (f(MN-Tf-Ret)) the measured cell fraction should be limited only to the youngest cohort of reticulocytes, because all the micronucleated erythrocytes are quickly removed from the peripheral blood by spleen. Thus, the MN test was performed only in CD71 positive (having transferring receptor) reticulocytes. These reticulocytes just entered the peripheral blood flow from red marrow. The MN frequency was measured before the therapy and then every day after the irradiation until day 7. MN frequency curve has typical shape with latent period for days 0 to 3. Then there is a sharp increase in MN frequency which lasts for 24 hours and could start between days 3 and 4. In the following days the MN frequency is dropping to its base level that equals the one before the treatment. The decay of MN frequency is depending on the half-life of radioiodine in the patient organism. If the half-life is low, then the increased f(MN-Tf-Ret) lasts shorter and vice versa. It was shown that the MN frequency curve could be described by the model where all the micronuclei arise only through the last mitosis of erythroblasts in the red marrow and the MN frequency is proportional to the radiation dose in the last cell cycle. The shape of this curve depends on the cell kinetics of erythropoiesis on one side and the exponential decay of radioiodine activity on the other. To the best of our knowledge, the MN-Tf-Ret test was applied in the present study for the first time in biological dosimetry.

Die EAE ist eine Autoimmunerkrankung im Modell der Ratte. Sie ist eine inflammatorische , hauptsächlich durch CD4+ T-Zellen vermittelte Erkrankung des ZNS. In der Arbeit wurde die Interaktion von MHC, Peptid und TCR, welche typisch für diese Erkrankung sind, näher charakterisiert. / The EAE is an autoimmun desease in the model of the rat. It is characterized by inflammation of the CNS, mediated mainly by CD4+ T-cells. This work characterizes further the relevant interaction of MHC, peptid and TCR, typical found in the EAE.

Der humanpathogene Pilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) kann in immunsupprimierten Patienten zum Teil schwere invasive Infektionen auslösen. Trotz Fortschritten in den Behandlungsmöglichkeiten und der medikamentöser Prophylaxe bleibt die Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen hoch. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von spezifischeren Immuntherapien von Nöten. Ein Ansatz ist die genetische Modifikation von T Zellen, durch den Transfer von A. fumigatus spezifischen T Zell Rezeptoren (TCRs), für eine adoptive Therapie. Um dieses Konzept zu evaluieren wurden TCRs, die für die extrazellulären Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) spezifisch sind, auf primäre T Zellen transferiert und die Effektor-Funktion analysiert. Das Crf1/p41 Epitop induziert bei gesunden Spendern eine funktionelle TH1 Immunantwort gegen A. fumigatus und führt zur Produktion hoher Mengen von Interferon γ (IFN-γ). Für die Identifikation von A. fumigatus spezifischen TCRs wurden siebenunddreißig Crf1/p41 spezifische T Zellklone von drei HLA DRB1*04 Spendern generiert. Anschließend wurden die TCR β Ketten über die sehr variable komplementaritätsbestimmende Region 3 (CDR3) bestimmt. Es konnten zwölf unterschiedliche TCRs ermittelt werden, von denen vor allem die variablen β (Vβ) Kette 18 sehr dominant, während die Vβ Ketten 1 und 6 nur in wenigen Klonen vertreten waren. Zur weiteren Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden die variablen α (Vα) Ketten bestimmt (Vα 3, Vα 15 und Vα 26). Somit liegt eine polyklonale T Zell Immunantwort vor. Anschließend wurden die Crf1/p41 spezifischen TCRs in den retroviralen Vektor pMP71 kloniert und auf Jurkat 76 Zellen, welche keinen endogenen TCR exprimieren, und auf primäre CD4+ T Zellen transferiert. Die Expression von Crf1/p41 spezifischen TCRs, transduziert in CD4+ T Zellen, zeigten spenderspezifische Unterschiede und die Expression war niedriger im Vergleich zu den transduzierten Jurkat 76 Zellen. Daher wurde auf Optimierungsstrategien zurückgegriffen, die für den adoptiven Transfer mit TCR-modifizierten T Zellen zur Behandlung von Krebs entwickelt wurden. Angewandt wurden die Codonoptimierung der TCR codierenden Sequenz, Murinisierung der TCR konstanter Ketten, Induktion einer weiteren Disulfidbrücke. Ebenfalls wurde das Vektorsystem optimiert. Der Optimierungsprozess der Crf1/p41 spezifischen TCR 1 führte zu einer erhöhten Oberflächenexpression des TCR sowohl in Jurkat 76 (3 bis 5fach) als auch in primären CD4+ T Zellen (2fach). In funktionellen Analysen wurde die Proliferationsfähigkeit und IFN-γ Produktion, durch die Stimulation von transduzierten CD4+ T Zellen (TCR 1 optimiert) mit Crf1/p41 beladenen dendritischen Zellen (DCs), bestätigt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transfer von A. fumigatus spezifischen TCRs eine protektive anti-fungale Immunantwort fördern könnte. Demzufolge auch als ein geeignetes Mittel in einer potentiellen Immuntherapie gegen A. fumigatus Infektionen in immunsupprimierten Patienten, eingesetzt werden könnte. / The human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) can cause severe invasive infections in immunosuppressed patients. Despite progresses in the treatment and prophylaxis of invasive infections the mortality rate remains high. On that account the development of a more specific immune therapy seems necessary. One approach is genetic modification of T cells by transfer of A. fumigatus specific T cell receptors (TCR) for an adoptive therapy. To evaluate this concept, TCRs specific for a peptide derived from extracellular cell wall glucanase Crf1 (Crf1/p41) were transferred to primary T cells. Than their effector function was analyzed. In healthy donors the epitope Crf1/p41 induces a functional TH1 immune response towards A. fumigatus combined with a high Interferon-γ (IFN-γ) production. To identify A. fumigatus specific TCRs, thirty-seven Crf1/p41 specific T cell clones were generated from three HLA-DRB1*04 positive healthy donors. Afterwards, the TCR β chains were analyzed by sequencing the most variable complementarity determining region 3 (CDR3). Twelve different TCRs were detected whereas variable β (Vβ) 18 was very dominant, and Vβ 1 and Vβ 6 were present only in some clones. For further characterization of Crf1/p41 specific TCRs, variable α (Vα) chains were identified (Vα 3, Vα 15 and Vα 26). Thus, the T cell response is polyclonal. Subsequently Crf1/p41 specific TCRs were cloned into the retroviral vector pMP71 and transduced into Jurkat 76 cells that lack the expression of endogenous TCR, and into primary CD4+ T cells. The expression of Crf1/p41 specific TCR transduced in CD4+ T cells was donor-dependent and the expression was lower compared to transduced Jurkat 76 cells. Consequently, optimizing strategies engineered for TCR-modified adoptive T cell transfer in cancer therapy were used to induce a higher TCR expression on T cells. Those strategies include codon-optimization of the TCR coding sequence, murinization of constant chains of TCR, induction of an additional disulfide bond. Additionally the vector system was optimized. The optimization process of Crf1/p41 TCR 1 led to a higher surface expression in Jurkat 76 (3-5x) and primary CD4+ T cells (2x). Functional analyses revealed proliferation and IFN-γ production after the stimulation of transduced CD4+ T cells (TCR 1 optimiert) with Crf1/p41 pulsed mature dendritic cells (mDC). These data suggest that the transfer of A. fumigatus specific TCRs might foster protective anti-fungal immune responses. Therefore this might be a suitable tool for immunotherapeutic use against A. fumigatus infections in immunosuppressed patients.

Würzburg, University, Diss., 2007.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.