Submitted by RENATA ZUGAIB null (rzugaib@gmail.com) on 2017-01-20T15:02:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Renata - Defesa.pdf: 1638667 bytes, checksum: f166690438b6f00c2e9fe2b0da55497d (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-24T18:09:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 zugaib_r_me_bot.pdf: 1638667 bytes, checksum: f166690438b6f00c2e9fe2b0da55497d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-24T18:09:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 zugaib_r_me_bot.pdf: 1638667 bytes, checksum: f166690438b6f00c2e9fe2b0da55497d (MD5) Previous issue date: 2017-01-13 / O vírus da hepatite C (VHC) constitui a principal causa de doença hepática crônica, que representa um dos maiores problemas de saúde pública. O carcinoma hepatocelular (CHC), altamente associado a infecção crônica pelo vírus da hepatite C (VHC), é um dos tumores malignos mais comuns no mundo, com um alto índice de causa de óbito. Com o avanço das técnicas moleculares, tornou-se possível uma nova abordagem nos estudos gênicos para um melhor entendimento molecular de processos infecciosos e crônicos. Estudos evidenciando uma associação da transcrição gênica ao processo patológico e a importância de análises mais abrangentes. O sequenciamento de nova geração fornece uma maneira poderosa para a avaliação global do transcriptoma com alta resolução e um menor custo, possibilitando uma análise do perfil transcricional da doença. Assim, este estudo teve por objetivo avaliar o perfil de expressão gênica diferencial de pacientes infectados pelo VHC com CHC e comparar com amostras de tecidos não tumorais através do sequenciamento em larga escala do transcriptoma, a fim de identificar potenciais biomarcadores de diagnóstico e prognóstico de CHC. Foram analisados três fragmentos de tecido tumoral e três fragmentos de tecido hepático não tumoral como controle através do sequenciamento de RNAs (RNA-Seq). Os resultados obtidos demonstraram uma expressão diferencial de 4.792 genes. Avaliando os 10 genes mais e menos expressos, foi observada uma grande associação de variações nesses genes em diversos tipos de tumores. Também foram observados, entre os menos expressos, genes intimamente relacionados a função hepática ou relacionados a componentes produzidos pelo fígado. Esses achados sugerem que COL11A1, SFRP4, SFRP2, LRRC15, CCL18, ADAMDEC1, COL1A1, COL10A1, CTHRC1 e OLR1, superexpressos, possam atuar juntos no processo tumoral servindo como marcadores moleculares tumorais, e que a presença do tumor possa provocar uma desregulação nos genes associados ao fígado aqui encontrados, contudo, estudos mais específicos devem ser conduzidos para a confirmação dessa hipótese. / Hepatitis C virus (HCV) is the leading cause of chronic liver disease, one of the major public health problems. Hepatocellular carcinoma (HCC), highly associated with chronic hepatitis C virus (HCV) infection, is one of the most common malignant tumors in the world, with a high cause of death. With the advancement of molecular techniques, a new approach in gene studies has become possible for a better molecular understanding of infectious and chronic processes. Studies evidencing an association of the gene transcription to the pathological process and the importance of more comprehensive analyzes. Next generation sequencing provides a powerful way for the global evaluation of the transcriptome with high resolution and a lower cost, allowing an analysis of the transcriptional profile of the disease. Thus, this study aimed to evaluate the differential gene expression profile of HCV infected patients in their highest degree of chronicity (HCC) and to compare with non-tumor tissue samples through large-scale sequencing of the transcriptome in order to identify potential biomarkers for diagnosis and prognosis of HCC. Three fragments of tumor tissue and three fragments of non-tumor liver tissue were analyzed through the sequencing of RNAs (RNA-Seq). The results obtained demonstrated a differential expression of 4.792 genes. Evaluating the 10 over and down regulated genes, a high association of variations in these genes was observed in several types of tumors. Among the least expressed, genes closely related to liver function or related to components produced by the liver were also observed. These findings suggest that COL11A1, SFRP4, SFRP2, LRRC15, CCL18, ADAMDEC1, COL1A1, COL10A1, CTHRC1 and OLR1, overexpressed, may act together in the tumor process serving as molecular tumor markers, and that the presence of the tumor may lead to dysregulation in the genes associated with the liver found here, however, more specific studies should be conducted to confirm this hypothesis.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiegoDA_DISSERT.pdf: 2395435 bytes, checksum: d36171b7c7d9b30608e690a447e57864 (MD5) Previous issue date: 2011-11-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / In Brazil, accidents with scorpions are considered of medical importance, not only by the high incidence, but also for the potentiality of the venom from some species in determining severe clinical conditions. Tityus stigmurus is a widely distributed scorpion species in Northeastern Brazil and known to cause severe human envenomations, inducing pain, hyposthesia, edema, erythema, paresthesia, headaches and vomiting. The present study uses a transcriptomic approach to characterize the molecular repertoire from the non-stimulated venom gland of Tityus stigmurus scorpion. A cDNA library was constructed and 540 clones were sequenced and grouped into 37 clusters, with more than one EST (expressed sequence tag) and 116 singlets. Forty-one percent of ESTs belong to recognized toxin-coding sequences, with antimicrobial toxins (AMP-like) the most abundant transcripts, followed by alfa KTx- like, beta KTx-like, beta NaTx-like and alfa NaTx-like. Our analysis indicated that 34% include other possible venom molecules , whose transcripts correspond to anionic peptides, hypothetical secreted peptides, metalloproteinases, cystein-rich peptides and lectins. Fifteen percent of ESTs are similar to cellular transcripts. Sequences without good matches corresponded to 11%. This investigation provides the first global view of cDNAs from Tityus stigmurus. This approach enables characterization of a large number of venom gland component molecules, which belong either to known or atypical types of venom peptides and proteins from the Buthidae family / No Brasil, acidentes com escorpi?es s?o considerados de import?ncia m?dicosanit?ria, n?o somente por sua incid?ncia, mas tamb?m pela potencialidade do veneno de algumas esp?cies em determinar quadros cl?nicos graves. Tityus stigmurus ? uma esp?cie de escorpi?o amplamente distribu?da na regi?o Nordeste do Brasil sendo conhecida por causar graves envenenamentos humanos, cujos sintomas incluem: dor, hipoestesia, edema, eritema, parestesia, cefal?ia e v?mitos. A composi??o qu?mica do veneno do escorpi?o T. stigmurus ainda n?o foi bem avaliada, havendo uma car?ncia na literatura de estudos com enfoque na elucida??o do repert?rio molecular dos componentes deste veneno. Neste trabalho, realizamos uma abordagem transcript?mica para caracterizar o repert?rio molecular da gl?ndula de veneno n?o-estimulada do escorpi?o Tityus stigmurus. Para tanto, uma biblioteca de cDNA foi constru?da e, ? partir dela, 540 genes foram clonados e agrupados em 37 clusters com mais de um EST (expressed sequence tag) e 116 singlets (somente um EST). Do total de transcritos, 41% pertencem a sequ?ncias de toxinas conhecidas, sendo os pept?deos antimicrobianos (AMPs) os transcritos mais abundantes, seguido por α-KTX, β- KTX, β-NaTx e α-NaTx, respectivamente. Nossa an?lise revelou ainda que 34% s?o "poss?veis toxinas", cujos transcritos correspondem a pept?deos ani?nicos, pept?deos hipot?ticos secretados, metaloproteases, pept?deos ricos em ciste?na e lectinas. Quinze por cento dos ESTs s?o semelhantes a transcritos celulares. Transcritos sem similaridade com outras sequ?ncias do GenBank, foram chamadas de no hit e correspondem a 11% do total. Este trabalho apresenta a primeira vis?o global de cDNAs das gl?ndulas venenosas do escorpi?o Tityus stigmurus. Esta abordagem permite a caracteriza??o de um grande n?mero de mol?culas componentes da gl?ndula de veneno, que pertencem a tipos conhecidos ou at?picos de pept?deos e prote?nas do veneno da fam?lia Buthidae

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-04-08T22:35:40Z No. of bitstreams: 1 MarioEmilioTeixeiraDouradoJunior_TESE.pdf: 5285105 bytes, checksum: 0100fd5d41dfba7610de03558937e498 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-04-11T20:37:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MarioEmilioTeixeiraDouradoJunior_TESE.pdf: 5285105 bytes, checksum: 0100fd5d41dfba7610de03558937e498 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T20:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarioEmilioTeixeiraDouradoJunior_TESE.pdf: 5285105 bytes, checksum: 0100fd5d41dfba7610de03558937e498 (MD5) Previous issue date: 2015-03-17 / Indrodu??o. A S?ndrome de Guillain-Barr? (SGB) ? uma polineuropatia imunomediada, sendo, atualmente, a mais frequente causa de paralisia aguda neuromuscular. As principais variantes dessa s?ndrome s?o: a polineuropatia desmielinizante inflamat?ria aguda (PDIA), a neuropatia axonal motora aguda (NAMA), a neuropatia axonal motora e sensitiva aguda (NAMSA), e a s?ndrome de Miller-Fisher. H? tamb?m diferen?as na distribui??o geogr?fica destas variantes. A resposta imune aberrante, p?s infec??o, parece ser resultante de um mimetismo molecular, devido a forma??o de autoanticorpos e ativa??o do sistema complemento e de citocinas. S?o encontrados polimorfismos bial?licos nos genes codificadores dos receptores das fra??es Fc das imunoglobulinas (FcRIIa, FcRIIIa e FcRIIIb) que afetam a afinidade e efici?ncia na resposta imune celular, sugerindo a exist?ncia de susceptibilidade individual no risco de desenvolver a SGB. No Brasil, h? poucos estudos epidemiol?gicos sobre a SGB e nenhum relato sobre a frequ?ncia das variantes e suas manifesta??es cl?nicas. Os objetivos deste estudo foram: (1) caracterizar a SGB e suas manifesta??es cl?nicas em uma coorte de pacientes com SGB oriundos do Estado do Rio Grande do Norte (RN); (2) determinar se polimorfismos em receptores FcR est?o envolvidos com o risco de doen?a, e (3) avaliar a express?o g?nica global buscando identificar poss?veis vias que poderiam ser moduladas na fase inicial da doen?a e, consequentemente, diminuir o tempo de doen?a. Metodologia. Foram recrutados 149 casos de SGB diagnosticados entre 1994- 2013 no RN, tendo sido avaliados os dados cl?nicos e laboratoriais visando a determinar a evolu??o. DNA e RNA foram extra?dos do sangue perif?rico e anticorpos antiganglios?deos foram determinados em amostras de soro. Foram genotipados polimorfismos nos genes FCGR2A e FCGR3A, em pessoas com SGB (n=141) e controles saud?veis (n=364), sendo ainda analisadas as express?es g?nicas globais de 12 pacientes com SGB, por RNAseq. As amostras de sangue para os estudos de express?o g?nica foram coletadas ao diagn?stico e p?srecupera??o. Resultados. A incid?ncia de SGB foi de 0,3/100 mil pessoas no RN, sem presen?a de sazonalidade, com os casos ocorrendo em uma idade mais jovem. A SGB foi precedida por infec??es em 63,7%, sendo a diarreia associada a variante axonal (p=0,025). A PDIA foi a variante mais frequente (81,8%), seguida de NAMA (14,7%) e de NAMSA (3,3%). A distribui??o da fraqueza muscular correlacionou com as variantes, sendo a proximal mais frequente na PDIA, enquanto a distal predominou na variante axonal. O nadir < 10 dias ocorreu em 84,6% dos indiv?duos na variante axonal e 42,4% dos casos com PDIA (P<0,0001). A forma desmielinizante apresentou uma recupera??o na deambula??o mais r?pida do que a variante axonal (P<0,0001). A mortalidade de SGB foi de 5,3%. O pior progn?stico aos 12 meses estava associado com a variante axonal (OR 17,063; P = 0,03) e no tempo de melhora um ponto na escala funcional de Hughes (OR 1,028; P = 0.03). As distribui??es dos gen?tipos e alelos em FCGR2A (p=0,367) e em FCGR3A (p=0,2430) n?o foram diferentes entre os pacientes com SGB e controles. A an?lise da express?o g?nica global mostrou varia??o na express?o dos mRNAs de isoformas de prote?nas associadas ? fase sintom?tica da doen?a. Conclus?es. N?o h? sazonalidade na ocorr?ncia da SGB no RN, havendo um predom?nio da variante desmielinizante e 50% dos casos tinham idade inferior a 20 anos. A variante axonal est? associada ao mau progn?stico. O diagn?stico precoce e a identifica??o da variante, acompanhada de interven??es adequadas, levam a diminui??o da morbidade a longo prazo. Varia??es polim?rficas nos genes de FCGR parecem n?o influenciar a susceptibilidade ou o curso da SGB nessa popula??o. Varia??es na express?o g?nica apontam para vias de desregula??o e altera??es em intera??es transcricionais, que podem ser utilizadas como potenciais alvos de modula??o. / Introduction. Guillain-Barr? syndrome (GBS) is an immune-mediated polyneuropathy and the principal cause of acute neuromuscular paralysis. The most prominent GBS subtypes are: acute inflammatory demyelinating polyneuropathy (AIDP), acute motor axonal neuropathy (AMAN), acute motor-sensory axonal neuropathy (AMSAN) and Fisher syndrome (FS). Differences in geographical distribution of variants have been reported. In Brazil, there are few studies describing the characteristics of GBS, but none on the frequency of GBS variants and their clinical manifestations. Infection-induced aberrant immune response resulting from molecular mimicry and formation of cross-reacting antibodies, contribute to complement activation. Functional biallelic polymorphism in immunoglobulin receptors that influence the affinity of IgG subclasses and the type of immune response have been described, suggesting genetic susceptibility to developing disease. It remains unclear whether individuals carrying different FCGR alleles have differential risk for GBS and?or disease severity. The goals of this study were: (1) To characterize GBS and describe the clinical findings in a cohort of patients with GBS from the state of Rio Grande do Norte, Brazil; (2) to determine whether polymorphism in FCGR were associated with development of GBS, and (3) to tease out whether the global gene expression studies could be a tool to identify pathways and transcriptional networks which could be regulated and decrease the time of disease. Methods. Clinical and laboratory data for 149 cases of GBS diagnosed from 1994 to 2013 were analyzed. Genomic DNA and total RNA were extracted from whole blood. Antigangliosides antibodies were determined in the sera. In addition, we also assessed whether FCGR polymorphism are present in GBS (n=141) and blood donors (n=364), and global gene expressions were determined for 12 participants with GBS. Blood samples were collected at the diagnosis and post-recovery. Results. AIDP was the most frequent variant (81.8%) of GBS, followed by AMAN (14.7%) and AMSAN (3.3%). The incidence of GBS was 0.3 ? 100,000 people for the state of Rio Grande do Norte and cases occurred at a younger age. GBS was preceded by infections, with the axonal variant associated with episodes of diarrhea (P = 0.025). Proximal weakness was more frequent in AIDP, and distal weakness predominant in the axonal variant. Compared to 42.4% of cases with AIDP (P<0.0001), 84.6% of cases with the axonal variant had nadir in <10 days. Individuals with the axonal variant took longer to recover deambulation (P<0.0001). The mortality of GBS was 5.3%. A worse outcome was related to an axonal variant (OR17.063; P=0.03) and time required to improve one point in the Hughes functional scale (OR 1.028; P=0.03). The FCGR genotypes and allele frequencies did not differ significantly between the patients with GBS and the controls (FCGR2A p=0.367 and FCGR3A p=0.2430). Global gene expression using RNAseq showed variation in transcript coding for protein isoforms during acute phase of disease. Conclusions. The annual incidence of GBS was 0.3 per 100,00 and there was no seasonal pattern. A predominance of the AIDP variant was seen, and the incidence of the disease decreased with age. The distribution of weakness is a function of the clinical variants, and individuals with the axonal variant had a poorer prognosis. Early diagnosis and variant identification leads to proper intervention decreasing in long-term morbidity. FCGR polymorphisms do not seem to influence susceptibility to GBS in this population. This study found deregulated genes and signs of transcriptional network alterations during the acute and recovery phases in GBS. Identification of pathways altered during disease might be target for immune regulation and with potential to ameliorate symptoms.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-10-06T11:45:45Z No. of bitstreams: 1 2008_RobertoTernesArrial.pdf: 1174697 bytes, checksum: deb680a64e956cb71d50d5d028a379c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-03T17:27:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RobertoTernesArrial.pdf: 1174697 bytes, checksum: deb680a64e956cb71d50d5d028a379c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-03T17:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RobertoTernesArrial.pdf: 1174697 bytes, checksum: deb680a64e956cb71d50d5d028a379c8 (MD5) Previous issue date: 2008-04 / Paracoccidioides brasiliensis (Pb) é um fungo saprófito e dimórfico de importância clínica, pois seus propágulos, quando inalados por humanos, desencadeiam a doença conhecida como paracoccidioidomicose. No ano de 2005 foi publicado o transcriptoma do Pb, apontando diversos alvos potenciais de drogas, mas ainda assim uma parte significativa dos transcritos seqüenciados não possui proteínas homólogas identificadas. Esse trabalho sugere que alguns desses RNAs possam ser não-codificadores (ncRNAs), uma classe de moléculas biologicamente funcionais que no entanto não codificam para nenhum produto protéico. Para tanto foi feita uma abordagem exclusivamente computacional, utilizando exemplos conhecidos de mRNAs e ncRNAs para treinamento de dois algoritmos de aprendizado de máquina: naive Bayes (nB) e Máquinas de Vetores de Suporte (MVS). Diversos programas descritos na literatura e desenvolvidos localmente foram usados para obter propriedades dos transcritos e de seus produtos protéicos, de forma que os algoritmos de aprendizado de máquina fossem capazes de diferenciar satisfatoriamente um mRNA de um ncRNA. O uso de várias medidas de eficiência mostra que ambos algoritmos, MVS e nB, induziram classificadores que discriminam as duas classes de RNAs de forma muito eficiente, mas também indicam que o MVS possui uma vantagem significativa em relação à sua detecção de ncRNAs. Acurácia média mensurada por validação cruzada de 10 vezes para o MVS foi de 92,4%, e para o nB, 75,3%. Quando usados no transcriptoma de Pb, o MVS e o nB detectam, respectivamente, 970 e 262 ncRNAs, dos quais a maior parte é de transcritos sem anotação e singlets, duas características que apóiam a possibilidade de que esses transcritos sejam realmente ncRNAs. Comparações a programas relacionados mostram que o programa aqui descrito apresenta um ganho em velocidade computacional sem perda de acurácia. Foi desenvolvido nesse trabalho um programa computacional de análise ab initio, designado PORTRAIT, especializado em detecção de ncRNAs em transcriptomas de organismos pouco caracterizados. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis (Pb) is a saprophytic and dimorphic fungus of clinical importance because its propagules, when inhaled by humans, cause the disease known as paracoccidioidomycosis. In the year 2005 the Pb transcriptome was published, pointing out several potential drug targets, but still a significative amount of sequenced transcripts lack identified homologous proteins. This work suggests that these RNAs may be non-coding RNAs (ncRNAs), a class of biologically functional molecules that do not code for any protein product. Aiming this, a strictly computational approach was made, using known examples of mRNAs and ncRNAs for training two machine learning algorithms: naive Bayes (nB) and Support Vector Machines (SVM). Several programs available from literature and locally developed were used to obtain properties from transcripts and its corresponding protein products, in such a way that machine learning algorithms could successfully discriminate between mRNA and ncRNA. Several efficiency measurements show that both algorithms, SVM and nB, induced classifiers able to efficiently discriminate the two classes of RNAs, and also indicate that SVM has a significative advantage regarding ncRNA detection. Mean accuracy as estimated by 10-fold cross-validation procedure was 92.4% for SVM and 75.3% for nB. When used in the Pb transcriptome, SVM and nB detect, respectively, 970 and 262 ncRNAs, of which the majority is composed of singlets and unnanotated transcripts, two characteristics that support the possibility that these transcripts are real ncRNAs. Comparison to related works indicates that the described program offers a computational speed improvement without hindering accuracy. This work describes the design of a computational program for ab initio analysis, named PORTRAIT, specialized in detection of ncRNAs in transcriptomes from poorly characterized organisms.

A partir de uma biblioteca de cDNA de glândulas de veneno de Micrurus corallinus (cobra-coral), uma serpente da Família Elapidae bastante representada no Brasil e muito comum em áreas florestais tropicais, foram gerados 1.438 Expressed Sequences Tags (ESTs), agrupados em 611 clusters. O banco representa os genes mais expressos na glândula de veneno de M. corallinus. Os transcritos relacionados às toxinas apresentaram ao redor de 46% de representação nesse banco de seqüências. A composição geral das toxinas inclui: toxinas de três dígitos (3FTx) (24%), fosfolipases A2 (PLA2) (16%), lectinas do tipo C (5%), entre outros. O banco permitiu não somente a identificação de possíveis toxinas, mas também de transcritos celulares, sendo a maioria envolvida nas funções fisiológicas de células da glândula de veneno. A maior parte dessas moléculas apresenta um envolvimento na expressão gênica e protéica, o que reflete uma alta especialização do tecido para a síntese de toxinas. A análise do transcriptoma de glândulas de veneno de M. corallinus possibilitou a identificação de alguns candidatos antigênicos para um anti-soro antielapídico alternativo. Cinco candidatos antigênicos foram selecionados por meio da análise do transcriptoma obtido: Atg1 (Grupo das neurotoxinas Homolog 8), Atg2 (Grupo das neurotoxinas Homolog 7/3/1), Atg3 (Outras neurotoxinas 1), Atg4 (Outras neurotoxinas 2) e Atg5 (fosfolipase do tipo A2). Avaliamos a viabilidade de imunização com o DNA desses candidatos. Para isso, os cinco grupos de antígenos foram clonados, primeiramente em pGEM-T e, posteriormente, em pSecTag2A, que é um vetor de expressão em células de mamíferos. As clonagens foram inicialmente testadas em células do tipo COS (transfecção transiente), entretanto não ficou clara a capacidade dessas células em expressar os antígenos. Para a análise da resposta imunológica da vacina de DNA, proteínas recombinantes produzidas em E. coli foram utilizadas para o coating de ELISA para detectar anticorpos presentes no soro primário proveniente da imunização com DNA. Os resultados mostraram que o soro dos animais imunizados foi capaz de reconhecer os antígenos recombinantes. Isso indica que a imunização por DNA em camundongos poderia ser uma boa alternativa em relação à imunização do veneno puro de serpente, que é custosa e muito depende da disponibilidade do veneno. Apesar da necessidade de testes complementares, esse é um resultado promissor, já que a produção de anticorpos pode ser alcançada por via de imunização intramuscular, mais prática para objetivos de produção. / Micrurus corallinus(coral snake) is a tropical forest snake belonging to the Elapidae Family, and is very common in Brazil. From the cDNA library of its venom glands, 1.438 Expressed Sequences Tags (ESTs) were generated and grouped into 611 clusters. This database contains the most expressed genes in the M. corallinus venom glands. The transcripts related to toxins represent approximately 46% of the total genes in this database. The toxin compound consists of: three finger toxins (24%), phospholipases A2 (PLA2s) (16%), type-C lectins (5%), among others. This database allowed not only the identification of possible toxins, but also the identification of cellular transcripts, most of which seems to be involved in physiological functions of venom gland cells. The majority of these molecules are involved in gene and protein expression, revealing the high level of specialization of the tissue for toxin synthesis. The analysis of the M. corallinus venom gland transcriptome allowed the identification of some antigenic candidates for an alternative antielapidic antiserum. Five antigenic candidates were selected after analysing the transcriptome: Atg1 (Homolog group 8), Atg2 (Homolog group 7/3/1), Atg3 (Other neurotoxins 1), Atg5 (A2-type phospholipase). These five antigenic groups were used for DNA immunization. Then they were first cloned in pGEM-T and, after, in pSecTag2A, which is an expression vector in mammal cells. The cloning was tested in COS-type cells (transient transfection), without signs of expression. To analyze the immunological response, recombinant proteins were produced in E. coli and used for ELISA coating to react with the primary serum deriving from the DNA immunization. The results showed that the serum from the immunized animals was able to recognize the recombinant antigens, indicating that the DNA immunization in mice could be a feasible alternative regarding the traditional immunization with crude snake venom, which is costly and heavily dependent on the availability of the venom. Regardless the need for additional tests, this is a promising result, because the antibody production can be achieved by intramuscular immunization, a more effective method when aiming for downstream production.

A cana-de-açúcar é uma gramínea com fotossíntese do tipo C4, com capacidade de acumular sacarose nos colmos em quantidades que excedem 50% de seu peso seco, característica única no reino vegetal (Moore, 1995). Sacarose e seu derivado mais importante, etanol, são dois produtos de grande importância mundial. Assim, o teor de sacarose em cana tem fundamental importância no aumento da produtividade dessas duas commodities. O melhoramento clássico parece ter alcançado seu limite, já que incrementos expressivos no teor de sacarose em novas variedades não têm sido observados e tudo aponta para a necessidade de estudos que levem a uma maior compreensão dos mecanismos moleculares associados à produção, transporte e acúmulo de sacarose em cana (Casu et al., 2005; Moore, 1995). Procurar seqüências promotoras de genes de interesse é importante para a obtenção de transgênicos, já que promotores constitutivos não apresentam resultados satisfatórios em cana (Lakshmanan et al., 2005). É também objetivo aqui hibridar mRNA de genótipos de cana-de-açúcar com segregação para acúmulo de sacarose, em uma plataforma customizada de oligos (Agilent), com aproximadamente 44k elementos, que compõe uma representatividade gênica não alcançada em esforços anteriores com microarranjos de cDNA. Genome walking foi a técnica utilizada na obtenção de regiões à montante do primeiro éxon, predito in silico, para três proteínas quinase de interesse, SASGMS11561, SASGMS16343 e SASGMS09047, que se mostraram moduladas em experimentos anteriores de hibridação com amostras segregantes para conteúdo de sacarose. Foi obtido sucesso nos três casos, tendo os fragmentos de DNA sido seqüenciados e oportunamente alinhados à montante dos correspondentes genes ortólogos em sorgo, bem como ao banco ainda em construção de contigs do genoma de cana-de-açúcar, obtidos por shotgun. A plataforma Agilent, com seus 43803 SAS únicos, mostrou-se uma ferramenta muito adequada para as hibridações de genótipos de mais alto Brix contra genótipos de mais baixo Brix. Um total de 569 genes diferencialmente expressos foram obtidos em pelo menos uma das três hibridações realizadas. Um grupo de genes, de diferentes categorias e perfis de modulação, foi validado por PCR em tempo real, obtendo uma taxa de aproximadamente 90%. Apesar do grande número de SAS diferencialmente expressos, por volta de 70% dos mesmos ainda se encontram não categorizados, seja por falta de similaridade de seqüência em bancos de dados de organismos próximos ou pela alta complexidade e esforço prático na cura desse processo de categorização manual. Assim, três fragmentos de seqüências promotoras para três proteínas quinase de interesse foram obtidos e seqüenciados, como parte dos esforços do grupo em formar um catálogo de promotores específicos para cana-de-açúcar. Um grupo de genes foi analisado dos resultados das hibridações por seus papéis relevantes nos processos que levam ao maior teor de sacarose em cana, devidamente corroborados por trabalhos do próprio grupo, bem como de outros / Sugarcane is a C4 plant with the unique characteristic of being capable of accumulating sucrose in its culms in quantities that exceed 50% of its dry weight (Moore, 1995). Sucrose and ethanol are highly valued products in the world of today. Sucrose content is a trait with fundamental importance in the on-going process of increasing productivity of these two sugarcane byproducts. Classic improvement of sugarcane seems to have reached its practical limits, given that it has become increasingly harder to obtain varieties with increased sugar content. This obstacle points towards the necessity of better comprehension of the molecular mechanisms associated to the production, transport and accumulation of sucrose in sugarcane (Casu et al., 2005; Moore, 1995). The search for promoter sequences of genes of interest is crucial for the production of transgenic lines, since the use of constitutive promoters in sugarcane has been highly problematic, leading to unsatisfactory results in most cases (Lakshmanan et al., 2005). Another objective was to hybridize sugarcane genotypes with contrasting sugar content in a customized Agilent oligo platform, containing approximately 44k elements, which signifies the best effort so far regarding gene representativeness. Genome walking was the chosen technique to obtain upstream regions of the first in silico predicted exon of three proteins kinases of interest, SASGMS11561, SASGMS16343 and SASGMS09047, all of them selected from previous hybridization experiments with contrasting sucrose content samples. Success was achieved in all three cases, and the obtained fragments were sequenced and aligned to their respective syntenic region on the sorghum genome as well as on contigs from an increasingly larger bank of genomic sugarcane sequences, from our group, which has been acquired using the shotgun sequencing method. The Agilent platform, with its 43803 unique sugarcane assembled sequences (SAS), has proven valuable as a powerful high scale tool for the hybridization of genotypes with contrasting Brix values (high versus low Brix). A total of 569 differentially expressed genes were obtained from at least one of the three experiments accomplished. A group of genes from different categories and modulation profiles was depicted and validated through real time PCR, with an approximate validation rate of 90%. Although the number of differentially expressed genes is high, around 70% of them is still uncategorized, mostly because of their unique identity and therefore lack of reference organisms to compare with and the high complexity and laboriousness of categorizing them manually. In summary, three promoter fragments from three different protein kinases of interest were obtained and sequenced, as a part of a greater effort to create a sugarcane promoter sequence catalogue. From the hybridization assays, a group of genes were analyzed, due to their putative importance in the processes that lead to a higher sucrose content in sugarcane, also corroborated by previous studies from our group as well as from others.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:48:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_LeandroCostado_M.pdf: 1292421 bytes, checksum: e05cfc27d3bf5ae000bfe8b621a750c8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A soja é uma das principais commodities da economia internacional, sendo sua produção mundial de cerca de 220 milhões de toneladas por safra. Além de ser um alimento rico em proteínas e usado para a fabricação de óleo vegetal, a planta vem ganhando visibilidade devido a possibilidade de ser usada na fabricação de biocombustíveis, principalmente o biodiesel. Para o Brasil, a soja tem grande importância na balança comercial, sendo o país o segundo maior produtor do mundo. Neste contexto, no ano de 2007, o governo brasileiro estabeleceu um consórcio de pesquisas em soja - denominado GENOSOJA - com o objetivo de identificar características genéticas que possam facilitar o processo produtivo da planta, com foco nos diversos estresses que acometem a produção nacional, como a ocorrência de secas, o ataque de pragas e a doença da ferrugem asiática, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. Este trabalho está inserido no escopo do GENOSOJA, propondo a construção de bancos de dados contendo informações disponíveis nos diversos bancos públicos (sequências genômicas, ESTs e cDNA full-lenght), integrando-as com as informações geradas no decorrer do projeto (tags de SuperSAGE, bibliotecas subtrativas de cDNA e microRNAs). Além disso, foram construídas diversas interfaces web que oferecem aos usuários diversas funcionalidades, incluindo: comparações estatísticas, consultas por palavras-chave, dados sobre anotação e expressão dos genes nas diversas condições e experimentos estudados. Dessa forma, o ferramental de bioinformática aqui apresentado pode facilitar a compreensão de como as diferenças de expressão gênica da planta podem afetar características de importância agronômica / Abstract: Soybean is one of the main commodities in the international economy, with a world production of about 220 millions of tons per harvest. Besides being a protein rich food and used for vegetable oil production, the plant has been gaining visibility due to the possibility of being to make biofuels, especially biodiesel. The soybean culture is of great importance in the Brazilian economy, being the country the second largest producer in the world. In this context, in 2007, the Brazilian government established a research consortium in soybean - called GENOSOJA - aiming to identify genetic traits that may facilitate the production process of the plant, focusing on the different stresses that affect the national production, as the occurrence of drought, pests' attacks and the asian rust disease, caused by the Phakopsora pachyrhizi fungus. This work is inserted in the GENOSOJA, proposing to build a set of databases containing information available in several public databases (genomic sequences, ESTs and full-length cDNA), integrating them with information generated during the project (SuperSAGE tags, cDNA subtractive libraries and miRNAs). Additionally, several web interfaces were built. They offer to users many features, including: statics comparisons, keyword searches, data about annotation and gene expression in different experiments and conditions. Thus, the bioinformatics tools presented here may facilitate the understanding of how the differences in gene expression can affect plant traits with agronomic importance / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:19:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_NataliaCristinaVerza_D.pdf: 9495810 bytes, checksum: 18cf9ae055a2b9f39de109abc6de469c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O seqüenciamento de ESTs (etiquetas de seqüências expressas) e a sua organização em bancos de dados constituem poderosas ferramentas para identificar genes de interesse expressos em determinados tecidos e/ou tipos celulares. Neste trabalho criou-se um banco de seqüências expressas chamado MAIZESTdb, que contém ESTs de diversos tecidos de milho, porém enriquecido com seqüências provenientes do endosperma de milho em desenvolvimento. O MAIZESTdb contém 227.431 ESTs vindos de mais de 30 órgãos e tecidos de milho diferentes, 30.531 seqüenciados em nosso laboratório a partir de bibliotecas construídas com RNA mensageiro de endosperma. Estas seqüências representam uma grande contribuição na identificação de novos genes expressos no endosperma. A análise deste banco de ESTs possibilitou a identificação de 4.032 transcritos preferencialmente expressos no endosperma, e a sua anotação revelou uma ampla variedade de prováveis genes novos envolvidos no desenvolvimento e no metabolismo do endosperma. O banco MAIZESTdb foi utilizado neste trabalho para a identificação de fatores de transcrição (TFs) expressos no endosperma de milho, e, especialmente, na identificação de fatores preferencialmente expressos no endosperma, que podem desempenhar papéis regulatórios importantes durante a formação da semente. Foram identificados 1.233 TFs expressos em milho, 414 dos quais expressos no endosperma em desenvolvimento. Foram identificados ainda, através de análises in silico, 113 TFs preferencialmente expressos no endosperma, conjunto este que representa 9.2% dos TFs expressos identificados em milho, e que possivelmente contém reguladores importantes dos processos de especificação celular e desenvolvimento do endosperma de milho. Esta é a maior coleção de fatores de transcrição já descrita para este tecido, e representa uma fonte de dados importante para identificação de reguladores dos principais processos relacionados ao desenvolvimento do endosperma, como metabolismo de nitrogênio e carboidratos e controle da massa da semente. Uma das famílias mais representadas entre os TFs preferencialmente expressos no endosperma foi a família NAC de fatores de transcrição. Esta família apresentou 12 membros preferencialmente expressos no endosperma de milho. Um novo membro da família NAC, chamado de EPN-1 (Endosperm Specific NAM 1), teve seu perfil de expressão caracterizado. Sua expressão pode ser detectada desde os 5 DAPs, embora o pico de expressão ocorra entre 20 e 25 DAP, e ele apresenta expressão preferencial no endosperma. O promotor do gene EPN-1 foi clonado, seqüenciado e analisado quanto aos seus possíveis elementos CIS regulatórios; foram encontrados elementos conservados relacionados à endosperma-especificidade, elementos relacionados à regulação por ácido abscísico e giberelinas, e elementos conservados presentes nos promotores de a-amilases, indicando uma possível relação deste gene com o processo de transição entre a maturação e a germinação da semente. Ensaios de expressão transitória com o promotor do gene EPN-1 revelaram que sua expressão está dirigida à camada de aleurona do endosperma de milho, o que constitui mais uma evidência de sua possível função na regulação de genes relacionados aos processos de maturação e germinação da semente / Abstract: The sequencing of ESTs (expressed sequence tags) and its organization in databases constitute powerful tools to identify genes of interest in certain tissues and/or cell types. In this work we have created MAIZESTdb, a database of ESTs expressed in diverse maize tissues. The importance of this database, however, is that it is enriched with sequences from developing maize endosperm. The MAIZESTdb contains 227,431 ESTs coming from more than 30 different maize tissues and organs, 30,531 of which sequenced from endosperm cDNA libraries constructed in our laboratory. These sequences represent a great contribution for the identification of novel genes expressed in endosperm. The analysis of this ESTs database led to the identification of 4,032 transcripts preferentially expressed in the endosperm, and its annotation revealed a great variety of new genes involved in endosperm metabolism and development. The MAIZESTdb was then used to identify transcription factors (TFs) expressed in maize endosperm, and, mainly, in the identification of TFs preferentially expressed in the endosperm. We identified 1,233 TFs expressed in diverse maize tissues, 414 of which expressed in developing endosperm. We also identified, through in silico comparison of transcript abundance and library source, 113 TFs with preferential expression in endosperm, representing 9,2% of the TFs identified in this work. This dataset probably contains important regulators of cellular specification of the endosperm development. This is the biggest TFs collection reported for this tissue, and represents an important source of data for identification of regulators for main processes related to the endosperm development such as nitrogen and carbohydrate metabolism and control of seed mass. One of the most represented families among the TFs preferentially expressed in endosperm was the NAC family of transcription factors. This family presented 12 members with preferential expression in the endosperm. A new member of the NAC family, called EPN-1 (Endosperm Specific NAM 1), was characterized. Its expression / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Emmanuel Dias-Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:55:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins-de-Souza_Daniel_D.pdf: 2995342 bytes, checksum: bba6d65f7fb9ab2fd672a1027a054163 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A esquizofrenia é um distúrbio mental debilitante que afeta aproximadamente 1% da população mundial, caracterizado por sintomas produtivos como delírios e alucinações e sintomas negativos como apatia e decréscimo das emoções. Nesta tese, realizamos estudos do transcriptoma e do proteoma em tecido cerebral de pacientes com esquizofrenia, buscando identificar genes e proteínas envolvidas com esta doença. Em nossas análises transcricionais, utilizamos a técnica de Serial Analysis of Gene xpression (SAGE), uma abordagem ainda inédita em esquizofrenia. Os dados permitiram a análise de mais de 20 mil transcritos, e apontaram para o possível envolvimento de genes associados a processos como mielinização, função sináptica, metabolismo energético e homeostase de cálcio, incluindo genes anteriormente envolvidos com esquizofrenia, e também uma boa parcela de genes até então não associados com a doença. Uma pequena fração destes novos marcadores foi avaliada por Real-Time PCR permitindo a confirmação de alguns achados de SAGE. ossas análises de proteoma foram feitas com as técnicas de eletroforese de duas dimensões, seguida por espectrometria de massas e pela técnica de shotgun proteomics, também inédita em esquizofrenia. Estas análises foram realizadas com amostras de diferentes regiões cerebrais, incluindo córtex pré-frontal e lobo temporal anterior, e apontaram para alterações quantitativas em proteínas relacionadas com a homeostase de cálcio, citoesqueleto, metabolismo energético e de oligodendrócitos. De modo geral, observamos uma boa consistência entre os resultados obtidos quando estudamos diferentes classes de marcadores potenciais (genes e proteínas). Por muitas vezes os genes alterados não corresponderam a alterações quantitativas nas mesmas proteínas, no entanto, na maior parte dos casos, observamos alterações consistentes nas mesmas vias. Observamos a regulação diferencial do metabolismo de oligodendrócitos, energético, sináptico e revelamos a provável alteração da homeostase de cálcio em cérebros de pacientes com esquizofrenia, além de identificarmos genes e proteínas diferencialmente expressas nunca relacionadas à doença. Nossos dados reforçam achados prévios, apontam potenciais biomarcadores e podem fornecer novas pistas na compreensão da esquizofrenia / Abstract: Schizophrenia is a mental debilitating disorder that affects 1% of the world population. It is characterized by positives symptoms such as delirium and hallucinations and negative symptoms such as apathy and emotion decrease. Here, we have studied the ranscriptome and proteome of brain samples of patients with schizophrenia, in an attempt to identify genes and proteins markers of the disease. Our transcriptome analyses of pre-frontal cortex were performed with Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), here used for the first time in the study of schizophrenia. The data obtained allowed the analysis of approximately 20,000 transcripts, which suggested the importance of myelinization, synaptic function, energy metabolism and calcium homeostasis, in the genesis of schizophrenia. A series of genes previously implicated in the disease were identified, together with new potential markers which were revealed here for the first time. A small fraction of these was validated using realtime PCR, which confirmed some of the SAGE findings. Two-dimensional gel electrophoresis, mass spectrometry and shotgun proteomics were the approaches used here for large-scale protein analysis in schizophrenia. These approaches were used in brain samples derived from distinct areas such as pre-frontal cortex and anterior temporal lobe, and indicated quanitative alterations of proteins involved with calcium homeostasis, energy and oligodendrocyte metabolism and cytoskeleton. In general, a good correlation was observed when the different approaches (transcriptome and proteome) were used. In may cases, the alterations of some genes was not reflected by a correspondent alteration of the encoded protein. However, in most cases, reproducible alterations were found in the same pathways. Beside the identification of new schizophrenia-related genes and proteins, we also confirmed the the differential regulation of oligodendrocyte, synaptic and energetic metabolism, in this disease.Our data reinforce previous findings, and suggest new potential biomarkers that may contribute to the understanding of schizophrenia / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A cana-de-açúcar possui uma característica única entre as plantas de interesse econômico mundial: a capacidade de acumular altos níveis de sacarose no colmo. No Brasil, em virtude do aumento da demanda interna e mundial por fontes energéticas renováveis, é nítida a expansão da cultura canavieira para regiões menos propícias para cultivo, como as regiões secas do centro-oeste brasileiro. O déficit hídrico é um dos principais agentes que afetam o desenvolvimento das plantas e a obtenção de variedades melhor adaptadas é fundamental para a sustentabilidade e expansão da agroindústria canavieira. Neste sentido, genes regulados por seca são alvos importantes para a obtenção de plantas transgênicas mais tolerantes ao estresse. Como a expressão constitutiva do transgene pode causar efeitos indesejáveis nas plantas transgênicas, também é necessária a identificação de promotores induzíveis pelo estímulo ambiental. O objetivo deste trabalho é a identificação de genes e sequências promotoras reguladas pela seca em cana-de-açúcar que, além de contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância ao estresse, podem ser utilizados como alvos para obtenção de plantas transgênicas mais resistentes. Para a identificação de genes diferencialmente regulados por seca, utilizamos diferentes plataformas de microarranjo: SUCAST (com 1.830 genes relacionados à transdução de sinal), SUCAMET (com 4.594 genes relacionados a metabolismo) e CaneRegNet (com sondas para a identificação de transcritos senso e antisenso que correspondem a 14.522 genes únicos). Nestas plataformas, analisamos a expressão dos genes de quatro variedades de cana-de-açúcar, duas tolerantes e duas sensíveis à seca, submetidas a 24, 72 e 120 h de déficit hídrico. Dos genes diferencialmente expressos (alguns identificados como transcritos pelas fitas senso e/ou antisenso), 53 foram selecionados para validação por PCR em tempo real. As regiões promotoras de quatro dos genes selecionados foram identificadas por meio das técnicas de andamento cromossômico, de seleção e sequenciamento de cromossomos artificiais de bactéria contendo DNA de cana-de-açúcar e de análise de contigs obtidos por Whole Genome Shotgun. Sete sequências promotoras foram selecionadas e clonadas em um vetor contendo o gene repórter gus. As atividades promotoras destas sequências foram testadas e verificadas em transformações transientes de calos embriogênicos de cana-deaçúcar. Para obtenção de plantas de cana-de-açúcar transgênicas, selecionamos o gene induzido por seca que codifica uma PP2C. Através da transformação de calos embriogênicos de cana-de- açúcar com vetor de silenciamento de pp2c, obtivemos algumas plantas com expressão de pp2c reduzida. O transcriptoma das plantas transgênicas foi avaliado. Em comparação com plantas controles e em condições normais de irrigação, identificamos 352 transcritos com expressão alterada. As plantas transgênicas com pp2c silenciado e plantas controles também foram estudadas num experimento de supressão de rega. Os dados fisiológicos e as observações morfológicas demonstraram que um dos eventos transgênicos apresentou tolerância à seca. A comparação do transcriptoma das plantas irrigadas contra as submetidas à seca e da planta tolerante contra não tolerantes ao estresse mostrou que diversos genes estavam diferencialmente regulados, inclusive aqueles envolvidos na sinalização por ABA, via no qual o gene pp2c atua. / Sugarcane has a unique characteristic among crop plants in the world: the ability to accumulate high levels of sucrose in its stems. In Brazil, due to the local and global increasing demand for renewable energy sources, it is notable the expansion of sugarcane cultivation to areas less favorable for cultivation, such as the dry regions of central-western Brazil. Water deficit is one of the main agents that affect plant development. The production of better varieties is critical to the sustainability and expansion of the sugarcane industry. In this way, genes regulated by drought are important targets for obtaining transgenic plants tolerant to stress. Since transgene constitutive expression may cause unwanted effects in transgenic plants, it is also important to identify of stress inducible promoters. The goal of this work is the identification of genes and promoters regulated by drought in sugarcane that, in addition to contributing to the understanding of the mechanisms involved in stress tolerance, can be used as targets for the production of transgenic plants more resistant to water stress. For the identification of genes differentially expressed in response to drought, we have used different microarray platforms: SUCAST (contains 1,830 genes related to signal transduction), SUCAMET (contains 4,594 genes related to metabolism) and CaneRegNet (contains probes for the identification of sense and antisense transcripts that correspond to 14,522 unique genes). In these platforms we analysed gene expression of four different sugarcane varieties, two tolerant and two sensitive to drought, after 24, 72 and 120 h of water deficit. From the genes differentially expressed (some transcribed by the sense and/or antisense strand), 53 were selected for qPCR validation. Promoter regions of four genes were identified by Chromosome Walking, selection and sequencing of BACs and the analyses of Whole Genome Sequencing contigs. Seven promoter sequences were selected and cloned into a vector containing the gus reporter gene. Promoter activity was tested and verified through the transient transformation of sugarcane embryogenic calli. For sugarcane transgenics production we selected the drought-induced pp2c gene. Through the transformation of sugarcane embryonic calli with a vector for pp2c silencing we obtained transformed plants with pp2c gene expression reduced. The transcriptome of transgenic plants was analysed. In comparison with control plants and in irrigated conditions, we identified 352 differentially expressed transcripts. Transgenic plants with silenced pp2c and control plants were studied in a pilot drought experiment. Physiological data and morphological observations indicated that one of the transgenic events presented tolerance to drought. The comparison between irrigated and drought plants and between tolerant and no tolerant showed that a large number of genes was differentially regulated including genes related to the ABA signaling, pathway in which pp2c acts.