Au cours des dernières anneés, la taxonomie bactérienne a subi de profonds changements mais peu de consensus existent quant à la description précise des procaryotes. La diversité des procaryotes a été estimeé à 107 espèces, et la classification actuelle contient plus de 12 900 espèces officiellement reconnues. Ceci souligne l'absence d'un répertoire des procaryotes isolés chez l'homme. Nous avons constitué ce répertoire qui contient 2 156 espèces différentes réparties en 12 phyla,Notre second travail est la caractérisation du microbiote digestif par 5 approches varieés (cytométrie de flux, coloration de gram, TEM, qPCR, pyroséquençage). Nous avons analysé 16 selles de patients en comparant le taux de procaryotes de type gram positif/négatif. La moitié des procaryotes de type gram négatif n'est pas détecté par le pyroséquençage,alors qu'ils sont décrits comme les constituants majeurs de ce microbiote d'après les 1ères études réaliseés utilisant la culture.Dans notre 3ème travail, nous avons voulu montrer que l'utilisation de la culture bactérienne n'est pas inférieure aux techniques de séquençage pour étudier la diversité du microbiote digestif. Au total, depuis 4 ans, 685 échantillons ont été analysés et plus de 500 000 colonies ont été identifieés par MALDI-TOF. Ce travail a permis d'augmenter de 77,5 % le nombre d'espèces identifieés dans le tube digestif. Les nouvelles espèces sont décrites suivant le concept « taxonogenomics » incluant des donneés phénotypiques et le séquençage du génome. / Bacterial taxonomy has undergone tremendous changes over time, with little historical consensus regarding specific descriptions of prokaryotes. The prokaryotes have been estimated about 107 species, and the current classification contained more than 12,900 species. This highlights the absence of an exhaustive and specific database listing all prokaryotes associated with humans. We found than the human prokaryotic repertoire contained 2,156 species, divided among 12 different phyla.The second aim of our work was to characterize the human gut microbiota using 5 different techniques, including morphologic and molecular approaches (flow cytometry, gram staining, electron microscopy, qPCR and pyrosequencing). We analyzed 16 stools samples of patient and we copared the rate of gram-positive and gram-negative prokaryotes obtained with each technique. We found than by pyrosequencing only a half of gram-negative prokaryotes was detected.Our third goal was to demonstrate that bacterial culture was not inferior to pyrosequencing to describe the gut diversity. Culturomics concept created during the pioneer study has revolutionized the approach of the microbiota exploration. Since 4 years, we have performed the analyze of 685 different samples and identified more than 500,000 colonies using the MALDI-TOF mass spectrometry. We have increased by 77.5% the number of species isolated in the gut. Each new species will be described following our new concept named "taxonogenomics", including phenotypic data and genome sequencing.

Le nombre de nouvelles espèces bactériennes identifiées augmente constamment. L'un des facteurs les plus importants de cette situation est l'approche culturomique. Par conséquent, la nécessité de classifier et de décrire taxonomiquement ces microorganismes pour comprendre leur évolution, leurs caractéristiques et leurs relations avec d'autres organismes vivants a émergé. À ce jour, plus de 170000 génomes bactériens sont disponibles. Face à cette situation, la taxonomie bactérienne ne peut être éloignée des informations fournies par le génome entier. La stratégie taxonogénomique a été élaborée dans notre laboratoire pour inclure les séquences du génome dans le schéma taxonomique. Cette nouvelle stratégie consiste en la combinaison de diverses données phénotypiques, et l'analyse génomique et la comparaison, aboutissant à une description rationnelle et complète de nouveaux taxons bactériens. Un deuxième aspect de notre travail de thèse a été l'analyse pangénomique de Coxiella burnetii. Profitant de la disponibilité de 75 génomes de C. burnetii, nous avons montré que ce pangénome est ouvert, ce qui s’oppose à ceux des autres bactéries intracellulaires. Aucun contenu génique spécifique à une maladie, ou à un géovar spécifique n'a pu être identifié. En revanche, l'analyse phylogénétique basée sur le core génome correspondait à celle obtenue à partir du typage. Ainsi, nous démontrons ici que le séquençage du génome peut être bien adapté à la description officielle ainsi que l'analyse pangénomique des bactéries associées à l'homme, et permettre de répondre à de nombreuses questions microbiologiques telles que l'évolution, la résistance aux antibiotiques et la pathogénicité. / The number of new identified bacterial species is constantly increasing. One of the most important contributors to this situation is the microbial culturomics approach. Consequently, the need to classify and taxonomically describe those microorganisms to understand their evolution, characteristics and relationships with other living organisms has emerged. To date, more than 170000 bacterial genomes are available. Facing this situation, bacterial taxonomy cannot be disconnected from the information provided from the whole genome. The taxono-genomics strategy was elaborated in our laboratory to include genome sequences in the taxonomic scheme. This new strategy consists in the combination of various phenotypic data and genomic analysis and comparison, resulting in a rational and comprehensive description of new bacterial taxa. A second aspect of our thesis work was the pangenomic analysis of Coxiella burnetii. Taking advantage of the availability of 75 C. burnetii genomes, we showed that this pangenome is open, which contrasts with those of other intracellular bacteria. No disease-specific, or geovar-specific gene content could be identified. In contrast, the core gene-based phylogenetic analysis matched that obtained from multi-spacer typing. Thus, we herein demonstrate that genome sequencing may, among its many applications, be well suited for the official description as well as pangenome analysis of human-associated bacteria, including pathogens, and may allow addressing many microbiological questions, such as evolution, outbreaks, antibiotic resistance, and pathogenicity.

L'établissement d'un répertoire exhaustif ainsi que son élargissement constituent les deux objectifs principaux de ce travail. Nous avons d'abord établi la toute première liste de bactéries identifiées par culture des voies respiratoires au travers de la littérature scientifique. Nous répertorions ici 756 espèces, ce qui représente 27,23% de l'ensemble des bactéries isolées chez l'homme lorsque comparé au répertoire établi récemment par Bilen et al. Parmi ces bactéries, 514 avaient déjà été isolées au moins une fois dans les poumons. Plus de la moitié (i.e., 65,5%) des bactéries isolées pour la première fois dans des échantillons de poumons, ont été identifiées après les années 2000, soulignant la nécessité de poursuivre les efforts pour cultiver des microbes à partir des échantillons de voies respiratoires. Nous pensons que la combinaison de méthodes de culture à grande échelle telles que la culturomique et la métagénomique aidera à mieux décrire le microbiote pulmonaire. Des études antérieures sur le microbiote digestif le démontre. Nous avons ensuite utilisé des approches culturomiques et métagénomiques pour explorer le microbiote respiratoire d'individus sains. Nous avons isolé 193 bactéries par culturomics. Parmi ceux-ci, nous avons ajouté 84 au répertoire du microbiote respiratoire, dont 14 nouvelles espèces. En utilisant des approches métagénomiques, 139 OTU identifiées au rang de l'espèce dont seulement 49 (17,3%) étaient également retrouvées par culturomique, confortant la complémentarité des deux approches. Enfin, nous avons utilisé la taxonogénomique, une nouvelle approche permettant la description de nouvelles espèces bactériennes, pour décrire 19 bactéries. / The establishment of a comprehensive directory and its expansion through the use of high-speed culture methods are the two main objectives of this thesis work. We first established the first list of bacteria identified by airway culture through the scientific literature. Here we list 756 species, representing 27.23% of all bacteria isolated from humans when compared to the recently established repertoire of Bilen et al. Of these bacteria, 514 had already been isolated at least once in the lungs. Considering bacteria isolated for the first time in lung samples, more than half (ie, 65.5%) were identified after the 2000s, highlighting the need for continued efforts to grow microbes from lane samples respiratory. We believe that the combination of large scale culture methods such as culturomics and metagenomics will help to better describe the pulmonary microbiota. Previous studies on the digestive microbiota have shown the complementarity of these two approaches. We then used culturomic and metagenomic approaches to explore the respiratory microbiota of healthy individuals. We isolated 193 bacteria by culturomics. Of these, we added 84 bacteria to the repertoire of the respiratory microbiota, including 14 new species discovered. Using metagenomic approaches, 139 OTUs identified with the rank of the species of which only 49 (17.3%) were also recovered by culturomics, reinforcing the complementarity of the two approaches. Finally, we used taxonogenomics, a new approach for describing new bacterial species by integrating genomic and proteomic data with those that are classically integrated. Using this approach, 19 bacteria were described as part of this work.

La dysbiose est une cause importante dans la survenue de maladies, favorisant la prolifération de pathogènes ou induisant l’inflammation. L’étude de ce phénomène est devenue possible grâce aux approches d’analyse génomique (AG) associé avec d’autres techniques. L’entérocolite nécrosante (ECN) et l’infection du pied diabétique (IPD) demeurent deux maladies associées à la dysbiose dans lesquels différents bactéries ont été décrites, notamment C. butyricum dans l’ECN, E. coli et S. aureus dans l’IPD. Dans le cadre de l’ECN, C. butyricum demeure l’espèce la plus fréquente chez les ECN. L’identification clusters liés géographiquement et en fonction du temps. Le portage asymptomatique est suggéré par une similarité génomique des souches patients et contrôles. La prédiction d’un gène de β-hémolysine ainsi leur effet cytotoxique sur les cellules Jurkat avait été observé. De même, sur les cellules Caco-2 malgré le KO du gène de β-hémolysine. En se basant sur l’analyse physico-chimique du surnageant bactérien, nous avons suggéré que la fraction cytotoxique est protéique. La purification de la fraction cytotoxique a permis de trouver une protéine codant pour PspC family possédant un domain conservé commun avec celui de la toxine A/B. L’inactivation du gène codant pour cette protéine n’a pas supprimé l’effet cytotoxique, suggérant la présence d’une combinaison gènes. En parallèle, nous avons ciblé l’impact de C. neonatale par qRPC spécifique rpoB. Cette espèce était plus fréquente chez les patients, ainsi de clones géographiques ont été identifiées. Enfin, des SNPs ont été observés dans des gènes de virulence dans le cas des E. coli et S. aureus isolés de l’IPD. / Dysbiosis remains a main cause during the establishment of several diseases, by promoting bacterial translocation, leading to inflammation process. Specific microorganisms were involved in the pathogenesis of dysbiosis-associated diseases, notably necrotizing enterocolitis (NEC) and diabetic foot (DF). This was possible by the implication of whole-genome analysis (WGA) in association with other techniques. In case of NEC, C. butyricum was significantly associated with in NEC; tested on a South-East French cohort. Geographical and/or temporal clusters were identified, thus genomic relationship between NEC-associated isolates and controls, suggesting the presence of asymptomatic carriage. Genes encoding for β-hemolysin was detected and C. butyricum supernatant exhibited cytotoxic effect on Jurkat cells. Cytotoxic effect was also presented on Caco-2 cells. Supernatant of β-hemolysin-mutant C. butyricum showed enterotoxic effect. Basing on physico-chemical data, we assumed that the evaluated fraction was a protein. Proteomics analysis revealed that PspC family was the cytotoxic protein. This protein owned a glucan-binding domain, shared by C. difficile toxin A/B. The KO of PspC gene was enterotoxic, suggesting by this the existence of a combination of genes. In parallel, a specific rpoB-based qPCR was developed to identify C. neonatale. We found that, C. neonatale was more prevalent in NEC than in controls. Although co-identified in association with C. butyricum. C. neonatale clones were distinguished especially in strains isolated from the same hospital. Regarding to DF infection, SNPs were identified within S. aureus and E. coli genomes, especially in virulent genes.