Long-term protective immunity depends on proper initiation of professional antigen-presenting cells (APCs). Autoimmune disorders and certain infections can cause disease through modulation of APCs and thereby affecting the outcome of these diseases. This work aimed to investigate the behaviour of different APC subsets during conditions known to cause improper immune responses. In Paper I, the effects of an anti-inflammatory compound called Rabeximod, intended for treatment of rheumatoid arthritis were investigated on different subsets of APCs. The results showed that Rabeximod affected the differentiation and behaviour of inflammatory subsets of dendritic cells (DCs) and macrophages while no effects were observed on anti-inflammatory subsets. Our findings suggest that Rabeximod acts by inhibiting the functionality of inflammatory subsets of APCs. In Paper II, the effects of different malaria derived stimuli such as hemozoin (Hz) and infected red-blood cells (iRBCs) on monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) were investigated. Both stimuli triggered activation and migration of MoDCs. MoDCs exposed to iRBCs induced allogeneic T-cell proliferation while those exposed to Hz did not. These results indicate that different malaria derived stimuli may differently affect DCs and that this could lead to improper and inefficient T-cell activation. In Paper III, innate aspects of malarial immunity were compared in children from two sympatric ethnic groups. We observed decreased activation of APCs and severely supressed TLR responses in Dogon children as compared to Fulani. This may indicate an important role for TLR and APC activation in the Fulani, known to be better protected against malaria than the Dogon. In summary, detailed knowledge of APC activation will be helpful in the understanding of specific effector immune responses. This could in turn, improve treatment of inflammatory disorders as well as the generation of efficient vaccines against infectious diseases.

Thesis (M.S.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Not embargoed. Vita. Bibliography: 58-64.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29 / Objetivo: avaliar a possível relação entre polimorfismos dos genes codificadores de receptor 1 de interleucina (IL) 1 (IL-1R1) (PstI, rs2234650), IL-12 (+1188, rs3212227), IL-18 (-137, rs187238), IL-18 (-607, rs1946519), receptor tipo Toll (TLR) 2 (TLR-2) (+2258, rs5743708) e TLR-4 (+896, rs4986790) e a pré-eclâmpsia (PE). Pacientes e métodos: Este estudo de caráter caso-controle incluiu 109 pacientes com PE e 174 gestantes sem patologia sistêmica ou obstétrica, e com história de duas ou mais gestações sem intercorrências, como controles. O DNA genômico foi extraído de sangue periférico por método de DTAB/CTAB, e os polimorfismos foram genotipados por técnicas de PCR-RFLP ou PCR-ARMS. Para a análise dos resultados, foram utilizados os testes t de Student e exato de Fischer, tendo sido adotado o nível de significância de p<0,05. Resultados: As freqüências genotípicas do polimorfismo do gene IL-1R1 foram 20,9% CC, 59% CT e 20,1% TT em casos de PE; e 24,7% CC, 56,2% CT e 19,1% TT em controles (p=0,82). As freqüências do polimorfismo do gene IL-12 foram 54,7% AA, 32,9% AC e 12,4% CC em casos de PE; e 55,4% AA, 33,8% AC e 10,8% CC em controles (p=0,93). As freqüências genotípicas de IL-18 (-137) foram 5,2% CC, 42,7% CG e 52,1% GG em casos de PE; e 7,6% CC, 43% CG e 49,4% GG em controles (p=0,74). As freqüências genotípicas de IL-18 (-607) foram 41% CC, 52,7% CA e 6,3% AA em pacientes com PE; e 32,2% CC, 56,2% CA e 11,6% AA no grupo controle (p=0,22). As freqüências do polimorfismo do gene TLR-2 foram 84,6% GG e 15,4% GA em casos de PE; e 84,8% GG e 15,2% GA em controles (p=0,97). As freqüências do polimorfismo do gene TLR-4 foram 93,6% AA e 6,4% AG em casos de PE; e 87,6% AA, 11,7% AG e 0,7% GG em controles (p=0,23). Não houve diferenças significantes entre os grupos, quanto às freqüências genotípicas e alélicas. Conclusões: Não foi observada associação entre polimorfismos de genes codificadores de IL- 1R1, IL-12, IL-18, TLR-2 e TLR-4 e a ocorrência de pré-eclâmpsia. / Problem: Intense maternal inflammatory response is a central event in the pathogenesis of preeclampsia (PE) Our aim was to assess a possible relation between pro-inflammatory mediators: IL-1R1, IL-12, IL-18, IL-18, TLR-2 and TLR-4 gene polymorphisms and PE. Method of Study: This case-control study included 109 patients with PE and 174 healthy women (controls). Genotyping were performed by PCR-ARMS or PCR-RFLP techniques. Data were analyzed by Student´s t or Fischer´s exact tests, and significance was set at p<0.05. Results: Genotypic and allelic distribution for all six polymorphisms was similar between the study and control groups (p=0.82 for IL-1R1, p=0.93 for IL-12, p=0.74 for IL-18 -137, p=0.22 for IL-18 -607, p=0.97 for TLR-2 and p=0.23 for TLR-4 gene polymorphisms). Conclusions: Our findings suggest that the analyzed pro-inflammatory gene polymorphisms are not associated with the occurrence of PE. Further studies have to be done to confirm these results. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientadora: Profa. Dra.Marcela Sorelli Carneiro Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Recentemente, dados na literatura demonstram a estreita interacao patofisiologica existente entre os rins e o coracao. Conhecida como sindrome cardio-renal, essa patologia e capaz de promover hipertrofia e falencia cardiaca a partir de um quadro de lesao renal. Sabe-se que a lesao renal isquemica (LRI) promove a liberacao de diferentes citocinas inflamatorias que tem o coracao como tecido alvo e sao capazes de promover a instalacao do quadro hipertrofico, agindo, por exemplo, por meio de receptores semelhantes ao Toll (toll-like receptors - TLR). Alem de mediadores inflamatorios, trabalhos presentes na literatura ja comprovaram a direta relacao entre alteracoes no sistema renina-angiotensina (SRA) e nos niveis de Angiotensina II (Ang II) com o aumento da massa cardiaca. O presente estudo objetivou investigar o papel do SRA com a hipertrofia cardiaca (HC) induzida por um modelo experimental de LRI em camundongos tratados ou nao com bloqueadores do SRA, Losartan (Los) e Enalapril (Ena). O quadro de LRI foi induzido cirurgicamente atraves da oclusao do pediculo renal esquerdo por 60 minutos seguido de reperfusao. Apos 12, 15 ou 20 dias os tecidos foram removidos para a realizacao de analises macromorfometricas, moleculares e funcionais. Os principais resultados indicam que a cirurgia de isquemia renal e reperfusao foi capaz de gerar um quadro de falencia renal e induzir HC de maneira independente de aumento na pressao arterial. Ainda, no periodo analisado, observou-se aumento nos niveis sericos de TNF-¿¿ e Ang II, elevados niveis de expressao genica ou proteica de AT1, ECA-2, TLR-2, TLR-4 e NFk¿À, sugerindo relacao desses componentes com a HC. Os tratamentos com Los e Ena reverteram completamente a HC observada e aboliram o aumento na expressao cardiaca de TLRs, AT1R e ECA-2 e modularam diferencialmente os niveis sericos de Ang II e citocinas inflamatorias. Juntos, os dados sugerem um papel crucial do SRA na regulacao do quadro patologico neste modelo, atuando juntamente com o sistema imune inato na regulacao da patogenese da HC atraves da modulacao de seus principais componentes. / Recently published data demonstrate the close pathophysiological interaction between the kidneys and the heart. Known as cardio-renal syndrome, this pathology is capable of promoting hypertrophy and heart failure starting from renal injury. It is known that ischemic renal injury (IRI) promotes the release of various inflammatory cytokines that have the heart as a target tissue and are capable of promoting hypertrophy acting through the Toll-like receptors (TLR). In addition to inflammatory mediators, literature has extensively demonstrated the direct correlation between changes in the renin-angiotensin system (RAS) and the levels of angiotensin II (Ang II) within the increase in cardiac mass. This study aimed to investigate the role of the RAS with cardiac hypertrophy (CH) induced by an experimental model of IRI in mice treated or not with RAS blockers, Losartan (Los) and Enalapril (Ena). The IRI was surgically induced by occlusion of the left renal pedicle for 60 minutes followed by reperfusion. After 12, 15 or 20 days, tissues were removed and morphological, molecular, and functional analysis were performed. The leading results indicate that renal ischemia and reperfusion surgery was capable of generating renal failure which subsequently induced HC in a blood-pressure independent manner. Also, over this period, there was an increase in serum levels of TNF-á and Ang II, high levels of gene or protein expression of AT1, ACE-2, TLR-2, TLR-4 and NFkâ, suggesting a cross-talk within these components and CH development. Treatment with Los or Ena has completely reversed the CH and abolished the increase observed in cardiac expression of TLRs, NFkâ, ACE-2 and AT1R, and also differentially modulated Ang II and inflammatory cytokines serum levels. Together, the data suggest a critical role for RAS in the regulation of the pathological condition in this model, acting together with the innate immune system in the pathogenesis of CH through modulation of its main components.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-26Bitstream added on 2014-06-13T19:15:56Z : No. of bitstreams: 1 frasnelli_sct_me_arafo.pdf: 758242 bytes, checksum: fc10d5e79dcb4b386aacc5d2776f572c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... / Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Carlos Rossa Junior / Coorientador: Silvana Regina Perez Orrico / Banca: José Eduardo Cezar Sampaio / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... (Resumo completo, clicar acesso eletr^ônico abaixo) / Abstract: Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Paracoccina (PCN) é um constituinte de Paracoccidioides brasiliensis, um patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose, micose sistêmica mais prevalente na América Latina. A PCN é uma proteína de função dual, com domínios de atividade lectínica e de N-acetilglicosaminidase. Análises proteômicas da preparação paracoccina revelaram a sua correspondência com uma proteína hipotética de P. brasiliensis do isolado 18 (Pb18), anotada como PADG-3347.1, que tem sequência polipeptídica semelhante a família das endoquitinases 18. Essas endoquitinases apresentam domínios distintos de atividade lectínica e enzimática. O conjunto de exons do gene correspondente, PADG-3347.1, foi clonado e expresso em E. coli, e as características físicas e biológicas da proteína recombinante foram comparadas com as da PCN. Além disso, a PADG-03347.1 recombinante (rPCN) foi avaliada por suas propriedades imunomoduladoras e sua capacidade em conferir proteção contra a infecção por P. brasiliensis. Nesse sentido, investigamos a interferência da administração profilática e terapêutica de rPCN no curso da infecção por P. brasiliensis em camundongos BALB/c. A histopatologia pulmonar dos camundongos tratados com a rPCN, mostrou menor ocorrência de granulomas, e estes também foram menores do que os observados nos animais controles. Consistente com a observação de poucas leveduras no centro dos granulomas, a contagem de UFC a partir do homogenato pulmonar dos camundongos tratados foi inferior ao observado nos animais controles. Além disso, a administração de rPCN, foi associada com altos níveis de IL-12, IFN-, TNF-, NO e IL-10 detectados no homogenato pulmonar. Os altos níveis de citocinas produzidos nos animais tratados com rPCN nos levou a investigar a ocorrência de interação da lectina com receptores presentes em células da imunidade inata, tais como TLR2 e TLR4. Verificamos que a rPCN ativa TLR2, nas formas homo ou heterodimérica, e TLR4, de modo independente dos correceptores CD14 e CD36. Estes dados revelam um possível mecanismo pelo qual rPCN gera proteção nos camundongos contra a PCM. rPCN, administrada terapêutica ou profilaticamente, induz a ativação de TLRs e imunidade Th1, conferindo proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / Paracoccin is a constituent of Paracoccidioides brasiliensis, a human pathogen that causes paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Paracoccin is a dual function protein exerting lectin and N-acetylglucosaminidase activities. Proteomic analysis of paracoccin preparation revealed its correspondence with a hypothetical protein from P. brasiliensis isolate Pb18 (Pb18), annotated as PADG-3347.1, which has a polypeptide sequence similar to the family 18 endochitinases. These endochitinases have distinct lectin and enzymatic domains. The multi-exon assembly of the correspondent gene (PADG-3347) was cloned and expressed in E. coli, and the physical and biological features of the recombinant protein were compared to those of the native paracoccin. Moreover, recombinant PADG-3347.1 (rPCN) was evaluated for its immunomodulatory properties and its ability to confer protection against murine P. brasiliensis infection. Thus, we investigated the interference of prophylactic and therapeutic administration of rPCN on the course of P. brasiliensis infection in BALB/c mice. The pulmonary histopathology of the treated mice showed lower incidence of granulomas, which were also smaller than those observed in the control animals. Consistently with the observation of few yeasts in the center of the granulomas, the CFU count provided by lung homogenates of treated mice was lower than the provided by control mice. Furthermore, administration of rPCN was associated with higher levels of IL-12, IFN-, TNF-, NO and IL-10, detected in the lung homogenates of animals. The high levels of cytokines produced in the rPCN treated mice prompted us to investigate the occurrence of interaction of the lectin with receptors present in innate immune cells, such as TLR2 and TLR4. We verified that rPCN activates TLR2,in homo or heterodimeric forms, and TLR4, in a manner that does not depend on CD14 and CD36 coreceptors. These data reveal a possible mechanism by which rPCN generates protection in mice against PCM. rPCN, administered therapeutic or prophylactically, induces TLRs activation and Th1 immunity, conferring protection against P. brasiliensis infection.

Os mecanismos imunológicos que governam a interação entre o fungo Paracoccidioides brasiliensis e o hospedeiro têm sido pouco estudados. Tanto os componentes do fungo como os receptores dos fagócitos envolvidos nesta interação são pouco conhecidos. Baseados nestes fatos, nosso trabalho teve por objetivo caracterizar in vitro e in vivo o envolvimento do receptor Toll Like-2 (TLR-2) e da proteína adaptadora MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) na infecção de camundongos pelo P. brasiliensis. O TLR-2 é um receptor da imunidade inata envolvido no reconhecimento de PAMPs (padrões moleculares associados aos patógenos), enquanto que MyD88 é uma molécula envolvida na sinalização celular induzida por muitos TLRs e que culmina com a ativação de vários fatores de transcrição, entre eles o NFB, envolvidos na ativação de genes ligados à resposta inflamatória. Para tanto, utilizamos camundongos C57Bl/6 deficientes e normais para TLR-2 e para MyD88. Demonstramos que, comparado ao grupo controle, animais TLR2-/- apresentavam uma infecção pulmonar menos grave associada com menor síntese de óxido nítrico (NO). Resultados equivalentes foram obtidos com macrófagos peritoneais e alveolares infectados in vitro. Inesperadamente, apesar das diferenças na carga fúngica, ambas as linhagens apresentavam tempo médio de sobrevida semelhante e lesões pulmonares de gravidade equivalente. Os estudos com leucócitos infiltrantes de pulmão revelaram um aumento de leucócitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) nos animais TLR-2-/- associado com um menor número de linfócitos TCD4+ e TCD8+ ativados. Animais TLR-2-/- deficientes apresentaram uma discreta diferença quanto à síntese de citocinas pulmonares dos tipos Th1 e Th2, porém estes animais apresentaram maiores níveis de KC, uma quimiocina CXC envolvida na quimiotaxia de neutrófilos, assim com maiores níveis de citocinas Th17 (IL-6, IL-17, IL-23 e TGF-). Além disso, a resposta imune Th17 desenvolvida por animais TLR-2-/- esteve associada com menor expansão de células T regulatórias CD4+CD25+FoxP3+. Assim, o TLR-2 controla a imunidade inata e adaptativa frente ao P. brasiliensis e regula negativamente a resposta imune Th17 e a patologia pulmonar. Em relação aos estudos com animais deficientes para a proteína adaptadora MyD88 na paracoccidioimicose verificamos que sua ausência resultou numa produção deficiente in vitro e in vivo de NO, além de uma produção deficiente in vivo de citocinas do tipo Th1, Th2 e Th17. Animais MyD88-deficientes infectados desenvolveram uma resposta imune prejudicada, evidenciada pelo menor número de macrófagos ativados, assim como uma imunidade adaptativa menos eficiente, evidenciada pelo menor número de células T CD4 ativadas que afluíram aos pulmões. Este quadro culminou com uma carga fúngica maior nos pulmões dos animais MyD88- deficientes, como também permitiu uma exuberante disseminação do fungo para outros órgãos, como fígado e baço. Os pulmões e o fígado apresentaram graves lesões com a presença de granulomas coalescentes e ricos agregados fúngicos. Assim, camundongos MyD88-deficientes não foram capazes de controlar a doença e morreram em um tempo mais curto que os animais MyD88-competentes, como evidenciado em experimentos de sobrevida. Assim, nossos achados demonstram que a sinalização intracelular mediada pela proteína MyD88 é importante para a ativação dos mecanismos fungicidas, assim como para a ativação das respostas imunes inata e adaptativa contra o P. brasiliensis. Em conjunto, nosso trabalho demonstra que tanto o TLR-2 quanto a molécula adaptadora MyD88 desempenham um papel relevante no controle da infecção, assim como na indução da resposta imune contra este patógeno fúngico primário. / The immunological mechanisms that govern the interaction between hosts and the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis have been scarcely studied. Both, fungal and phagocyte receptors involved in this interaction are poorly understood. Based on these facts, the aim of our study was to characterize in vitro and in vivo the role played by Toll Like Receptor-2 (TLR-2) and the adaptor protein MyD88 (myeloid differentiation primary response gene 88) in murine pulmonary paracoccidioidomycosis. The TLR-2 is a receptor of innate immunity involved in the recognition of PAMPs (pathogen associated molecular patterns), whereas MyD88 is a molecule involved in cell signaling induced by many TLRs . TLR-mediated activation results in the production of several nuclear transcription factors, including NFB, which activate important genes of the inflammatory response. Wild-type (WT) besides TLR- 2- and MyD88-deficient C57Bl/6 mice were used in our investigation. We showed that, compared to control animals, TLR2-/- mice developed a less severe pulmonary infection associated with reduced synthesis of nitric oxide (NO). Equivalent results were obtained with in vitro infected peritoneal and alveolar macrophages. Unexpectedly, despite the differences in fungal loads, TLR-2-/- and WT mice showed equivalent survival times and pulmonary lesions. Studies with lung infiltrating leukocytes revealed an increase of polymorphonuclear neutrophil leukocytes (PMNs) in TLR-2-/- mice associated with a low number of activated T CD4 and T CD8+ lymphocytes. Compared with WT mice, the TLR-2-deficient mice showed slight differences in the production of pulmonary Th1 and Th2 cytokines, but presented higher levels of KC, a CXC chemokine involved in neutrophil chemotaxis, besides increased levels of Th17 cytokines ( IL-6, IL-17, IL-23 and TGF-). Furthermore, the prevalent Th17 immune response developed by TLR-2-/- mice was associated with lower expansion of regulatory T cells CD4+CD25+FoxP3+. Thus, TLR-2 controls the innate and adaptive immunity against the P. brasiliensis infection and negatively regulates Th17 immune response and pulmonary pathology. Studies with MyD88-deficient mice showed an impaired production of NO in vivo and in vitro, and a deficient in vivo production of Th1, Th2 and Th17 cytokines. In addition, infected MyD88-deficient mice developed an impaired immune response, evidenced by poorly activated macrophages, as well as by an inefficient adaptive immunity mediated by a diminished influx of activated CD4+ T cells to the lungs. These events led to increased fungal loads in the lungs of MyD88-deficient mice and allowed a marked dissemination of the fungus to other organs such as liver and spleen, which presented severe lesions composed by coalescent granulomas containing high numbers of fungal cells. As consequence, MyD88-deficient mice were unable to control fungal growth and presented a decreased survival time. Our findings demonstrate that MyD88 signaling is important to the activation of fungicidal mechanisms and to the induction of the innate and adaptive immunity against P. brasiliensis. Altogether, our work shows that both TLR-2 and the adapter molecule MyD88, play an important role in controlling of P. brasiliensis infection, as well as in the induction of immune responses against this primary fungal pathogen.

Orientador: Wilson Nadruz Júnior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T23:44:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sales_MariaLilian_D.pdf: 3937457 bytes, checksum: 1aca22e05bdd5e09c3f3e53c2841451e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos experimentais revelaram que a inibição de componentes da via de sinalização celular regulada pelos Toll-Like Receptors (TLRs) pode atenuar a hipertrofia cardíaca em animais submetidos à sobrecarga pressora. O objetivo deste estudo foi investigar a influência dos polimorfismos Asp299Gly do TLR4 e Pro249Ser do TLR6 sobre a estrutura do ventrículo esquerdo (VE) em indivíduos hipertensos. Foram estudados 443 pacientes por meio de avaliação clínica, laboratorial e ecocardiográfica, enquanto que os polimorfismos foram detectados por reação de polimerase em cadeia/enzima de restrição. Ademais, monócitos obtidos de sangue periférico de pacientes hipertensos foram estimulados in vitro com LPS (agonista de TLR4) e zimosan (agonista de TLR6) e a produção de interleucina-6 e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-alfa) foi avaliada de acordo com a presença da variante Asp299Gly do TLR4 e Pro249Ser do TLR6. Mulheres que carregavam o alelo TLR4 299Gly apresentaram menor espessura de parede posterior do VE, menor espessura de septo, menor índice de massa do VE e reduzida prevalência de hipertrofia cardíaca. Mulheres homozigotas para TLR6 249Ser apresentaram menor espessura da parede do VE e menor espessura relativa da parede do VE em relação às mulheres com os genótipos Pro/Ser e Pro/Pro. Estes achados foram confirmados por análise de regressão linear múltipla, que incluiu idade, pressão arterial sistólica e diastólica, índice de massa corpórea, menopausa, diabetes mellitus e uso de antihipertensivos como fatores confundidores. Por fim, estudos funcionais in vitro revelaram que monócitos de homens e mulheres que apresentaram o alelo TLR4 299Gly tiveram menor produção de interleucina-6 após estímulo com LPS e a presença do alelo TLR6 249Ser em homozigose esteve associada a uma menor produção de interleucina-6 e TNF-alfa após estímulo com zimosan apenas nos monócitos extraídos de mulheres hipertensas. De maneira geral, esses dados sugerem que pode haver uma interação entre gêneros, polimorfismos dos receptores Toll-like e fenótipo do VE em indivíduos hipertensos. Sob esta perspectiva, estudos longitudinais são necessários para avaliar o impacto destes polimorfismos sobre o risco cardiovascular em mulheres hipertensas / Abstract: Experimental studies have shown that inhibition of components of cell signaling pathway regulated by Toll-Like Receptors (TLRs) can reduce cardiac hypertrophy in animals subjected to pressure overload. The aim of this study was to investigate the influence of the polymorphisms TLR4 Asp299Gly and TLR6 Pro249Ser on the structure of the left ventricle in hypertensive subjects. We studied 443 patients by clinical, laboratory and echocardiographic, while polymorphisms were detected by the polymerase chain / restriction enzyme. Moreover, monocytes obtained from peripheral blood of hypertensive patients were stimulated in vitro with LPS (TLR4 agonist) and zymosan (TLR6 agonist) and the production of interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) was assessed according to the presence of the Asp299Gly variant of TLR4 and Pro249Ser of TLR6. Women who carried the TLR4 299Gly allele had lower posterior wall thickness, thinner septum, a lower rate of left ventricular mass and reduced prevalence of cardiac hypertrophy. Women homozygous for TLR6 249Ser had lower posterior wall thickness and relative wall thickness, compared to women with the genotype Pro/Ser and Pro/Pro. These findings were confirmed by analysis of multiple linear regression that included age, systolic and diastolic blood pressure, body mass index, menopause, diabetes mellitus and use of antihypertensive drugs as confounding factors. Finally, in vitro functional studies revealed that monocytes from men and women who harbored the TLR4 299Gly allele had lower production of interleukin-6 after stimulation with LPS and the presence of homozygous 249Ser allele was associated with a lower production of Interleukin-6 and TNF-alpha after stimulation with zymosan only in monocytes hypertensive women. These data suggest that there may be an interaction between gender, polymorphisms of Toll-like receptors and ventricular phenotype in hypertensive subjects. In this regard, longitudinal studies are needed to assess the impact of these polymorphisms on the cardiovascular risk of hypertensive women / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Diversos estudos tem demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTM) são imbuídas de uma forte atividade imunossupressora in vitro, no entanto, os resultados de imunoterapias utilizando CTM têm sido variáveis até o momento. Nossa hipótese para tal variação são interações que devem ocorrer entre as CTM e fragmentos de patógenos circulantes nos pacientes, resultando na modulação da atividade imunossupressora. Para avaliar a ocorrência deste fenômeno em CTM de medula óssea, inicialmente foi avaliado a presença de diversos TLR através da marcação com anticorpos e posterior quantificação por citometria de fluxo, sendo observada a presença dos TLR2, TLR3, TLR4 e TLR9. No intuito de avaliar alterações no potencial imunossupressor, linfócitos T ativados e marcados a nível intracelular foram co-cultivados com CTM estimuladas com LPS, POLY IC e oligonucleotídeos com motivos CpG: DSP30, CpG-A e CpG-B, sendo sua proliferação quantificada por citometria de fluxo. Como resultados, foi observado que a estimulação com LPS e DSP30 levaram a perda e acentuação da capacidade supressora, respectivamente, enquanto o estímulo simultâneo com LPS e DSP30 resultou em sua manutenção. Tais modulações na imunossupressão foram corroboradas ao serem avaliadas modulações na expressão gênica, tendo em vista que o estímulo por LPS e DSP30 induziram no aumento da expressão de IL1 e TGF, respectivamente. Em seguida, foi avaliado o efeito das mesmas condições experimentais na indução a proliferação das CTM, ao ser mensurada alterações na quantidade de células em um equipamento de High content Screening (HCS). Como resultados, foi possível observar que somente o tratamento com DSP30 foi capaz de aumentar significativamente a quantidade de células, fenômeno corroborado ao ser mensurada a síntese de DNA, através da utilização de um produto comercial, seguido de análise por citometria de fluxo. No intuito de avaliar possíveis modulações na via NF-B, CTM estimuladas com LPS ou DSP30 foram sujeitas ao ensaio de imunoprecipitação de cromatina, utilizando anticorpos específicos a subunidades de RelA e RelB, sendo o DNA imunoprecipitado sujeito a PCR quantitativo com primers específicos para a regiões promotoras do gene VCAM-1. Como resultados, foi observado que o estímulo com LPS aumentou a atividade do RelA, enquanto não foram observados efeitos após o estímulo com DSP30. No entanto, o estímulo simultâneo com ambos os ligantes levou ao aumento de atividade de RelA e RelB. Ao serem avaliadas estas condições em um ensaio de imunofluorescência analisado em HCS, foi possível observar maiores níveis da proteína RelB no citoplasma das células tratadas com DSP30, sugerindo um aumento da sua formação. Apesar dos mecanismos moleculares subjacentes aos resultados observados ainda necessitarem de maior elucidação, nosso trabalho indica que a estimulação das CTM com DSP30 pode trazer benefícios no sentido de potencializar a imunossupressão e proliferação celular, além de impedir a perda da imunossupressão, decorrente da interação com LPS. Tais resultados poderão servir como diretrizes para o aprimoramento de imunoterapias utilizando CTM de medula óssea, principalmente em casos de pacientes com infecções por patógenos. / Several studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs ) are imbued with a strong immunosuppressive activity in vitro , however , the results of immunotherapies using CTM has been mixed so far. Our hypothesis for this variation are interactions that must occur between the CTM and fragments of circulating pathogens in patients , resulting in the modulation of the immunosuppressive activity. To evaluate the occurrence of this phenomenon in bone marrow MSCs was initially evaluated the presence of various TLR by staining with antibodies and subsequent quantification by flow cytometry , the presence of TLR2 , TLR3 , TLR4 and TLR9 was observed . To assess changes in the immunosuppressive , activated T lymphocytes and labeled intracellularly potential were co-cultured with MSC stimulated with LPS , poly IC and oligonucleotides with CpG motifs : DSP30 , CpG - A and CpG - B , and their proliferation measured by flow cytometry. As a result , it was observed that stimulation with LPS and DSP30 led to loss of stress and suppressing ability , respectively, while simultaneous stimulation with LPS and DSP30 resulted in maintenance. Such modulations in immunosuppression were corroborated when assessing modulations in gene expression , given that the stimulus induced by LPS and DSP30 in increased expression of TGFb and IL1 , respectively. Then , the effect of the same experimental conditions inducing proliferation of MTC to be measured changes in the amount of cells in a High Content Screening equipment (HCS ) was measured . As a result , it was observed that only the DSP30 treatment was able to significantly increase the amount of cells, phenomenon to be measured supported DNA synthesis through the use of a commercial product followed by analysis by flow cytometry . In order to evaluate possible modulations in NF-kB pathway , CTM stimulated with LPS or DSP30 were subjected to chromatin immunoprecipitation assay , using antibodies specific to subunits RelA and RelB , and the immunoprecipitated DNA subjected to quantitative PCR with primers specific to the promoter regions of VCAM-1 gene. As a result , it was observed that stimulation with LPS increased the activity of RelA , while effects were not observed after stimulation with DSP30 . However , simultaneous stimulation with both ligands led to increased activity of RelA and RelB . When these conditions are evaluated in an assay in HCS immunofluorescence analysis , we observed higher levels of RelB protein in the cytoplasm of cells treated with DSP30 , suggesting an increase in their formation. Although the molecular mechanisms underlying the observed results still require further elucidation , our work indicates that stimulation of MSC with DSP30 can bring benefits in terms of enhancing immunosuppression and cell proliferation , and prevent loss of immunosuppression resulting from the interaction with LPS . These results can serve as guidelines for the improvement of immunotherapies using CTM bone marrow , especially in cases of patients with infections caused by pathogens.