As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígeno do sistema imune. No entanto, trabalhos têm demonstrado seu envolvimento na manutenção da tolerância imunológica. As células T CD4+CD25+Foxp3+ possuem a capacidade de suprimir respostas imunes. Neste estudo avaliamos as alterações ocorridas na população de células T CD4+CD25+Foxp3+ após co-cultura de células de linfonodo com DCs. Nossos resultados demonstram que após a co-cultura há um aumento da população de células CD4+CD25+Foxp3+ de maneira independente do estado de ativação das DCs ou da presença de antígenos exógenos. No entanto, o aumento observado é maior quando DCs imaturas são incubadas com antígenos exógenos. Notamos ainda que há presença de TGF-ß em todas as condições experimentais em que observamos aumento da população de células CD4+CD25+Foxp3+. Nossos dados sugerem ainda que este aumento se deve à proliferação das células T CD4+CD25+Foxp3+. / Dendritic cells (DCs) are the most important antigen-presenting cells of the immune system. However, DCs have also been implicated in maintaining immunologic tolerance. CD4+CD25+Foxp3+ T lymphocytes are known as cells with regulatory properties. In this study we evaluated the changes in the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population after co-culture of lymph-node cells with DCs. Our results show an increase in the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population after co-culture and occurs regardless of the activation state of DCs and the presence of exogenous antigens; however it is greater when immature DCs are previously pulsed with exogenous antigen. We also noticed that TGF-? is present in all cultures conditions in which the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population increases. Our data also suggests that the increase of the CD4+CD25+Foxp3+ T cell population may be due to the proliferation of these cells.

Um grupo especial de indivíduos transplantados renais mantém a função do enxerto estável após a total retirada da terapia imunossupressora, alcançando um estado imunológico chamado de Tolerância operacional. Ainda não há marcadores moleculares e celulares que discriminem a tolerância no transplante humano, e os seus mecanismos estão sendo investigados. O perfil de peptídeos presentes na urina pode trazer informações importantes sobre o estado fisiopatológico renal. Nós investigamos se a tolerância operacional apresenta um perfil diferencial de peptídeos urinários, potencialmente, relevante para diagnóstico deste estado imunológico, assim como para a compreensão de seus mecanismos. Realizamos análises qualitativas do extrato de peptídeos da urina de indivíduos dos diferentes grupos do estudo: saudáveis (SA, n=6), tolerantes operacionais (TO, n=5), rejeição crônica (RC, n=8) e estável sob terapia imunossupressora convencional (EST, n=5), utilizando a abordagem proteômica de Shotgun. Identificamos um total de 15283 diferentes peptídeos em todos os grupos, correspondentes a 646 proteínas distintas, distribuídas nos diferentes grupos: TO = 189, RC = 296, EST = 205 e no grupo SA 219 proteínas. Observamos proteínas exclusivas dos diferentes grupos: TO teve 87 proteínas exclusivas, RC 168, EST 106 e SA 108 proteínas. Apesar das proteínas exclusivas não terem sido compartilhadas por todos os indivíduos do mesmo grupo, a totalidade dos indivíduos de cada grupo apresentou várias dessas proteínas (cada indivíduo apresentou em média 15% das proteínas exclusivas de seu grupo). Das 646 proteínas identificadas, apenas 2,3% foram classificadas pelo Gene ontology como relacionadas ao sistema imune e os compartimentos celulares mais frequentes foram: núcleo 36% e citoplasma 23%. Destacamos algumas proteínas relacionadas à resposta imune, exclusivas de alguns grupos, como no grupo TO, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) e Endothelin-1 e no grupo RC, a beta 2 microglobulina. Essas moléculas podem ter relevância nos mecanismos imunológicos desses estados clínicos. A abordagem proteômica aplicada neste trabalho permitiu a identificação de um perfil diferencial de peptídeos na urina de cada grupo diferente de estudo. Os peptídeos urinários diferenciais e suas respectivas proteínas podem ter relevância funcional ou como biomarcadores - em relação ao estado fisiológico e às diferentes evoluções clínicas no transplante renal / A special group of renal transplant recipients maintain stable graft function after the complete withdrawal of immunosuppression, achieving a state called operational tolerance. To date, there are no cellular or molecular biomarkers to discriminate human transplantation tolerance and the underlying mechanisms are being investigated. The profile of urinary peptides may provide important information about different renal physiopathological statuses. We investigated whether operational tolerance displays a differential urinary peptide profile, potentially relevant as biomarkers or for the understanding of mechanisms involved in tolerance. We performed qualitative analysis of peptide urinary extracts in individuals from different study groups: healthy (HI, n=6), operational tolerance (OT, n=5), chronic rejection (CR, n=8) e stable under conventional immunosuppression (Sta, n=5), using Shotgun proteomics. Altogether, we identified 15283 different peptides, corresponding to 646 distinct proteins, distributed in all groups: OT = 189, CR = 296, Sta = 205, and 219 proteins in HI. Several proteins were exclusively detected in specific groups: OT showed 87 exclusive proteins, CR 168, Sta 106 and HI 108 proteins. Although the exclusive proteins were not shared by all individuals from that specific group, all individuals from each group presented several of the group-exclusive proteins (each individual presented an average of 15% of the proteins exclusive to his group). Of the 646 proteins identified, only 2.3% were classified in Gene Ontology as related to the immune system and the most frequent cellular compartments were: 36% from nucleus and 23% cytoplasmic. Of notice, some proteins related to the immune response were also group-exclusive, such as, in OT, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) and Endothelin-1, and beta 2 microglobulin in CR. These proteins may display relevant roles in the mechanisms involved in these clinical statuses. In conclusion, the proteomic approach used in this study allowed the identification of a differential urinary peptide profile in each different study groups. The differential urinary peptides and their corresponding proteins may display a relevant role functional or as biomarkers - in the state of homeostasis and in different clinical outcomes in renal transplantation

INTRODUÇÃO: As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas presentes em todos os seres vivos. Elas possuem dupla atividade imunológica, induzindo tanto respostas proinflamatórias quanto imunorreguladoras. Em nosso grupo, estudamos os efeitos imunológicos dos peptídeos da HSP60 nos sistemas humano e murino. OBJETIVOS: Identificar peptídeos da HSP60 potencialmente imunorreguladores no sistema murino, visando a indução de tolerância no contexto do alotransplante. MÉTODOS: Analisamos a capacidade dos diferentes peptídeos de modificar, in vitro a expressão de genes predominantemente imunorreguladores (Foxp3, Gata-3, IDO, IL-4, IL-10, TGF?) ou inflamatórios (T-bet, IL-12p35, IL-12p40, IL-17) por PCR de tempo real, em esplenócitos murinos de animais naive. Consideramos as modificações induzidas pelos peptídeos como REGULA (?expressão de genes imunorreguladores ou ?expressão de genes inflamatórios) ou INFLAMA (?expressão de genes imunorreguladores ou ? expressão de genes inflamatórios). Selecionamos peptídeos que induziram predomínio de modificação da expressão gênica do tipo REGULA, mais promissores como imunorreguladores para ensaios in vivo de indução de tolerância ao aloenxerto de pele murino. RESULTADOS: Os peptídeos mais promissores foram N7, C4, N6, I8, N2 e N3. O peptídeo N7(n=9) induziu uma razão REGULA/INFLAMA=2,71 e induziu a redução da expressão gênica relativa de IL-17 e IL-12p40. O peptídeo C4 (n=6) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,63 e induziu redução da expressão gênica relativa de IL-17 e IL-12p40. O peptídeo N6 (n=8) induziu uma razão REGULA/INFLAMA=1,60, induziu a redução da expressão gênica relativa de T-bet e IL-12p40 e aumentou a expressão de IL-10. O peptídeo I8 (n=5) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,57 e induziu aumento da expressão gênica relativa de IL-17. O peptídeo N2 (n=8) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,32 e induziu redução da expressão gênica relativa de IL-17 e aumento da expressão de IL-10, IL-4 e T-bet. O peptídeo N3 (n=7) induziu razão REGULA/INFLAMA=1,25 e não teve destaques na modificação gênica induzida. O peptídeo N7 foi testado em protocolos para indução de tolerância do alotransplante de pele murino. Não houve diferença estatística entre os diferentes grupos, a despeito do aumento de sobrevida do aloenxerto de 7 dias no protocolo em combinação com o anticorpo ?CD3 (p=0,38, n=5). DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: O forte impacto imunorregulador de alguns peptídeos da HSP60 na expressão gênica de moléculas imunológicas indica que eles podem ser explorados em imunoterapias. Apesar da existência de variabilidade individual, o peptídeo N7 da HSP60 parece ser um promissor peptídeo imunorregulador. O discreto aumento da sobrevida do aloenxerto de pele induzida pelo peptídeo N7 sugere que a sua combinação com imunossupressores em outros protocolos de indução de tolerância, pode ser uma estratégia útil para aumentar a sobrevida do aloenxerto / INTRODUCTION: Heat shock proteins (HSPs) are proteins present in all living beings. They have dual immunologic functional activity inducing both proinflammatory and regulatory responses. In our group, we study the immunological effects of HSP60 peptides in human and mice. OBJECTIVES: To identify potentially immunoregulatory HSP60 peptides in mice, aiming at tolerance induction in the context of alotransplantation. METHOD: We analyzed the capacity of different HSP60 peptides to modify in vitro the expression of predominantly immunoregulatory genes (Foxp3, Gata-3, IDO, IL-4, IL-10, TGF?) or inflammatory (T-bet, IL-12p35, IL-12p40, IL-17) by Real Time PCR, in naive mice splenocytes. We considered gene modifications induced by the peptides as REG (?expression of immunoregulatory genes or ?expression of inflammatory genes) or INFLAMMA (?expression of immunoregulatory genes or ? expression of inflammatory genes). We selected some promising peptides that induced predominantly REG gene expression modifications as immunoregulatory peptides, to perform in vivo assays of tolerance induction to murine skin allograft. RESULTS: More promising peptides were N7, C4, N6, I8, N2 and N3. The N7 peptide (n=9) induced a REG/INFLAMMA ratio=2,71 and induced gene expression reduction of IL-17 and IL-12p40. The C4 peptide (n=6) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,63 and induced gene expression reduction of IL-17 and IL-12p40. The N6 peptide (n=8) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,60, induced gene expression reduction of T-bet and IL-12p40, and increased expression of IL-10. The I8 peptide (n=5) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,57 and induced increased gene expression of IL-17. The N2 peptide (n=8) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,32 and induced gene expression reduction of IL-17 and increase expression of IL-10, IL-4 and T-bet. The N3 peptide (n=7) induced a REG/INFLAMMA ratio =1,25 and induced no gene expression modification highlights. The N7 peptide was tested in tolerance mice allograft induction protocols. There was no statistical difference between different groups, despite the 7-day increase in allograft survival with the protocol in combination with the ?CD3 antibody (p=0,38, n=5). DISCUSSION AND CONCLUSION: The strong immunoregulatory impact of some HSP60 peptides in the gene expression of immune molecules indicate that they may be explored for immune therapy. Despite the existence of some interindividual variability, the N7 HSP60 peptide seems to be a promising imunorregulatory peptide. The slight increase in graft survival with the N7 peptide suggests that the combination of HSP60 peptides with other immunosupressors and different tolerance induction protocols may be a way to improve graft survival.

Introdução: Os linfócitos T regulatórios CD4+CD25+Foxp3+ (Tregs) desempenham um papel fundamental na manutenção da tolerância aos antígenos próprios e no controle da magnitude da resposta imunológica. Alterações quantitativas ou funcionais foram descritas em diversos distúbios auto-imunes. O pênfigo foliáceo endêmico (PFE) é uma doença bolhosa cutânea de natureza auto-imune, que compartilha características clínicas e imunopatológicas com o pênfigo foliáceo clássico, mas apresenta achados epidemiológicos próprios. Auto-anticorpos circulantes e teciduais da classe IgG dirigidos contra caderinas desmossômicas (desmogleína 1), levam à perda de adesão entre os queratinócitos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar se a perda de tolerância é associada com alterações quantitativas nos linfócitos Tregs CD4+CD25+Foxp3+ na pele de pacientes com PFE. Métodos: Amostras de pele de 22 pacientes e 10 controles saudáveis foram submetidos à análise imunoistoquímica com anti-CD4, anti-CD25 e anti-Foxp3. Fotomicrografias foram obtidas de campos consecutivos ao longo de toda epiderme e derme. A seguir, foi realizada quantificação dos linfócitos Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ e CD25+Foxp3+ em cada compartimento, considerando-se a respectiva área de cada campo (m2). Valores significantemente estatísticos foram considerados como p<0,05. Resultados: Encontramos um infiltrado epidérmico aumentado de linfócitos imunomarcados CD25+(p=0,003), Foxp3+(p=0,04) e CD25+Foxp3+ (p=0,007), em comparação com os controles. O infiltrado dérmico exibiu uma maior expressão de linfócitos CD4+ (p<0,001) e CD25+ (p=0,008) em amostras de pele de pacientes com PFE, quando comparados aos controles. Conclusões: Nossos achados sugerem que a quebra de tolerância imunológica periférica nos pacientes com PFE não se correlaciona com uma diminuição dos linfócitos T reg CD4+CD25+Foxp3+ na pele afetada. Entretanto, uma maior expressão de linfócitos CD25+Foxp3+ no infiltrado epidérmico poderia representar outra população de linfócitos com atividade regulatória, a ser definida. / Background: CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) play a crucial role in the maintenance of self tolerance and control of the magnitude of the immune response. Their quantitative or functional impairment has been reported in several autoimmune disorders. Endemic pemphigus foliaceus (EPF) is an autoimmune organ-specific blistering skin disorder that shares many clinical and immunopathological features with classic pemphigus foliaceus, but with unique epidemiological features. Circulating and tissue-bound IgG auto-antibodies react against desmosomal cadherins (desmoglein 1), causing loss of adhesion between keratinocytes. Aims: The purpose of this study was to evaluate whether the loss of tolerance is associated with impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs in the skin of EPF patients. Methods: Skin samples from 22 patients and 10 controls were submitted to immunohistochemistry with anti-CD4, CD25 and Foxp3. Photomicrographs were obtained from consecutive fields along epidermis and dermis; quantification of Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ and CD25+Foxp3+ cells were performed in each compartment, taking into account the respective field area (m2). Significance was set at p<0.05. Results: We found an enhanced epidermal infiltrate of CD25+(p=0.003), Foxp3+(p=0.04) and CD25+Foxp3+(p=0.007) immunostained T cells in EPF patients, when compared to controls. Dermal infiltrate exhibited a higher expression of CD4+ (p<0.001) and CD25 p=0.008) T cells in EPF skin samples than in controls. Conclusions: Our findings suggest that the break of peripheral immunologic tolerance in EPF patients did not correlate with an impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells present in the affected skin. However, higher expression of CD25+Foxp3+ cells in the epidermal infiltrate could be a counterpart of a diverse population of T cells, previously described as exerting a regulatory activity, yet to be defined

INTRODUÇÃO: A indução de tolerância oral atenua a resposta inflamatória e a produção de anticorpos anafiláticos secundários presentes em quadros alérgicos pulmonares tanto em humanos quanto em modelos experimentais. Nestas situações, a modulação do remodelamento brônquico e o papel do óxido nítrico não foram previamente estudados. OBJETIVOS: 1. Desenvolver dois modelos de tolerância oral em cobaias com inflamação crônica pulmonar caracterizando: mecânica pulmonar, hiper-responsividade a metacolina, óxido nítrico exalado (NOex), anticorpos IgG1, inflamação brônquica e eosinofilopoiese. 2. Avaliar o remodelamento brônquico e a expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) no epitélio brônquico nestes animais. MÉTODOS: As cobaias receberam inalações de ovoalbumina ou soro fisiológico durante 15 minutos ou até que apresentassem desconforto respiratório (este tempo foi denominado tempo de inalação). O protocolo foi repetido duas vezes por semana durante quatro semanas. Para a indução da tolerância foi administrada ovoalbumina a 2% por via oral e oferecida ad libitum, sendo formados os grupos: 1. TO1 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da primeira inalação com ovoalbumina); 2. TO2 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da quarta inalação com ovoalbumina); 3. SAL (recebeu água ad libitum e inalações com soro fisiológico); 4. OVA (recebeu água ad libitum e inalações com solução de ovoalbumina). Após os animais serem anestesiados e ventilados, foram avaliados: 1. mecânica pulmonar basal e após inalação com ovoalbumina (30mg/ml) ou soro fisiológico, 2. hiper-responsividade brônquica à metacolina, 3. coletado o NOex. Ao final do experimento, os fragmentos pulmonares foram retirados e corados com hematoxilina e eosina, com a técnica histoquímica cianeto resistente para peroxidase eosinofílica (células EPO+), com a técnica imunoistoquímica para a detecção da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e com resorcina-fucsina, resorcina-fucsina oxidada e picro-sírius. A medula óssea foi retirada e corada com hematoxilina e eosina. O índice de edema peribrônquico, as células EPO+, os mononucleares e os polimorfonucleares brônquicos e os eosinófilos da medula óssea foram avaliados por morfometria. As células epiteliais brônquicas nNOS+ e as fibras elásticas e colágenas foram avaliadas por densitometria óptica. Os anticorpos IgG1 foram detectados por anafilaxia cutânea passiva. A análise estatística foi feita com o programa SigmaStat e considerado significante um P<0,05. RESULTADOS: Nos grupos TO1 e TO2 houve aumento no tempo de inalação, diminuição na resposta máxima de elastância do sistema respiratório após desafio antigênico e com metacolina, diminuição do edema peribrônquico, dos eosinófilos, dos polimorfonucleares, das fibras elásticas e colágenas, da eosinofilopoiese e dos títulos de IgG1 (P < 0,05). Os mononucleares, a resposta máxima de resistência do sistema respiratório depois do desafio antigênico, e a metacolina diminuíram em TO2 (P < 0,05). O NOex e a percentagem de células epiteliais nNOS+ não foram alterados nos grupos tolerizados. CONCLUSÕES: A indução de tolerância oral concomitante ao início da sensibilização ou depois de estabelecida a resposta alérgica foi capaz de atenuar a inflamação eosinofílica, os títulos de IgG1 e o remodelamento brônquico presentes neste modelo de inflamação crônica pulmonar. A redução dos linfomononucleares e da hiper-responsividade brônquica foi mais efetiva quando a indução de tolerância foi feita em animais previamente sensibilizados. A dissociação entre o controle da inflamação eosinofílica e a avaliação do NOex e da expressão da nNOS no epitélio brônquico sugere um mecanismo novo ativado pela indução de tolerância oral / INTRODUCTION: The oral tolerance induction attenuates the inflammatory response and the production of secondary anaphylactic antibodies present in pulmonary allergy pictures in humans as well as in experimental models. In these situations, the bronchial remodeling modulation and the role of nitric oxide have not been previously studied. OBJECTIVES: 1. To develop two models of oral tolerance in guinea pigs with chronic pulmonary inflammation, characterizing: pulmonary mechanics, hyperreponsiveness to methacholine, exhaled nitric oxide (NOex), IgG1 antibodies, bronchial inflammation and eosinophylopoiesis. 2. To evaluate the bronchial remodeling and the expression of the neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) in bronchial epithelium of these animals. METHODS: The guinea pigs were submitted to ovalbumin or saline solution inhalation for 15 minutes or until they presented respiratory stress (this time period was called inhalation time). The protocol was repeated twice a week for 4 weeks. Oral tolerance induction was carried out by the administration of 2% oral ovalbumin, offered ad libitum, and the following groups were formed: 1. OT1 (received 2% oral ovalbumin from the first ovalbumin inhalation; 2. OT2 (received 2% oral ovalbumin from the fourth ovalbumin inhalation; 3. SAL (received water ad libitum and saline solution inhalations; and 4. OVA (received water ad libitum and ovalbumin solution inhalations). After being anesthetized, the animals were ventilated and evaluated regarding: 1. basal pulmonary mechanics and after ovalbumin (30mg/ml) or saline solution inhalation; 2. bronchial hyperresponsiveness to methacholine; and 3. NOex was collected. At the end of the experiment, the pulmonary fragments were removed and stained with hematoxylin-eosin, with the cyanide-resistant eosinophilic peroxidase histochemical technique (EPO+ cells), with the immunohistochemical technique for the detection of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and with Resorcin-fuchsin, Resorcin-fuchsin with oxidation and Picrosirius. The bone marrow was removed and stained with hematoxylin-eosin. The index of peribronchial edema, the EPO+ cells, the bronchial mononuclear and polymorphonuclear cells and the eosinophils from the bone marrow were evaluated by morphometry. The epithelial bronchial nNOS+ cells and the elastic and collagen fibers were evaluated by optical densitometry. IgG1 antibodies were detected by Passive Skin Anaphylaxis. Statistical analysis was performed with the SigmaStat software program and a P value < 0.05 was considered significant. RESULTS: The OT1 and OT2 groups showed increased inhalation time, decrease in the maximum elastance response of the respiratory system after the antigenic challenge and with methacholine, decrease of peribronchial edema, eosinophils, polymorphonuclear, elastic and collagen fibers, eosinophylopoiesis, and IgG1 titers (P < 0.05). The mononuclear cells, the maximum resistance response of the respiratory system after the antigenic challenge and methacholine decreased in OT2 (P < 0.05). NOex and the percentage of nNOS+ epithelial cells were not altered in the tolerized groups. CONCLUSIONS: The oral tolerance induction concomitant to the start of sensitization or after the allergic response has been established, was capable of attenuating the eosinophilic inflammation, IgG1 titers and the bronchial remodeling present in this model of chronic pulmonary inflammation. The decrease in lymphomononuclear cells and bronchial hyperresponsiveness was more effective when the tolerance induction was carried out in animals that had been previously sensitized. The dissociation between the eosinophilic inflammation and NOex evaluation and the expression of nNOS in the bronchial epithelium suggests a new mechanism activated by the oral tolerance induction

A administração de Ags solúveis via mucosas, antes da sensibilização com o mesmo Ag, leva a tolerância. Na presente tese estudou-se o efeito do LPS i.n. durante a indução de tolerância nasal a ovalbumina (OVA). A maioria dos modelos murinos de asma utilizam a OVA como alérgeno, desse modo também utilizamos o extrato de Blomia tropicalis (Bt), um ácaro prevalente em pacientes asmáticos. Características da Bt impedem o estabelecimento de tolerância e evidências experimentais indicam que a tolerância a um Ag pode induzir tolerância a um Ag não relacionado (tolerância cruzada). Assim, avaliamos se a tolerância a OVA ou lizozima de ovo (HEL) poderia induzir tolerância cruzada a Bt. Observou-se que o LPS i.n. durante a indução de tolerância a OVA previne o estabelecimento da tolerância, resultando em neutrofilia pumonar, IgG2a, diminuição de IgE com aumento de IgG1 anafilática. Observou-se também que a tolerância nasal, a HEL ou OVA, não é eficaz em induzir tolerância cruzada para as respostas contra Bt. Já, a tolerância oral com OVA induziu tolerância cruzada para Bt. / Mucosal administration of soluble Ags, before the sensitization with the same Ag, leads to mucosal tolerance. We studied the effect of i.n. LPS during the induction of ovalbumin (OVA) nasal tolerance. The majority of murine models of asthma used OVA as allergen,thus, we also used Blomia tropicalis (Bt) extract, a mite more common in asthmatic patients. Features of Bt block the nasal tolerance establishment and experimental data indicates that tolerance towards an Ag can promote tolerance to another not related Ag (cross-tolerance). Therefore, we evaluated if OVA or hen-egg white lisozyme (HEL) tolerance could result in cross-tolerance to the Bt. Our data showed that i.n. LPS during induction of tolerance to OVA prevents the establishment of this tolerance, resulting in neutrophil migration, IgG2a production, decreased levels of IgE and increased anaphylactic IgG1. We verify that nasal tolerance to HEL or OVA is not capable in induce cross-tolerance against the Bt. We also observed that OVA oral tolerance is able to induce cross-tolerance against Bt.

As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígeno do sistema imune, e há evidências da participação na tolerância imunológica. Neste estudo avaliamos as alterações ocorridas na população de células CD4+CD25+Foxp3+ após co-cultura de células de linfonodo com BMDCs, na presença de timócitos alogênicos ou singênicos em apoptose. Após cultura na presença de células alogênicas a população de Tregs mostra-se aumentada, e essa expansão é dependente de contato entre a DC e o linfócito T, já que o isolamento das culturas diminuiu a expressão destes marcadores. A internalização de células em apoptose foi induziu caráter tolerogênico nas DCs com baixa expressão de moléculas co-estimuladoras e resistência à maturação por LPS. As células CD4+CD25+ geradas in vitro foram capazes de conter a proliferação de esplenócitos de camundongos BALB/c estimulados por esplenócitos de C57BL/6 irradiados, anti-CD3 e OVA. No ensaio in vivo, as Tregs geradas in vitro também foram capazes de suprimir a proliferação de células CD25- quando transferidas para animais Nude, impedindo também o infiltrado inflamatório no estômago, cólon, fígado e rins, sendo assim capazes de suprimir a resposta imune in vitro e in vivo. / The dendritic cell (DC) plays a very important role in antigen presentation in the immune system and recent articles have shown the involvement in maintaining peripheral tolerance. Here we evaluated the changes in the CD4+CD25+Foxp3+ after co culture of DCs with lymph node cells. BMDCs were pulsed with apoptotic cells and co-cultured with lymph-node cells. Our results show an increase of CD4+CD25+Foxp3+ T cells after co-culture with DCs pulsed with apoptotic cells. Furthermore, the DCs did not change the pattern of co-stimulatory molecules expression due to phagocytosis of syngeneic or allogeneic apoptotic cells and further stimulation with LPS. The CD4+CD25+ cells sorted from the in vitro culture were able to suppress the proliferation of splenocytes in vitro in a specific and non-specific manner. As expected, the co-transfer of CD4+CD25- and CD4+CD25+, both sorted from the in vitro culture, was able to control the cell infiltrates in the target organs and the total cell count in the lymph-nodes. Thus, the Tregs expanded in vitro are able to suppress the immune response in vitro and in vivo assays.

Objetivo: Verificar o remodelamento da pele e produção de anticorpos em modelo experimental de esclerodermia em coelhos, após indução de tolerância nasal com colágeno tipo V. Métodos: Coelhas Nova Zelândia (N=12) foram imunizadas com 1mg/ml de colágeno V (Col V) em adjuvante completo de Freund e dois reforços com adjuvante incompleto de Freund. Seis coelhas imunizadas receberam uma dose diária de 25ug de Col V, iniciado via nasal (grupo tolerado) 150 dias do começo das imunizações e seis animais foram somente imunizadas (grupo imunizado). Um grupo imunizado com adjuvante de Freund serviu como controle. Biopsias de pele foram coletadas em 0, 75, 120, 150 e 210 dias e coradas pelo H&E, tricrômico de Masson e Sírius red para analise morfológica e morfométrica. Os colágenos I, III e V, além de TGFbeta e PDGF foram imunomarcados por imunofluorescência. Os soros dos animais foram coletados em 0, 150 e 210 dias para determinar anticorpos anti-colágenos I, III, IV e V e anti-nucleares. Resultados: Os animais imunizados mostraram progressivo decréscimo da derme papilar, atrofia de anexos, aumento no depósito dos colágenos I, III e V e aumento da expressão de TGFbeta e PDGF. Os tolerados apresentaram aumento dos anexos cutâneos e significante diminuição no depósito dos colágenos I, III e V, TGFbeta e PDGF. O grupo de imunizados e de tolerados apresentaram anticorpos anti-colágenos III e IV e antinucleares. Conclusões: A indução de tolerância nasal com Col V diminuiu o remodelamento da pele observado no modelo experimental de esclerodermia e inibiu a síntese de citocinas fibrogênicas. Portanto, a tolerância nasal com Col V pode ser uma opção terapêutica promissora para o controle do remodelamento cutâneo em pacientes com esclerodermia. / Objective: Our aim was to verify the skin remodeling and antibody production in experimental model of scleroderma in rabbits, after induction of tolerance by daily nasal administration of human type V collagen (Col V). Methods: Female New Zealand rabbits (N=12) were immunized with 1mg/ml of Col V in complete Freund\'s adjuvant, followed by more two boosters in incomplete Freund\'s adjuvant. Six immunized rabbits received daily nasal administrating of 25ug of Col V (tolerated group), started 150 days after the first immunization, and the others animals (N=6) were only immunized (immunized group). Finally a group of rabbits immunized with Freund\'s adjuvant served as control. Skin biopsies were collected at 0, 75, 120, 150 and 210 days, and stained with H&E, Masson\'s trichrome and Sirius red for morphological and morphometric analysis. Types I, III and V collagen, TGFbeta and PDGF were immunostained by immunofluorescence. The sera of animals were colleted at 0, 150 and 210 days to determine anti types I, III, IV and V collagen and antinuclear antibodies. Results: The immunized animals showed progressive decrease of papillary dermis, appendages atrophy, increase of types I, III and V collagen deposition and increased expression of TGF-beta and PDGF. The tolerated rabbits presented increase of cutaneous appendages and significant decrease of types I, III and V and TGF-beta and PDGF. Both immunized and tolerated rabbits presented anti types III and IV antibodies and antinuclear antibodies. Conclusions: Col V nasal tolerance reduced skin remodeling in experimental model of scleroderma and inhibited synthesis of fibrotic cytokines. Therefore, the nasal tolerance with type V collagen can be a promising therapeutic option to control the skin remodeling in patients with scleroderma.

O transplante renal é atualmente o tratamento de escolha para pacientes com doença renal crônica em estágio 5, devido aos seus melhores resultados na morbimortalidade e melhor qualidade de vida dos pacientes, quando comparado com o tratamento dialítico. No entanto, apesar desses resultados positivos, a sobrevida dos enxertos renais em longo prazo não se modificou. As principais causas de falências tardias do transplante renal são as alterações crônicas do enxerto, caracterizadas por componentes de rejeição crônica e efeitos nefrotóxicos relacionados aos inibidores da calcineurina. O desenvolvimento de estratégias visando modular o sistema imunológico, interferindo no balanço entre mecanismos efetores e reguladores, capazes de induzir a aceitação do órgão (tolerância) seria a melhor alternativa para este cenário. No entanto, os mecanismos imunológicos envolvidos no processo da imunorregulação são pouco compreendidos, o que dificulta a identificação de casos tolerantes e a definição de estratégias para a sua modulação. Dentre as possíveis moléculas envolvidas no processo de imunomodulação, destacam-se a Forkhead Box P3 (FOXp3), marcador de células reguladoras e a enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), reconhecida recentemente como tendo função central na tolerância materno-fetal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica para identificar linfócitos T efetores (CD3+), FOXp3 e IDO em biópsias de aloenxerto renal e correlacionar sua expressão com a evolução clínica do enxerto 12 meses após a biópsia. A relação entre células reguladoras e efetoras foi avaliada pelas relações FOXp3/CD3 e IDO/CD3. Devido à limitação do reconhecimento e do diagnóstico de casos de tolerância, só foi possível analisar a expressão destes marcadores em 1 único caso de paciente tolerante. Por outro lado, o estudo do perfil da expressão destes marcadores em outras situações clínicas deve contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos. Neste contexto, no presente estudo foram analisadas 63 biópsias de enxerto renal em diferentes situações clínicas: enxerto Sem Rejeição (SemRA; n=13), Rejeição Aguda (RA; n=21) e lesões crônicas (LC; n=29) além de 1 caso de paciente com diagnóstico clínico de tolerância operacional (Tolerante; n=1). Este paciente evoluiu com disfunção do enxerto, reiniciou terapia dialítica com a descontinuação do tratamento imunossupressor e após 2 anos em programa de hemodiálise, recuperou a função do enxerto, sendo, então, submetido a biópsia do enxerto renal. As biópsias incluídas foram subdivididas de acordo com a Classificação de Banff-09. As rejeições agudas mediadas por linfócitos T foram classificadas em RA-Banff I (n=15) e RA-Banff II (n=6). Os casos com Lesões Crônicas também foram subdivididos de acordo com a Classificação de Banff-09 em Fibrose intersticial/Atrofia tubular (FIAT; n=15) e Rejeição Crônica Ativa (RCA; n=14). RESULTADOS: analisado isoladamente, o caso Tolerante apresentou um número expressivo de células CD3+ (814 cel/mm2) e FOXp3+ (100,9 cel/mm2), assim como elevada relação FOXp3/CD3 (12,4x102).No entanto, apresentou uma baixa expressão de IDO (0,41% área marcada).Nos casos do grupo RA o número de células CD3+. foi significativamente maior que em LC e SemRA (973±127 cel/mm2; 242±43 cel/mm2 e 0,7 ± 0,4 cel/mm2, respectivamente; p<0,001 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Células CD3+ foram detectadas em todos os compartimentos estudados: interstício, túbulos, vasos, e glomérulos no grupo RA e no grupo LC. Comparando os grupos, houve predomínio de células CD3+ no interstício (p<0,0001) do grupo RA. Na subanálise segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos de RA na análise de células CD3+ por compartimentos. Por outro lado, na análise do grupo LC, no subgrupo RCA foram detectadas significativamente mais células CD3+ que em FIAT no interstício (322±66 cel/mm2 vs 145±32 cel/mm2; p<0,05) e nos túbulos (30,7±10 cel/mm2 vs 6±2 cel/mm2; p<0,05). O número de células FOXp3+ foi significativamente maior nos casos do grupo RA (43±10 cel/mm2) comparado com LC e SemRA (20±4 cel/mm2 e 0,1±0,1 cel/mm2, respectivamente; p<0,05 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Na distribuição por compartimentos, tanto em RA quanto em LC houve a predominância de células FOXp3+ no interstício, porém não houve diferença estatística entre os 2 grupos. Na análise de células FOXp3+ por compartimentos do grupo LC segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos. A relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior no grupo LC que no RA (17±5 vs 5±1; p<0,05). Na análise do grupo LC, a relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior em FIAT que em RCA (25±8 vs 8±2; p<0,05). A análise da expressão de IDO não revelou diferença na comparação dos grupos SemRA, RA e LC. Não houve diferença também na expressão de IDO, tanto entre os grupos Banff I e Banff II, quanto entre os grupos FIAT e RCA. A relação IDO/CD3, foi significativamente maior no grupo LC do que no grupo RA (18±6 vs 3±1; p<0,05). Apesar da presença de células FOXp3+ ter sido maior nos casos com diagnóstico de rejeição aguda como descrito na literatura, não houve correlação da sua expressão com uma maior função do enxerto na análise de 12 meses após a biópsia, nem com a sobrevida do enxerto em 12 meses. Nos casos com diagnóstico de lesões crônicas, a maior relação FOXp3/CD3 se correlacionou negativamente com a função do enxerto 12 meses após a biópsia. A expressão de IDO também não se correlacionou com uma melhor função, nem com a sobrevida do enxerto na análise em 12 meses após a biópsia. A análise dos resultados apresentados sugere o envolvimento dos marcadores estudados na resposta inflamatória ocasionada pelo aloreconhecimento, uma vez que estão presentes em cenários imunológicos distintos, aparentemente, mediando o dano tecidual no microambiente do aloenxerto. No entanto, não há dados o suficiente para apontar para um papel das células FOXp3+ e da IDO no desenvolvimento de tolerância ao aloenxerto no presente estudo. Concluindo, ainda não está claro o quanto a presença de Tregs e IDO limitam os processos de rejeição/cronificação ou participam desses processos, sendo sua presença ainda controversa / Currently, kidney transplantation is choice therapy for patients with chronic kidney disease in stage 5, due to their good results in morbidity and improved quality of life compared with dialysis treatment. However, despite these positive results, renal grafts survival in the long term has not changed. The major cause of failures in long-term in kidney transplant are chronic graft changes, characterized by chronic rejection and components related to the nephrotoxic effects of calcineurin inhibitors. The development of strategies to modulate the immune system interfering with the balance between regulatory and effector mechanisms, capable of inducing organ acceptance (tolerance), would be the excellent alternative in this scenario. However, the immunological mechanisms involved in the immunoregulation are poorly understood, hindering to identify cases tolerant as well as developing strategies for their modulation. Within the possible molecules involved in immunomodulation, stand out the Forkhead Box P3 (FOXp3), a marker of regulatory cells, and the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), recently recognized by their role in maternal-fetal tolerance. In this present study, we used immunohistochemical techniques to identify T lymphocytes (CD3+), FOXp3 and IDO in renal allograft biopsies and to correlate its expression with graft function 12 months after the biopsy procedure. The relationship between regulatory and effector cells was analysed by FOXp3/CD3 and IDO/CD3 ratios. Due to limited recognition and diagnosis of tolerance cases, only was possible to analyze the expression of these markers in one single case of tolerant patient. On the other hand, the study of the expression of these markers in other clinical situations, should contribute to a better understanding of the mechanisms involved. In this context, the present study analyzed 63 renal allograft biopsies in different clinical situations: no graft rejection (NR, n = 13), acute rejection (AR, n = 21) and chronic injury (CI, n = 29). In addition, one patient with clinical operational tolerance diagnosis (tolerant, n = 1) was analyzed. This patient developed graft dysfunction, restarted dialysis discontinuation of immunosuppressive treatment. After 2 years on dialysis therapy, recovered graft function and then was submitted to renal allograft biopsy. The biopsies included in this study were subdivided according to the Banff-09 classification. The acute rejection mediated by T lymphocytes was classified in Banff I (n = 15) and Banff II (n = 6). Cases that showed chronic injury were also subdivided according to the Banff-09 classification in Interstitial Fibrosis/Tubular Atrophy (IFTA, n = 15) and Chronic Rejection (CR, n = 14). Results: Analyzed separately, the tolerant case showed an expressive number of CD3+ cells (814 cells/mm2) and FOXp3+ cells (100.9 cells/mm2). Also, expressive FOXp3/CD3+ ratio (12,4x102) and low IDO expression (0.41% area).In AR group the number of CD3+ cells was significantly higher compared with CI and NR groups (973 ± 127 cells/mm2; 242 ± 43 cells/mm2 and 0.7 ± 0.4, cells/mm2, respectively; p<0.001 vs CI and p <0.0001 vs NR). In AR and CI groups CD3+ cells were detected in all compartments studied: interstitium, tubules, vessels and glomeruli. Comparing the groups, there was a predominance of CD3+ cells in the interstitium (p<0.0001) of AR group. No difference was observed between Banff I and Banff II subgroups analysis of CD3+ in the compartments. On the other hand, in the CR subgroup analysis was detected in significantly higher of CD3+ cells in the interstitium compared with IFTA (322 ± 66 cells/mm2 vs. 145 ± 32 cells/mm2, p<0.05) and in tubules (30,7±10 cells/mm2 vs. 6±2 cells/mm2, respectively; p<0.05). The number of FOXp3+ cells was significantly higher in the AR group (43±10 cells/mm2) compared with CI and NR (20±4 cells/mm2 and 0.1±0.1 cells/mm2, respectively; p<0,05 vs CI and p<0,0001 vs NR). The distribution of compartments, both AR and in CI predominated FOXp3+ cells in the interstitium, but there was no statistical difference between the 2 groups. In the FOXp3+ cells analysis, CI do not showed difference between subgroups in the compartments. The relationship FOXp3/CD3 was significantly higher in AR group compared in the CI group (17 ± 5 vs. 5 ± 1; p<0.05). In the CI group analysis, FOXp3/CD3 ratio was significantly higher in IFTA compared with CR (25±8 vs 8±2; p<0.05). IDO expression analysis shows no difference when compared NR, AR and CI groups. No difference in IDO expression analysis in Banff I compared with Banff II, and IFTA compared with CR was observed. The relationship of IDO/CD3, was significantly higher in the CI group when compared with AR group (18±6 vs 3±1, p<0.05). Despite the presence of FOXp3+ cells was higher in cases with a diagnosis of acute rejection as described in the literature, there was no correlation of its expression with improved graft function in the 12 months analysis after the biopsy procedure, as well as with graft survival in 12 months. In cases with a diagnosis of chronic injuries, FOXp3/CD3 ratio was negatively correlated with graft function 12 months after the biopsy procedure. The analysis of these results led us to speculate about the involvement of these markers in the inflammatory response, mediating the tissue damage in the microenvironment of the graft, once it is immunological distinct scenarios, however, in this study, there is no enough data to point to a role in development of tolerance. In conclusion, it is unclear how the presence of Tregs and IDO limit the allograft rejection/chronicity or participate in this process, and their presence is still controversial

DCs são células especializadas na apresentação de antígenos (Ags) para linfócitos T virgens e indução de respostas imunes primárias. Deficiências no processo de eliminação de células apoptóticas relacionam-se com desenvolvimento de doenças auto-imunes. Para avaliar o efeito de células apoptóticas sobre os processos de maturação e atividade funcional de DCs derivadas in vitro de monócitos aderentes de doadores saudáveis, células não aderentes obtidas após uma 2ª etapa de aderência por 3 dias foram submetidas a aquecimento e/ou irradiação. 48h após, células somente irradiadas (37i) apresentaram maior porcentagem de apoptose que células aquecidas e irradiadas (43i), sugerindo que o calor protege da apoptose induzida. Na cocultura com iDCs ou mDCs (iDC+TNF), iDC+37i apresentaram aumento de CD1a, correlacionado com altos níveis de IL-10 e inibição de autoestimulação linfocitária. mDC+43i apresentaram níveis de CD1a semelhantes a iDC, baixos níveis de IL-10, altos níveis de IL-12p70 e altos índices de auto e aloestimulação linfocitária. Concluímos que o fenótipo e função de DCs é modulado diferencialmente na presença de 43i, que induzem ativação in vitro, enquanto 37i induzem DCs com características moduladoras dependente de lipídios. / DCs are specialized in presenting Ags to naïve lymphocytes, inducing primary immune responses or immunological peripheral tolerance, through tissue turnover by scavenging dying cells. Works with human cells are scarcer and controversial about the latter. Then, the aim of this work was to investigate the effect of apoptotic cells (Nadhs) on maturation and function of human monocyte-derived DCs in vitro. The results suggest that heating Nadhs before irradiation (43i) seems to protect them from apoptosis induced by irradiation (37i). DCs were cocultured with 37i or 43i, simultaneously to TNF-a addition in the 5th day of culture. In the 7th day, there was an association between high levels of CD1a, IL-10, low levels of IL-12p70 and decreased allostimulation induced by iDC+37i. mDC+43i had high levels of IL-12p70, CD86 and proliferation index, associated with low levels in CD1a expression. We conclude that DCs phenotype and function are differentially modulated in the presence of 43i, which induce DCs activation, or 37i, which induce regulatory phenotype and function in DCs. We suggest that these protocols for DCs activation with 43i or 37i could be used, respectively, as models of in vitro auto-reactivity or homeostatic immunomodulation of DCs in vitro.