O mecanismo de ação de fotossensibilizadores (FS) fenotiazínicos (azul de metileno - AM, tionina - TIO e azure B - AB) foi estudado em mitocôndrias e células Hela, e a dosimetria de AM em células HL60. Foi observado que a ligação de AM em mitocôndrias é dependente da concentração de mitocôndrias, concentração de AM e do potencial de membrana mitocondrial (Δ Ψ). A geração de oxigênio singlete a partir de AM é influenciada pelo Δ Ψ, sendo aproximadamente o dobro em mitocôndrias desacopladas. Essa variação se deve a influência do Δ Ψ sobre a relação dímero/monômero (D/M) do AM. A ligação de AM também é reduzida pela metade em mitocôndrias desacopladas. Esses efeitos não foram observados para os outros fotossensibilizadores, embora tenham a mesma carga e estrutura semelhante. Isso indica um efeito diferencial do Δ Ψ sobre o AM. Foi observada a toxicidade desses FSs em células Hela. Sem irradiação, apenas AB se mostrou tóxico. Em amostras irradiadas, AB e AM se mostraram tóxicos. Todos os FSs mostraram capacidade de produzir núcleos sub-diplóides, típicos de apoptose, com a maior eficiência sendo do AB. Em relação a toxicidade no escuro e claro, AB mostrou toxicidade em ambas as condições, TIO mostrou pouca toxicidade em ambas as condições e AM mostrou pouca toxicidade no escuro e alta toxicidade quando irradiado. A dosimetria que favorece apoptose em células HL60 também foi testada, sendo que µM de AM, os melhores resultados para formação de núcleos sub-diplóides foram com 10 2 com irradiação (contínua ou fracionada) de 0,55 J/cm2 . Essas dosagens foram as mais baixas utilizadas, indicando que um aumento na concentração de FS ou de luz tende a levar as células à morte necrótica. Conclui-se que os FSs fenotiazínicos tem afinidade por mitocôndrias e por células, podendo levar a indução de apoptose em doses não tóxicas no escuro. / The mechanism of action of phenotiazinic fotossensitizers (FS) (methylene blue - AM, tionin - TIO and azure B - AB) was studied into mitochondria and Hela cells, and AM dosimetry into HL60 cells was determined. AM binding to mitochondria is dependent of mitochondrial concentration, AM concentration and mitochondrial membrane potentials (Δ Ψ). Singlet oxygen generation from AM is influenced by Δ Ψ, almost doubling in uncoupled mitochondria. This effect is due to the influence of Δ Ψ on AM dimer/monomer (D/M) ratio. Also, AM binding drops to half into uncoupled mitochondria. For all the others FSs studied, these effects were not observed, even though they present the same Δ Ψ action over AM. charge and similar structure. This indicates a specific FSs toxicity was observed in Hela cells. In the dark, only AB showed toxicity. In irradiated samples, AM and AB showed toxicity. All the tested FSs showed capacity to induce sub-diploid nuclei formation, a hallmark of apoptosis, with AB showing the highest efficiency. AB showed high toxicity in both (irradiated and non-irradiated) conditions, TIO showed low toxicity in both conditions and AM showed low toxicity in the dark and high toxicity with laser irradiation. The dose that promotes apoptotic cell death in HL60 cells was also tested. Results 2 were observed at 10 µM AM, with laser irradiation (fraction or continuous) of 0,55 J/cm . These doses were the lowest doses tested, indicating that high doses of FS or laser induce necrotic cell death. We conclude that phenotiazinic FSs have affinity for mitochondria and cells, and induce apoptosis at doses that are not toxic without irradiation

A terapia fotodinâmica (TFD) associada à administração tópica de agentes fotossensibilizantes é uma terapia promissora para o tratamento tópico do câncer de pele. A protoporfirina IX (PpIX) é uma substância fotodinamicamente ativa usada na TFD, entretanto, devido a sua alta lipofilia ela forma agregados em meio aquoso, o que diminui sua atividade fotodinâmica e dificulta sua administração na pele. Assim, sistemas de liberação nanoparticulados vêm sendo investigados para melhorar a distribuição da PpIX na pele e facilitar sua penetração até as células tumorais. Os dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) representam uma nova geração de nanosistemas que tem despertado grande interesse nos últimos anos. Eles são uma classe especial de polímeros que apresentam estrutura muito ramificada e regular e que interagem com a PpIX formando complexos (nanopartículas dendriméricas de PpIX-PAMAM). A aplicação de uma corrente elétrica de baixa intensidade, conhecida como iontoforese, pode influenciar na penetração cutânea dessas nanopartículas, direcionando-as para o interior das células. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da iontoforese e de nanopartículas de PAMAM de geração 4 hidroxilado (PAMAM G4-OH) com a PpIX na localização subcelular e penetração deste agente fotossensibilizante em tumores cutâneos. Assim foram preparados complexos de PpIX-PAMAM, os quais foram caracterizados em função do tamanho de partículas e potencial zeta. A localização subcelular da PpIX a partir dos complexos foi investigada em carcinoma de células escamosas. A influência dos complexos na geração de oxigênio singleto quando a PpIX sofre irradiação também foi avaliada. Por fim, a penetração da PpIX a partir dos complexos PpIX-PAMAM foi avaliada, in vivo, em pele sadia e em tumores induzidos em camundongos Nude BalbC, com e sem aplicação da iontoforese. O tamanho médio das nanopartículas dendriméricas contendo a PpIX dispersas em meio aquoso foi de aproximadamente 220 nm. Quando avaliadas em função do tempo, este tamanho sofreu um aumento de apenas 5% depois de 24 h, permanecendo constante por 7 dias. O potencial zeta das dispersões foi de 10 mV, em pH 7, e de 30 mV, em pH 5,5, possibilitando a contribuição da eletromigração durante a iontoforese. Nos estudos em cultura de células tumorais observou-se que a complexação com o PAMAM aumentou 30 vezes a localização da PpIX na mitocôndria quando comparada a PpIX livre. Além disso, a quantidade de oxigênio singleto gerada foi semelhante para a PpIX livre não agregada e complexada, 4,3 x 10-3 e 4,6 x 10-3 , respectivamente, sugerindo que o PAMAM manteve a atividade fotodinâmica da PpIX. Nos experimentos in vivo, em pele sadia, verificou-se que a PpIX administrada a partir do complexo com o PAMAM se distribuiu homogeneamente pela pele, enquanto que a PpIX livre apresentou uma fluorescência localizada em apenas algumas área da superfície da pele. A iontoforese facilitou a penetração da PpIX para as camadas mais profundas da pele. Finalmente, no tratamento dos tumores cutâneos, a administração tópica dos complexos por apenas 30 min possibilitou a penetração da PpIX até os tumores localizados abaixo da pele, em concentrações semelhantes para a aplicação passiva e iontoforética. Portanto, a complexação da PpIX com o PAMAM é um sistema de liberação nanoparticulado promissor para o tratamento tópico de tumores cutâneos por TFD. / Photodynamic therapy (PDT) associated with topical administration of photosensitizer agents is a promising therapy for topical treatment of skin cancer. Protoporphyrin IX (PpIX) is a photosensitizer commonly used in PDT; however, due to its high lipophilicity it aggregates in aqueous medium, which decreases its photodynamic activity and hinders its penetration through the skin. In this way, nanoparticles have been designed to improve the distribution of PpIX in the skin and enhance its tumor cell penetration. The polyamidoamine dendrimers (PAMAM) represent a new generation of nanosystems that has aroused great interest in recent years. They are hyberbranched polymers capable to form complexes with PpIX (PpIX-PAMAM), increasing PpIX aqueous solubility. The application of a low intensity electrical current, known as iontophoresis, may influence the nanoparticles skin penetration, directing them to the tumor cells. Therefore, the aim of this study was to evaluate the influence of iontophoresis and PpIX-PAMAM G4-OH complexes in PpIX subcellular localization and penetration into skin tumors. The complexes were prepared and characterized as a function of particle size and zeta potential. The subcellular localization of PpIX from the complexes was investigated in squamous cell carcinoma. The influence of PpIX-PAMAM on the generation of singlet oxygen after irradiation was also evaluated. Finally, the penetration of PpIX from the PpIX-PAMAM complexes was evaluated in vivo in healthy skin and in tumors induced in BalbC nude mice with and without application of iontophoresis. The average size of PpIX-PAMAM nanoparticles dispersed in aqueous medium was approximately 220 nm. When evaluated as a function of time, this size was increased only 5% after 24 h and remained constant for 7 days. The zeta potential of the dispersions was 10 mV at pH 7 and 30 mV at pH 5.5, allowing the contribution of electromigration during iontophoresis. In studies in culture tumor cells it was observed that complexation with PAMAM increased 30 times the localization of PpIX in the mitochondria compared to free PpIX. Furthermore, the amount of singlet oxygen generated when PpIX-PAMAM was irradiated was similar to that generated by the irradiation of the non-aggregated free PpIX, 4.6 x 10-3 and 4.3 x 10-3, respectively, suggesting that PAMAM did not modify the photodynamic activity of PpIX. In vivo experiments on healthy skin have shown that PpIX from the PpIX-PAMAM was homogeneously distributed throughout the skin, whereas free PpIX fluorescence was visualized only in some restricted areas of the skin surface. Iontophoresis facilitated PpIX diffusion to deep layers of the skin. Finally, the treatment of skin tumors have shown that the topical administration of the PpIX-PAMAM for only 30 min, passively or by iontophoresis, allowed the penetration of PpIX into the tumors located below the skin. Therefore, the PpIX complexation with PAMAM is a promising nanoparticle delivery system for the topical treatment of skin tumors by PDT.

A imobilização de fotossensibilizadores (FS) em materiais nanométricos tem se mostrado uma excelente alternativa ao seu emprego na forma molecular para terapia fotodinâmica (PDT). O presente trabalho descreve uma série de estratégias sintéticas desenvolvidas para a imobilização de FS em nanoesferas de sílica contendo núcleos magnéticos, bem como o estudo das propriedades foto-químicas, foto-físicas e morfológicas dos nanomateriais obtidos. Os FS utilizados foram o azul de metileno, tionina, azure A, protoporfirina IX, hematoporfirina IX e clorofilina. As metodologias de imobilização empregadas envolveram a adição do FS durante o crescimento da camada de sílica ou a ligação do FS na superfície do nanomaterial já formado. Em alguns casos foi necessário modificar previamente o FS com organossilanos. Os núcleos magnéticos foram preparados por co-precipitação de sais de ferro(II) e ferro(III) em meio básico e o revestimento com sílica foi realizado utilizando-se tetraetilortossilicato em uma microemulsão. Os núcleos magnéticos revestidos com uma camada de sílica mantiveram o comportamento superparamagnético. Para a tionina e o azul de metileno não foi detectada geração de oxigênio singlete após a imobilização. Para o azure A, protoporfirina IX e clorofilina imobilizados, a geração de oxigênio singlete foi detectada e caracterizada por métodos químicos e físicos. O material contendo clorofilina mostrou-se bastante promissor e foi empregado em estudos preliminares com células HeLa, levando à morte celular após irradiação, o que comprova o potencial para PDT. O comportamento do fotossensibilizador imobilizado e a possível proteção extra fornecida pela camada de sílica foram estudados pela supressão de fluorescência com íons brometo e supressão da geração de oxigênio singlete com albumina de soro bovino. Hematoporfirina IX é mais afetada na forma livre do que imobilizada em nanoesferas de sílica, o que indica que o FS imobilizado é capaz de gerar oxigênio singlete e está mais protegido de interferentes. / The immobilization of photosensitizers (PS) in nanometric materials is an excellent alternative to their use in molecular forms for photodynamic therapy (PDT). The present work describes a series of synthetic strategies for the immobilization of PS on silica nanospheres containing magnetic nucleous, as well as the studies of the photochemical, photophysical and morphological properties of the obtained materials. The studied PS were methylene blue, thionin, azure A, protoporphyrin IX, hematoporphyrin IX and chlorophyllin. The immobilization methodologies involve the addition of PS during the growth of the silica shell or the attachment of PS to the material surface. Often, a previous modification of the PS with organosilanes was necessary. The magnetic cores were prepared by co-precipitation of iron(II) and iron(III) salts in basic media and the coating with silica was performed by a microemulsion using TEOS. After coating with silica, the magnetic nanomaterial maintained the superparamagnetic behavior. The generation of singlet oxygen by thionin and methylene blue was not detect after immobilization. The generation of singlet oxygen by immobilized azure A, protoporphyrin IX and chlorophyllin was detected and characterized by chemical and physical methods. The material containing chlorophyllin is promising for PDT and was applied in preliminary studies with HeLa cells, causing cell death after irradiation. The behavior of the immobilized PS and the possible extra protection given by the silica shell were investigated by fluorescence quenching with bromide ions and by suppression of singlet oxygen generation with bovine serum albumin. Hematoporphyrin IX was more affected in the free form than immobilized in silica nanospheres, which indicates that the immobilized FS still generates singlet oxygen and is more protected against interfering species

A cápsula endoscópica é um instrumento revolucionário, que permite a realização de um exame livre de desconfortos para o paciente e possibilitou a técnica de endoscopia chegar a partes do sistema gastrointestinal que antes não era possível, como grande parte do intestino delgado. Este trabalho apresenta um módulo fotônico para realizar Terapia Fotodinâmica (PDT, Photodynamic Therapy) em cápsulas endoscópicas. A PDT é uma forma de tratamento para lesões que envolve a administração prévia de um medicamento fotossensível (PS, Photosensitizer) e posterior ativação com irradiação de luz em um comprimento de onda (λ) específico. Geralmente para a ativação do PS utiliza-se λ na região vermelha do espectro visível, pois a penetração nos tecidos é elevada. Células de adenocarcinoma gástrico humano (AGS, Adenocarcinoma Gastric of Stomach) foram preparadas com ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) que é um Pró-fármaco precursor do agente fotossensível Protoporfirina IX (PpIX) com máximo de absorção nos 635 nm. Para realizar a irradiação com luz vermelha nas células, 16 LEDs do modelo LRQ396-P1Q2-1 da Osram Opto Semiconductors com dimensões muito reduzidas foram selecionados, caracterizados, montados em uma PCB (Printed Circuit Board) e alimentados por um Arduino Mega 2560. Este sistema de iluminação foi eficaz em seu propósito e causou morte celular nas células submetidas ao tratamento com o ALA em uma concentração de 2 milimol por litro e dose de luz em 5 Joules por centímetro quadrado que resulta em uma exposição de 49 minutos. Com o objetivo de se construir um módulo para controle de iluminação em cápsulas endoscópicas, foi desenvolvido em tecnologia CMOS 0.7 μm da ON Semiconductor um dispositivo capaz de controlar a intensidade dos LEDs utilizando PWM (Pulse Width Modulation). Unindo este componente com os LEDs selecionados é perfeitamente possível construir o módulo e inseri-lo CEs para realizar PDT em locais do trato gastrointestinal (GI) não acessíveis pela endoscopia convencional. / The endoscopic capsule is a revolutionary instrument that gives a free examination of discomforts for patient and allows the endoscopic technique to reach parts of the gastrointestinal system that were previously not possible, such as a large part of the small intestine. This work presents a photonic module to perform Photodynamic Therapy (PDT) in endoscopic capsules. PDT is a form of treatment for injuries involving prior administration of a photosensitive drug (PS, Photosensitizer) and subsequent activation with light irradiation at a specific wavelength (λ). Usually for PS activation, λ is used in the red region of the visible spectrum, because the tissue penetration is high. Human gastric adenocarcinoma cells (AGS) were prepared with 5-aminolevulinic Acid (5-ALA) which is a Pro-drug precursor of the photosensitive agent Protoporphyrin IX (PpIX) with maximum absorption at 635 nm. To perform red light irradiation on the cells, 16 LEDs, model LRQ396-P1Q2-1 of the Osram Opto Semiconductors with very small dimensions were selected, characterized, mounted on a PCB (Printed Circuit Board) and powered by an Arduino Mega 2560. This system was effective in its purpose and caused cell death in cells treated with ALA at a concentration of 2 mMol/L and dose of light at 5 J/cm² resulting in a 49 minutes exposure. With the objective of build a module for control of lighting in endoscopic capsules, a device able to controlling the intensity of the LEDs using PWM (Pulse Width Modulation) was developed in CMOS technology 0.7 μm of the ON Semiconductor. Combining this component with the selected LEDs, it is perfectly possible to construct the module and insert in CEs to perform PDT at sites of the gastrointestinal tract (GI) not accessible by conventional endoscopy.

Os benefícios gerados pela luz do sol foram observados desde a origem da humanidade. A terapia fotodinâmica é a mais nova modalidade de tratamento com luz, que envolve a administração do fármaco fotossensível, o qual se deposita preferencialmente nas células que se deseja a ação, seguido por seletiva iluminação da lesão com luz na região do visível. A ftalocianina de cloro-alumínio (AlClPc) e a indocianina verde são apontados como potenciais fármacos nesta terapia, sendo bastante utilizados atualmente. Foram preparados complexos de ciclodextrinas de ftalocianina de cloro-alumínio e hidroxipropil-beta ciclodextrina e beta-ciclodextrina, incorporados em lipossomas com a indocianina verde, com o propósito de avaliar o sinergismo da ação, proporcionado pela associação de sistemas de liberação e de fármacos fotossensíveis, na terapia fotodinâmica. Quando avaliado isoladamente os complexos de ftalocianina e ciclodextrinas demonstraram valores diferentes da constante de associação demonstrando maior complexação com hidroxipropil-beta ciclodextrina. No entanto, os derivados de ciclodextrinas estudados melhoraram as propriedades fotofísicas do fármaco. Na avaliação das propriedades fotobiológicas, nenhuma toxicidade foi observada para a ftalocianina complexada com ciclodextrinas nem com lipossomas. Na avaliação do complexo de ftalocianina de cloro-alumínio/ciclodextrinas na presença de luz, houve um alto índice de morte celular. No caso da associação dos complexos de AlClPc incorporados nos lipossomas juntamente com a ICV as preparações também demonstraram que as modificações geradas pela incorporação dos fármacos fotossensíveis favoreceram as propriedades espectroscópicas necessárias para a ação dos fármacos na PDT, com conseqüente redução da agregação e alterações significativas nas propriedades fotofísicas e fotobiológicas dos fármacos. Os complexos de ciclodextrinas incorporados nos lipossomas com indocianina verde se apresentaram estáveis como sistemas de liberação, após liofilização, garantindo a característica de vesícula unilamelar pequena. Neste trabalho observa-se claramente o sinergísmo garantido por associação dos dois fármacos fotossensíveis e de sistemas de liberação sugerindo uma nova área de pesquisa na terapia fotodinâmica. / The benefits generated by sunlight were observed from the origin of humanity. Photodynamic therapy is the new form treatment of light, which involves the administration of the photosensitizer drug which is targeting preferentially in diseased cells, followed by selective illumination of the lesion with visible light. The aluminum chloride phthalocyanine and indocyanine green are studied as potential drugs this therapy and often used. Were development complex of hydroxypropyl-beta cyclodextrin and beta-cyclodextrin with aluminum chloride phthalocyanine entrapment in liposomes with indocyanine green in order to studed the synergism of action, provided by association of both release and photosensitizer drugs, in photodynamic therapy. Complexes of phthalocyanine with different cyclodextrins derivatives showed different values of the association constant showing greater complexation with hydroxypropyl-beta cyclodextrin.However the derivatives of cyclodextrins studied improved the drug photophysical properties. In evaluating the photobiological properties, no toxicity was observed for phthalocyanines complexed with cyclodextrins or liposomes.Althought the evaluation of phthalocyanine complex excited by light, showed a higher rate of cell death. When the complexes where incorporated in liposomes plus indocyanine green photosensitizer drugs improved the spectroscopic properties necessary for the action of drugs in PDT reduced aggregation and significant improved in the photophysical and photobiological properties of drugs. Complexes of cyclodextrins incorporated in liposomes with indocyanine green showed stable drug delivery systems, after freeze-drying and keeping a small unilamellar vesicle.This work showed that there is clearly synergism by the association two photosensitizers and drug delivery systems and represents a great contribution for a new area of research in photodynamic therapy.

A mastite bovina destaca-se negativamente no cenário mundial em decorrência aos prejuízos ocasionados pelo seu dispendioso tratamento, sendo considerada a principal doença que acomete a pecuária leiteira. Como alternativa ao uso de antibióticos, a terapia fotodinâmica se apresenta como uma opção terapêutica no tratamento de infecções locais, que atua sem que haja seleção de micro-organismos resistentes. Seu mecanismo de ação resulta da interação entre uma substância fotossensibilizadora e luz em comprimento de onda ressonante, promovendo a formação de espécies reativas de oxigênio que apresentam ação citotóxica contra micro-organismos. O objetivo deste estudo foi investigar a habilidade da terapia fotodinâmica, in vitro, para inativar cepas causadoras da mastite bovina. Culturas de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Corynebacterium bovis e Prototheca zopfii suspensas em PBS foram estimadas por meio da turbidez da suspensão correspondendo à concentração de 107 UFC/mL, caracterizando desta forma, oito grupos avaliados: controle (C), luz LED vermelho (L) =660nm/2 minutos de irradiação (12,22J/cm2), AM (azul de metileno - 1mM), PDT 5 segundos (0,50J/cm2), PDT 10 segundos (1,01J/cm2), PDT 30 segundos (3,05J/cm2), PDT 1 minuto (6,11J/cm2) e PDT 2 minutos (12,22J/cm2) de irradiação. Os grupos tratados com AM e Luz isoladamente não apresentaram ação citotóxica sobre os micro-organismos avaliados. S. dysgalactiae, S. aureus, C. bovis foram inativados sob 30 segundos de irradiação (3,05J/cm2); S. agalactiae e P. zopfii foram inativados sob 2 minutos de irradiação (12,22J/cm2). / Bovine mastitis stands out negatively on the world scenario due to the damage caused by its expensive treatment, being considered the main disease affecting dairy cattle. As an alternative to antibiotics, photodynamic therapy is presented as a therapeutic option in the treatment of local infections, which acts without any selection of resistant microorganisms. Its mechanism of action results from the interaction between a photosensitizing substance and light in the resonant wavelength, promoting the formation of reactive oxygen species, which have cytotoxic activity against micro -organisms. The aim of this study was to investigate, in vitro, the ability of photodynamic therapy to inactivate strains that cause bovine mastitis. Cultures of Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Corynebacterium bovis and Prototheca zopfii suspended in PBS were estimated by the turbidity of the suspension corresponding to a concentration of 107 CFU / mL, characterizing eight study groups: control (C), light - red LED (L) = 660nm / 2 minutes of irradiation (12.22J/cm2), BM (methylene blue - 1 mM ), PDT 5 seconds (0.50 J/cm2 ), PDT 10 seconds (1.01J/cm2), PDT 30 seconds (3.05 J/cm2 ), PDT 1 minute (6.11 J/cm2) and PDT 2 minutes (12.22 J/cm2) of irradiation. The groups treated with methylene blue and light alone had no cytotoxic effect on microorganisms evaluated. S. dysgalactiae, S. aureus, C. bovis were inactivated after 30 seconds of irradiation (3.05 J/cm2 ); S. agalactiae and P. zopfii were inactivated after 2 minutes of irradiation (12.22 J/cm2).

Objetivo: Alternativas para o tratamento da doença periodontal necessitam ser testadas e uma opção viável parece ser o uso da terapia antimicrobiana fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da terapia antimicrobiana fotodinâmica através das alterações no perfil microbiológico e no padrão de citocinas após o tratamento da doença periodontal induzida por ligaduras em cães. Métodos: Para tanto, foi induzida doença periodontal através da colocação de ligaduras em torno dos pré-molares mandibulares bilaterais em oito cães. Após a indução da doença os sítios foram aleatoriamente tratados através de raspagem e alisamento radicular (RAR) com instrumentos manuais, terapia antimicrobiana fotodinâmica (TAF) com a utilização de uma fonte de luz laser associada a um fotosensitizador, ou através da combinação das terapias. Para a análise da resposta dos sítios frente aos tratamentos, diferentes tempos experimentais foram utilizados (baseline, uma, três e quatro semanas) onde foram coletadas amostras de placa dentobacteriana subgengival e a contagem de 40 espécies microbianas foi determinada através da técnica de hibridização DNA-DNA. Além disso, amostras de tecidos periodontais foram removidas e a expressão gênica de diferentes citocinas (TNF-&alpha;, RANKL, OPG, MMP-1, IL-6 e IL-10) foi determinada pela técnica de reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real. Os dados foram analisados através dos testes de equações de estimação generalizadas (EEG) e análise da variância (ANOVA) com um nível de significância de 0,05. Resultados: Os dados demonstraram uma redução dos níveis da maioria das espécies bacterianas monitoradas após uma semana para todos os tratamentos realizados (P < 0,001), no entanto, um aumento na contagem média de P. intermedia (P <0,01), P. nigrescens (P < 0,001) e T. forsythia (P < 0,05) foi observado para os sítios tratados por TAF e por RAR + TAF. Após quatro semanas foi observada uma possível recolonização de P. gingivalis e T. denticola, para todos os tratamentos testados (P < 0,001). A contagem média de T. forsythia manteve-se elevada durante o curso do estudo, especialmente para TAF e RAR + TAF. Adicionalmente foi observada uma notável redução da contagem média de A. actinomycetemcomitans para o grupo TAF (P < 0,001). Em relação ao perfil das citocinas avaliadas, os resultados foram similares para todos os tratamentos testados. O fator tempo foi considerado estatisticamente significante independente do tratamento realizado (P < 0,001) e não foi observada influência dos tratamentos sobre os resultados (P > 0,05). Foi observada uma redução progressiva na expressão das citocinas durante os períodos de observação, entretanto entre os períodos de três e quatro semanas não houve diferença estatisticamente significante (P > 0,05). Conclusões: De acordo com o modelo experimental utilizado neste estudo os dados sugerem que os tratamentos testados afetaram diferentemente as espécies bacterianas monitoradas e apresentaram um efeito similar na expressão das citocinas avaliadas. / The purpose of this study was to evaluate the effect of a single application of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) on microbiological profile and cytokine pattern in dogs. Periodontal disease was induced by placing 3.0 silk ligatures around the mandibular pre-molars bilaterally during 8 weeks. The dogs were randomly treated with aPDT using a dye/laser system, scaling and root planning (SRP) or with the association of treatments (SRP+aPDT). Plaque samples were collected at baseline, 1, 3 and 4 weeks and the mean counts of 40 species were determined using DNA-DNA hybridization. Gingival biopsies were removed and the expression of tumor necrosis factor alpha (TNF-&alpha;), receptor activator of NF-kB ligand (RANKL), osteoprotegerin (OPG), matrix metalloproteinase (MMP-1), interleukin (IL) 6, IL-10 and total bacterial load by analysis of 16S rRNA gene were evaluated through RealTime PCR. The results shows that the levels of the majority of the species were reduced one week post therapy for all treatments, however, an increase in counts of Prevotella intermedia (P =0.00), Prevotella nigrescens (P =0.00) and Tannerella forsythia (P =0.00) was observed for aPDT and SRP+aPDT. After 4 weeks a regrowth of Porphyromonas gingivalis (P =0.00) and Treponema denticola (P =0.00), was observed for all treatments, also a strikingly reduction of counts on counts of Aggregatibacter actinomycetemcomitans was observed for the aPDT (P =0.00). For the cytokine pattern the results were similar for all treatments and it was observed a reduction in the expression of cytokines and bacterial load throughout the study. Our results suggest that SRP, aPDT in a single application and SRP+aPDT affects different bacterial species and have similar effects on the expression of cytokines evaluated during the treatment of ligature-induced periodontitis.

A peri-implantite acomete um número crescente de indivíduos e os protocolos de tratamento objetivam descontaminar as superfícies dos implantes e torná-las novamente osseointegráveis. Porém, ainda não foi estabelecido um padrão ouro de tratamento para peri-implantite. Este estudo testa o poder de descontaminação do laser em baixa intensidade (LBI), da terapia fotodinâmica (PDT) e do azul de toluidina O (TBO). Sobre discos de titânio de 1,5 mm de espessura e 4,0 mm de diâmetro de superfícies lisas ou rugosas foi permitida a deposição natural de biofilme microbiano por 7 dias após os quais os discos foram divididos em grupos experimentais (15 discos por grupo), de acordo com o método de descontaminação: grupo LBI (laser de InGaAlP de 660 nm, 30 mW, 45 J/cm2 no modo continuo por 30 s); grupo PDT; grupo TBO (aplicação de TBO por 60 s); grupo controle positivo (C) sem tratamento e grupo controle negativo (NC) estéril. Os discos foram implantados em tecido conjuntivo subcutâneo de ratos e, após 7, 28 e 84 dias, foram obtidas 5 biópsias de cada grupo para análise em microscopia óptica. Implantes lisos e rugosos não diferiram com relação ao grau de fibrosamento e severidade do infiltrado inflamatório, mas a área do tecido reacional perimaterial foi maior nos rugosos (2,6 ± 3,7 x 106 µm2) do que nos lisos (1,9 ± 2,6 x 106 µm2). O grupo C foi o que apresentou menor grau de fibrosamento do tecido reacional (1), mas somente houve diferença estatisticamente significante (p = 0,0230) entre os grupos C e NC. A severidade do infiltrado inflamatório somente diferiu significantemente entre os grupos aos 7 dias, quando o grupo NC apresentou o menor escore (2) em comparação aos demais grupos (3). Com relação à área do tecido reacional perimaterial, só houve diferenças entre os grupos aos 7 dias, quando o grupo C apresentou maior área que os demais grupos (9,11 ± 2,10 x 106 µm2), porém, sem diferença estatisticamente significante em comparação aos grupos LBI e TBO. A área apresentada pelo grupo PDT (4,34 ± 1,49 x 106 µm2) só foi inferior ao grupo NC (0,65 ± 0,23 x 106 µm2). A espessura do tecido reacional não confirmou a diferença entre os discos de superfície lisa e os de superfície rugosa (p = 0,2801), mas confirmou todas as demais comparações relativas à área, sendo que o grupo NC apresentou menor espessura que os demais somente aos 7 dias. O grupo NC apresentou menor espessura de tecido reacional do que os demais grupos, mas essa diferença foi estatisticamente significante somente aos 7 dias. Os demais grupos não diferiram entre si quanto a esse parâmetro. Concluiu-se que implantes rugosos ou lisos contaminados por biofilme microbiano e tratados com LBI, PDT e TBO não diferem entre si quanto aos parâmetros inflamatórios teciduais, parecendo haver leve superioridade da PDT sobre os demais tratamentos apenas no período mais precoce de observação. Porém, com o passar do tempo, todos os tratamentos se equiparam a implantes estéreis quanto à reação tecidual perimaterial. / The peri-implantitis is a disease that is increasing in a number of individuals and the protocols of treatment has intended to decontaminate the implant surfaces and makes this biocompatible again. However, until this moment, a gold standard for peri-implantitis treatment was not established. The present study tests the power of decontamination of low intensity laser (LBI), photodynamic therapy (PDT) and toluidine blue O (TBO). The natural deposition of microbian biofilm was allowed on titanium discs with 1,5 mm of thickness and 4,0 mm of diameter and smooth and grooved surfaces during 7 days when the discs were separated in experimental groups (15 discs each group), in accordance with the decontamination method: LBI group (decontamination with InGaAlP laser, 660 nm, 30 mW, 45 J/cm2 in continuous way during 30 s); PDT group; TBO group (application of TBO during 60 s); controlled positive group (C) without any kind of treatment and controlled negative group (NC), sterile. The discs had been implanted in rats subcutaneous connective tissue and, after 7, 28 and 84 days, had been gotten 5 biopsies from each group for histology processing. Smooth and grooved implants did not differ on fibrosis grade and severity of the inflammatory infiltrate, however the perimaterial reaction tissue area was bigger on grooved implants (2,6 ± 3,7 x 106 µm2) that on smooth implants (1,9 ± 2,6 x 106 µm2). The C group was the one that showed the smallest reaction tissue fibrosis grade (1), but only was significant statistical difference (p = 0,0230) between C and NC groups. The severity of inflammatory infiltrate only significant differed between the groups on 7 days, when the NC group showed the smallest score (2) in comparison to the others groups (3). In relation to the perimaterial reaction tissue area, only were differences between the groups on 7 days, when C group showed bigger area than the others (9,11 ± 2,10 x 106 µm2), nevertheless, without significant statistical difference in Comparison to LBI and TBO groups. The area presented by PDT group (4,34 ± 1,49 x 106 µm2) only was inferior to NC group (0,65 ± 0,23 x 106 µm2). The reaction tissue thickness did not confirmed the difference between smooth and grooved surfaces discs (p = 0,2801), however it confirmed all the comparisons related to the area parameter, where NC group showed smaller thickness than the others only on 7 days. NC group showed smaller thickness than the others, but this difference was statistical significant only on 7 days. The other groups did not differ among them in this parameter. It was concluded that grooved and smooth implants contaminated by a microbian biofilm ant treated with LBI, PDT and TBO did not differed among them in relation to tissue inflammatory parameters, seems that is a light superiority of PDT in relation to the others only in the earliest period of observation. Nevertheless, with the time, all the treatments were equally to sterile implants in relation to perimaterial reaction tissue.

A acne é a mais comum doença de pele encontrada pelos dermatologistas, representando cerca de 30% das consultas, onde esta é considerada crônica, pois apresenta alto grau de recidiva podendo acometer 50% da população na vida adulta. Diversos estudos evidenciam bons resultados para tratamento da acne através de fototerapias, entretanto, alguns trabalhos enfatizam que esta modalidade terapêutica é ainda recente e que estudos adicionais e mais detalhados devam ser realizados. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho é o estudo da viabilidade de um protótipo integrado para o diagnóstico e tratamento da acne por técnicas ópticas, visando o desenvolvimento de um equipamento para diagnóstico por imagens de fluorescência e um sistema de tratamento por fototerapia para a eliminação das bactérias causadoras da acne, assim, propondo novas soluções para o diagnóstico e tratamento da acne. Para isso foi realizado o desenvolvimento do protótipo-v1 que é constituído pelo sistema de diagnóstico por imagens de fluorescência composto por 01 LED violeta em 405 nm para excitação das amostras (80 mW/cm2), um sistema de filtros e lentes para formação das imagens de fluorescência e uma câmera para a captura das imagens. O sistema de tratamento é composto por 01 LED UV em 405 nm que proporciona uma intensidade de irradiação de 150 mW/cm2 com um diâmetro de 40 mm. Para validação do protótipo-v1 foram realizados seis experimentos distintos, sendo: 1 &#8211; Avaliou-se as configurações iniciais do protótipo eram adequadas para a visualização de bactérias presentes no rosto, foram adquiridas imagens de fluorescência na região do nariz; 2 &#8211; Avaliou-se a detecção de bactérias presentes em quatro diferentes regiões da face; 3 &#8211; Avaliou-se somente com uma lavagem simples é possível fazer a remoção e eliminação das bactérias presentes no rosto; 4 &#8211; Avaliou-se a detecção da presença de bactérias no couro cabeludo que são possíveis causadoras de caspa e se ocorre uma maior formação de bactérias no couro cabeludo ao longo do tempo. 5 &#8211; Avaliou-se in vivo, em um voluntário, o sistema de diagnóstico e tratamento da acne do protótipo-v1; 6 &#8211; Avaliou-se in vitro e in vivo, 40 voluntários, o sistema de diagnóstico e tratamento da acne do protótipo-v1. Como resultado foi possível realizar a detecção da bactéria P. acnes e fazer uma análise de sua presença, formação e declínio em seis experimentos, através de processamento de imagens e análises comparativas. Sendo que no experimento 1 a 4 avaliou-se a qualidade e as configurações do equipamento de diagnóstico por fluorescência e os experimento 5 e 6 avaliaram tanto o sistema de diagnóstico como o sistema de tratamento. Assim, através destes experimentos realizados foi possível demostrar uma viabilidade da utilização do protótipo-v1 como sistema de diagnóstico e tratamento da acne, demonstrando que é possível se realizar o monitoramento das bactérias causadoras da acne através das imagens de fluorescência e o tratamento da acne utilizando técnicas ópticas. / Acne is the most common skin disease found by dermatologists, representing about 30% of the consultations, where it is considered chronic, because has a high degree of recurrence and can affect 50% of the population in adult life. Several studies have shown good results for treatment of acne via phototherapy, however, some studies emphasize that this type of treatment is still new and additional and more detailed studies should be conducted.In this context, the aim of this work is the viability study of an integrated prototype for acne diagnosis and treatment by optical techniques, aiming at the development of a system for diagnosis by fluorescence imaging and phototherapy for treatment and elimination of bacteria that cause the acne, therefore offering new solutions for the acne diagnosis and treatment. For this, the prototype v1 was developed, which is constituted for diagnostic system by fluorescence image composed of one violet LED at 405 nm for excitation of the samples (80 mW / cm2), a system of filters and lenses for the formation images of fluorescence and a CCD camera to capture the images. The treatment system is composed of one violet LED at 405 nm which provides an irradiation intensity of 150 mW/cm2 with a diameter of 40 mm. For validation of prototype v1 were conducted six different experiments, as follows: 1 - Were evaluated initial prototype settings for the visualization of bacteria in the face for that, were acquired fluorescence images in the nose; 2 - Were evaluated detection of bacteria in four different regions of the face; 3 - Was evaluated only with simple washing can make removal and elimination of bacteria from the face; 4 - Was evaluated detecting the presence of bacteria on the scalp which are possible cause of dandruff and there is a greater formation of bacteria in the scalp along of the time; 5 - Was evaluated in vivo, in a voluntary, the prototype of the system of diagnosis and treatment of acne; 6 - Was evaluated in vitro and in vivo, 40 volunteers, the prototype of the system of diagnosis and treatment of acne. As a result, was possible to detect the P. acnes bacteria and do an analysis of their presence, formation and decline in six experiments, through image processing and comparative analysis. Where in experiment 1 to 4 was evaluated the quality and configurations of diagnostic fluorescence prototype and 5 to 6 experiments evaluating both the diagnostic and treatment system. Thus, through these experiments it was possible to demonstrate the viability of using one prototype v1 as diagnostic system and acne treatment, demonstrating that it is possible to perform the monitoring of acne causing bacteria via fluorescence imaging and treatment of acne using optical techniques.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento de câncer que consiste na interação de três componentes: fotossensibilizador (FS), luz para ativar o FS e o oxigênio presente nos tecidos. Os estudos da fototoxicidade e do potencial de agente terapêuticos utilizados no tratamento do câncer, dentre eles os FSs, são realizados utilizando culturas celulares bidimensionais (2D) ou modelos animais. No entanto, os modelos 2D apresentam limitações, como impossibilitar sinais tão importantes que ocorrem in vivo, dentre eles o contato célula-célula e célula-matriz. Além disso, busca-se reduzir cada vez mais o número de animais em pesquisas científicas. Diante dessas limitações, nos últimos 30 anos tem sido desenvolvidos métodos alternativos in vitro que possam mimetizar melhor as complexas estruturas e funcionalidade dos sistemas in vivo. O objetivo desse estudo foi desenvolver um modelo de cultura de células tridimensional (3D) e um modelo de plataforma de cultura microfluídica para avaliar a viabilidade de células de carcinoma humano (HEp-2) após aplicação da terapia fotodinâmica com hipericina. O modelo 3D foi produzido utilizando-se colágeno tipo I aniônico e a plataforma de cultura microfluídica foi produzida utilizando-se lâmina de plástico, que serviu como base para o adesivo biocompatível utilizado para delimitar o canal celular e o poliéster, servindo como uma espécie de tampa para os dois materiais. A caracterização do biomaterial utilizado no modelo 3D foi realizada pela determinação da porosidade e diâmetro dos poros por meio da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e por ensaios de citotoxicidade pelo método de difusão em ágar e pelo método do MTT (ISO 10993-5). Os ensaios de citotoxicidade comprovaram que o biomaterial utilizado é biocompatível e não causa nenhuma citotoxicidade as células. A viabilidade celular da linhagem HEp-2 foi acompanhada no modelo 2D e 3D durante 168 h (sete dias) utilizando o método do MTT e na plataforma microfluídica por 24 h através de microscopia de fluorescência com perfusão contínua de meio de cultura. Em ambos os modelos as células apresentaram-se capazes de se manter aderidas e em multiplicação. Nos ensaios fototóxicos realizados no modelo 3D por meio do método do MTT, observou-se que a viabilidade celular diminui à medida que se aumenta a concentração da hipericina, mantendo-se a dose de luz e o tempo de incubação constantes, sugerindo que as células HEp-2 em cultura 2D apresentaramse mais sensíveis à TFD do que as células em cultura 3D. Os ensaios fototóxicos na plataforma microfluídica mostraram através da análise das imagens de microscopia de fluorescência que o tipo de morte celular preponderante foi a apoptose. Portanto, os resultados apresentados sugerem que é possível a realização de estudos de terapia fotodinâmica no modelo de cultura tridimensional bem como na plataforma microfluídica de cultura de células. / Photodynamic Therapy (PDT) is a cancer treatment modality consisting of the interaction of three components: photosensitizer (PS), light to activate the PS and oxygen present in the tissues. The studies about the toxicity and potential of therapeutic agents used for cancer treatment, among them the PS, are performed using 2D cell cultures or animal models. However, the 2D models have several limitations, such as making it impossible that important signals which occur in vivo, such as cell-cell and cell-matrix contact occur. In addition, it is importatnt to reduce the number of animals in scientific research. Due of the limitations of the twodimensional cell culture models and the need to reduce the use of animals in research, in the last 30 years alternative in vitro methods have been developed which t can better mimic the complex structures and functionality of in vivo systems. Therefore, the objective of this study was to develop a three-dimensional (3D) cell culture model and a microfluidic culture platform model to evaluate the viability of human carcinoma cells (HEp-2) after photodynamic therapy with hypericin. The 3D support was produced using type I collagen and the microfluidic culture platform was produced using a plastic blade which served as the basis for the surgical adhesive, used to delimit the cell canal and the polyester, serving as a sort of cap for both materials. The characterization of the biomaterial used in the 3D model was performed by determination of the porosity and pore diameter by Scanning Electron Microscopy (SEM) and by cytotoxic assays using the agar diffusion method and the MTT method (ISO 10993-5). It was observed that the biomaterial used in the 3D model is biocompatible and does not cause any cytotoxicity to the cells. The cell viability of the HEp-2 cells was monitored in the 2D and 3D models for 168 h (seven days) using the MTT method and in the microfluidic platform for 24 h by fluorescence microscopy with continuous perfusion of culture medium. In both models the cells are able to remain adherent and in multiplication. In the phototoxic assays performed on the microfluidic platform, the analysis of fluorescence microscopy images showed that the preponderant cell death type was apoptosis. Results suggest that is possible to perform photodynamic therapy studies in the three-dimensional culture model as well as in the microfluidic cell culture platform.