La leucémie lymphoïde chronique reste une pathologie incurable même si les nouveaux moyens thérapeutiques permettent d’obtenir des réponses de bonne qualité. Les déterminants idiotypiques des lymphocytes B représentent une cible idéale pour la génération de cellules T spécifiques dirigées contre le clone malin. Dans ce cadre, l’induction d’une réponse immunitaire efficace semble donc intéressante. L’objectif principal de cette étude était d’augmenter l’immunogénicité des cellules tumorales de LLC-B. Pour cela, la possibilité d'une activation de ces cellules par des agonistes de Toll-like récepteurs (TLRs) a été explorée. Tout d’abord, le profil d’expression protéique des TLRs a été recherché au niveau des lymphocytes B sains et pathologiques par cytométrie de flux. La mise en évidence d'une expression significative de TLR-7 et TLR-9 a ensuite permis d'analyser l’effet d'une stimulation par des ligands de ces TLRs par immunophénotyage, cytomorphologie, analyse de l’apoptose par la méthode TUNEL et étude de la prolifération par marquage CFSE. Le profil cytokinique des suspensions cellulaires stimulées ou non a également été examiné par cytométrie de flux. Enfin, une analyse fonctionnelle a été réalisée dans un modèle de stimulation allogénique afin de mesurer la capacité de ces cellules stimulées à activer des lymphocytes T naïfs. Les résultats obtenus montrent un profil d’expression des TLR-4, -7, -9 et -10 similaire pour les cellules B de LLC et les lymphocytes B sains avec toutefois une expression plus importante de TLR-9 dans les cellules tumorales. L’engagement de TLR-4 a pour conséquence une faible activation de HLA-DR sur les cellules B saines et tumorales. L’activation de TLR-7 via les plus fortes concentrations d'imiquimod R837 induit surtout une apoptose rapide et importante des cellules de LLC-B ainsi qu'une augmentation modérée de l'expression des marqueurs de costimulation et de présentation des cellules B saines et tumorales. La stimulation de TLR-9 via les ODN CpG entraîne une activation des cellules B saines et tumorales et protège les cellules tumorales de l'apoptose. Les profils cytokiniques des suspensions cellulaires ont montré que ces ligands de TLRs orientent les réponses cellulaires vers un profil pro-inflammatoire, éventuellement propice à la génération de réponses cellulaires, potentiellement anti-tumorales via la production d'IL-8 et de TNF. Enfin, il est apparu que les cellules amygdaliennes et tumorales stimulées avec les ODN CpG n'étaient pas capables d'activer des lymphocytes T naïfs allogéniques, ce qui pourrait être lié à la faible production d'IL-2 ou à la production d'IL-10 par ces cellules. En conclusion, TLR-7 et TLR-9 représentent des cibles thérapeutiques intéressantes dans le traitement de la LLC-B. L’imiquimod R837 pourrait aider à la clairance tumorale dans les LLC-B. L’activation cellulaire induite par via les ODN CpG M362 pourrait par contre être utilisée pour augmenter le potentiel de cellules présentatrices d’antigènes des cellules B de LLC à condition de parvenir à contrecarrer l'environnement tolérogène et à différencier les cellules B en cellules activatrices de réponses Th1 et cytotoxiques. / thesis

TLRs play a key role in initiating innate immunity and in regulating the nature of the adaptive immune response. We hypothesized that functional responsiveness to TLR stimulation differs in clinically; environmentally; ethnically distinct pediatric populations. PBMC obtained from 272 children were stimulated with a panel of TLR ligands. Levels of pro- and anti-inflammatory, Th1-, Th2-associated cytokines were quantified by ELISA. We demonstrate that use of threshold concentrations of TLR4 and TLR2 ligands reveal striking differences in cytokine responses between asthmatic and non-atopic children. Specifically, non-atopic controls produce higher levels of pro-inflammatory cytokines, whereas asthmatics exhibit increased anti-inflammatory IL-10 responses. Asthmatic children exposed to environmental tobacco smoke (ETS) demonstrated elevated levels of chemokines relative to non-ETS exposed asthmatics and controls. First Nation children favor anti-inflammatory IL-10 responses, whereas Caucasian population respond to TLR activation by production of more robust pro-inflammatory and Th1 biased cytokine and chemokine responses. / October 2007

Huntington’s disease (HD) is caused by the expansion of a CAG repeats encoding polyglutamine (polyQ) in the first exon of Huntingtin (Htt) gene. In HD patients, polyQ contains 36-183 glutamine residues, whereas normal individuals have a polyQ of only 8-35 residues. To elucidate this threshold phenomenon of polyQ aggregation, fluorescence proteins CFP and YFP were attached to both ends of polyQ of different lengths. FRET (fluorescence resonance energy transfer) was conducted to characterize the conformation of polyQ in the pre-aggregation state. Our FRET data show that both the normal and expanded polyQ tracts reveal the same extended structure in low concentration. Longer polyQ has multiple cooperative binding sites with higher avidity. PolyQ tracts form aggregates when proteins exceed a critical concentration. The antibody MW1 Fv fragment binds to polyQ, breaks apart polyQ oligomer and stabilizes it in a more extended conformation. The addition of polyproline to the C-terminus inhibits polyQ aggregation by inducing PPII-like Helix structure. To understand how the flanking sequence affects the polyQ structure, the structure of Q10P10 peptide in complex with MW1 Fv was determined by protein crystallography and compared with Q10/Fv crystal structure. Q10P10 peptide bound to Fv has a similar extended structure as Q10 peptide when a polyproline tract adopts PPII helical structure sticking out of the complex. Toll-like receptors are transmembrane receptors on different kinds of leukocytes. They can recognize the structural conserved molecular motifs derived from microbes. On the upstream of the TLR signal pathway, TLRs recruit the adaptor protein-MyD88 through TIR/TIR domain interaction, and MyD88 recruits the downstream kinases IRAK4 and IRAK1 through death domain/death domain interaction. Pellino1, a newly identified E3 ubiquitin ligase, is also involved in TLR signaling by adding polyubiquitin chain to IRAK1 in conjugation with Ubc13/Uev1a E2 complex. TIR/TIR and DD/DD binding motifs were studied with techniques including mutagenesis, analytical gel filtration, NMR spectroscopy and crystallography. We identified a MyD88DD (E52QR62S) double-mutant that attenuates protein aggregation without interrupting the binding with IRAK4. This double mutant is a good candidate for structure determination by NMR spectroscopy. Our ubiquitination assay showed Pellino1 catalyzes polyubiquitination in the presence of Ubc13/Uev1a in vitro. Needle cluster-shaped crystals of Pellino1/Ubc13/ Uev1a protein complex were obtained by “hanging drop” method of vapor diffusion. Once the crystallization conditions are optimized, we will be able to collect X-ray diffraction data for this E2/E3 complex.

TLRs play a key role in initiating innate immunity and in regulating the nature of the adaptive immune response. We hypothesized that functional responsiveness to TLR stimulation differs in clinically; environmentally; ethnically distinct pediatric populations. PBMC obtained from 272 children were stimulated with a panel of TLR ligands. Levels of pro- and anti-inflammatory, Th1-, Th2-associated cytokines were quantified by ELISA. We demonstrate that use of threshold concentrations of TLR4 and TLR2 ligands reveal striking differences in cytokine responses between asthmatic and non-atopic children. Specifically, non-atopic controls produce higher levels of pro-inflammatory cytokines, whereas asthmatics exhibit increased anti-inflammatory IL-10 responses. Asthmatic children exposed to environmental tobacco smoke (ETS) demonstrated elevated levels of chemokines relative to non-ETS exposed asthmatics and controls. First Nation children favor anti-inflammatory IL-10 responses, whereas Caucasian population respond to TLR activation by production of more robust pro-inflammatory and Th1 biased cytokine and chemokine responses.

TLRs play a key role in initiating innate immunity and in regulating the nature of the adaptive immune response. We hypothesized that functional responsiveness to TLR stimulation differs in clinically; environmentally; ethnically distinct pediatric populations. PBMC obtained from 272 children were stimulated with a panel of TLR ligands. Levels of pro- and anti-inflammatory, Th1-, Th2-associated cytokines were quantified by ELISA. We demonstrate that use of threshold concentrations of TLR4 and TLR2 ligands reveal striking differences in cytokine responses between asthmatic and non-atopic children. Specifically, non-atopic controls produce higher levels of pro-inflammatory cytokines, whereas asthmatics exhibit increased anti-inflammatory IL-10 responses. Asthmatic children exposed to environmental tobacco smoke (ETS) demonstrated elevated levels of chemokines relative to non-ETS exposed asthmatics and controls. First Nation children favor anti-inflammatory IL-10 responses, whereas Caucasian population respond to TLR activation by production of more robust pro-inflammatory and Th1 biased cytokine and chemokine responses.

Tübingen, Univ., Diss., 2007.

The molecular mechanism(s) by which Toll-like receptors become activated are not well understood. For the majority of TLR receptors, dimerization is a prerequisite to facilitate MyD88-TLR complex formation and subsequent cellular signaling to activate NF-κB. However, the parameters controlling interactions between the receptors and their ligands still remain poorly defined. Previous reports have identified that neuraminidase-1 (NEU1) is an important intermediate in the initial process of TLR ligand induced receptor activation and subsequent cell function. What we do not yet understand is how NEU1 is activated following TLR ligand binding. In this thesis, the findings disclose a receptor signaling paradigm involving a process of receptor ligand-induced GPCR-signaling via neuromedin-B (NMBR) Gα-proteins, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) activation, and the induction of Neu1 activation. Central to this process is that NEU1–MMP-9-NMBR complex is associated with TLR-4 receptors on the cell surface of naive primary macrophages and TLR-expressing cell lines. Ligand binding to the receptor initiate GPCR-signaling via GPCR Gα subunit proteins and MMP-9 activation to induce NEU1. Activated NEU1 targets and hydrolyzes sialyl α-2-3-linked to β-galactosyl residues at the ectodomain of TLRs, enabling the removal of steric hindrance to receptor association, activation of receptors and cellular signaling. Furthermore, a novel glycosylation model is uncovered for the activation of nucleic acid sensing intracellular TLR-7 and TLR-9 receptors. It discloses an identical signaling paradigm as described for the cell-surface TLRs. NEU1 and MMP9 cross-talk in alliance with neuromedin-B receptors tethered to TLR-7 and -9 receptors at the ectodomain is essential for ligand activation of the TLRs and pro-inflammatory responses. However, the mechanism(s) behind this GPCR and TLR cross-talk has not been fully defined. Here, GPCR agonists mediate GPCR-signaling via membrane Gα subunit proteins to induce NEU1 and MMP-9 cross-talk at the TLR ectodomain on the cell surface. This molecular organizational GPCR signaling platform is proposed to be an initial processing stage for GPCR agonist-induced transactivation of TLRs and subsequent cellular signaling. Collectively, these novel findings radically redefine the current dogma(s) governing the mechanism(s) of the interaction of TLRs and their ligands, which may provide important pioneering approaches to disease intervention strategies. / Thesis (Ph.D, Microbiology & Immunology) -- Queen's University, 2013-04-30 12:23:42.429

Une compréhension fine et détaillée ciblant les mécanismes d’action de nouvelles molécules adjuvantes sur notre système immunitaire vise de manière directe à l’élaboration de nouveaux vaccins plus ciblés et plus efficaces, mais aussi à élargir nos connaissances quant à l’induction d’une réponse immune protectrice. Au cours de cette thèse nous avons voulu comprendre les modes d’action de deux molécules lipidiques distinctes. La première est le lipide cationique diC14-amidine dont il avait été démontré une action sur les cellules dendritiques en culture par une voie qui restait à élucider. Ce lipide cationique s'organise sous forme de liposomes en milieu aqueux et peut s'associer à de nombreux antigènes. La seconde est un analogue synthétique de l'adjuvant monophosphoryl lipide A (MPL), un dérivé du LPS, nommé CRX-527. À l'instar de sa molécule parente, le CRX-527 active le récepteur TLR4 et est considéré comme un adjuvant potentiel de vaccin ou comme immunostimulant isolé. Au cours de notre travail, nous avons démontré que la diC14-amidine active les cellules cibles via le récepteur TLR4. En effet, l'absence de ce récepteur abolit les réponses induites par le lipide cationique diC14-amidine et la transfection du gène codant pour TLR4 rend répondeuses des cellules qui n'exprimaient pas ce récepteur. De plus, la diC14-amidine active et mature des cellules dendritiques, aussi bien de provenance murine qu'humaine, suggérant qu'elle puisse être utilisée en tant qu’adjuvant. Il avait d’ailleurs été précédemment décrit que l'injection d'un complexe diC14-amidine / allergène chez la souris induisait une réponse immune suffisante pour conférer une protection contre cet allergène. Dans ce contexte, nous avons caractérisé au niveau cellulaire la réponse induite suite à l'injection du complexe diC14-amidine / ovalbumine chez la souris. Cette réponse se manifeste par une production d'IFNγ lors d'une re-stimulation ex vivo par l'antigène OVA. En ce qui concerne la molécule CRX-527, nous nous sommes particulièrement focalisés sur le rôle du co-récepteur du TLR4, le CD14, dans les réponses innées induites par le CRX-527. Nous avons établi que, de manière inattendue et contrairement à la plupart des ligands TLR4, le CRX-527 induit la production de nombreuses cytokines et chimiokines en complète absence de CD14, même à faible dose. De plus, l'ajout de CD14 sous sa forme soluble ne modifie pas le niveau des réponses associées à la voie de signalisation MyD88 / NF-κB. Cependant, il semblerait que la stimulation de cellules par du CRX-527 en présence de CD14 soluble recombinant, favorise plutôt la voie TRIF / IRF3, comme le suggère l'augmentation du taux de production d'IFNβ et d'activation d'IRF3. La molécule CD14 (membranaire et/ou soluble) ne serait donc pas qu'un simple transporteur de ligands, comme il l'a été décrit par le passé, mais bien une protéine impliquée dans la modulation des réponses induites lors de l'activation du TLR4. Le CD14 jouerait donc un rôle, aussi bien au niveau de la discrimination des ligands, que celle des voies de signalisation activées.

Dissertation (Ph.D.)--Auburn University, 2006. / Abstract. Vita. Includes bibliographic references.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit.opg. en een samenvatting in het Nederlands.