Leptospira is a basal genus in an ancient group of bacteria, the spirochetes. The pathogenic species are responsible for leptospirosis, a disease with worldwide distribution and of public health importance in developed tropical countries. L. interrogans serovar Copenhageni is the agent for the majority of human leptospirosis in Brazil. In this work, we used a great variety of experimental approaches to characterize the SOS system in this serovar, to identify its impact in general DNA damage response, as well as to assess the DNA repair toolbox owned by pathogenic and saprophytic leptospires. We identified an additional repressor LexA, acquired by lateral gene transfer, exclusively in serovar Copenhageni. We also observed that UV-C irradiation led to massive death of cells and blockage of cell division in the survivors. Both repressors were active and we identified the sequences responsible for binding to promoters. However, the LexA1 SOS box was redefined after a de novo motif search on LexA1 ChIP-seq enriched sequences. This regulator was able to bind to at least 25 loci in the genome. DNA damage also caused a massive rearrangement of metabolism: increase in expression was observed in transposon and prophage genes, in addition to DNA repair pathways and mutagenesis inducers; on the other hand, motility, general metabolism and almost all virulence genes were repressed. Two induced prophages provided several proteins with useful functions. We also assessed the DNA repair-related genes presented by the three species of Leptospira: the saprophytic L. biflexa, the facultative pathogen L. interrogans and the obligatory pathogen L. borgpetersenii. There are more diversity and redundancy of repair genes in L. interrogans in comparison with the other species. Lateral gene transfer seems to be an important supplier of DNA repair functions. In addition, leptospires share characteristics of both Gram-positives and Gram-negatives bacteria. Representative genes from several different pathways were induced during infection of susceptible mice kidneys, suggesting DNA repair genes are active while causing disease. All these data suggest mobile genetic elements are the major forces in leptospiral evolution. Moreover, during DNA damage response, several SOS-dependent and independent mechanisms are employed to decrease cell growth and virulence in favor of controlled induction of mechanisms involved in genetic variability. / Leptospira é um gênero basal em um grupo já considerado um dos mais ancestrais, as espiroquetas. As espécies patogênicas são responsáveis pela leptospirose, uma doença presente em todo o mundo e de principal importância em países tropicais em desenvolvimento. L. interrogans sorovar Copenhageni é o agente da maior parte dos casos no Brasil. Nesse trabalho, utilizamos diversas abordagens experimentais para caracterizar o sistema SOS nesse sorovar, identificar seu impacto na resposta geral a danos no DNA, assim como avaliar as funções de reparo de DNA disponíveis em leptospiras patogênicas e saprofíticas. Identificamos um repressor LexA adicional, adquirido por transferência horizontal e exclusivo do sorovar Copenhageni. Observamos também que irradiação por UV-C causou significativa morte celular e bloqueio da divisão celular dos sobreviventes. Ambos os repressores são ativos e identificamos as sequências que utilizam para se ligar aos promotores dos genes regulados. Entretanto, o SOS box de LexA1 foi redefinido após uma busca de novo por motivos enriquecidos nas sequências recuperadas por ChIP-seq. Esse regulador ligou-se ao menos a 25 locais do genoma. A maioria desses alvos teve aumento de expressão após UV-C. Danos no DNA também causaram um importante rearranjo metabólico: houve aumento de expressão em transposons e profagos, além de indutores de mutagênese e vias de reparo; por outro lado, mobilidade, crescimento celular e quase todos os fatores de virulência foram reprimidos. Dois profagos induzidos durante essa resposta, possivelmente proporcionam algumas proteínas de funções importantes. Nós também avaliamos a presença de genes envolvidos no reparo de DNA em três espécies de leptospira: L. biflexa, L. interrogans e L. borgpetersenii. L. interrogans é a espécie com maior diversidade e redundância de genes de reparo. Além disso, transferência horizontal parece ser um importante fornecedor de funções de reparo nesse gênero. Leptospiras também apresentam genes característicos tanto de bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas. Genes representando diferentes vias de reparo foram induzidos durante infecção em modelo animal, sugerindo que essas vias estão ativas no curso da doença. Todos esses dados, em conjunto, sugerem que elementos genéticos móveis são de extrema importância na evolução do gênero e das vias de reparo. Assim, durante a resposta a danos no DNA, diversos mecanismos dependentes e independentes de SOS são empregados para frear o crescimento celular e virulência em favor da indução controlada de mecanismos para aumentar variabilidade genética.

Orientador: Gonçalo A. Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T02:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiburcio_RicardoAugusto_D.pdf: 13957444 bytes, checksum: 5d1ae127f2574323a433b1478aeb3efe (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora é um fungo basidiomiceto hemibiotrófico causador da vassoura de bruxa no cacau (Theobroma cacao L.). Esta doença é caracterizada pela produção de ramos hiperplásicos e hipertróficos e frutas partenogênicos durante a fase biotrófica, seguido por necrose dos tecidos infectados durante a fase necrotrófica. Esta é a principal doença da produção de cacau na América do Sul e no Caribe, tendo causado uma diminuição de mais de 65% na produção no sul da Bahia, a principal região produtora do país. Vários genes relacionados à patogenicidade foram encontrados em M. perniciosa como parte do Projeto Genoma da Vassoura de Bruxa. No entanto, os padrões de evolução destes genes, que poderiam ajudar a compreender a evolução da fitopatogenicidade dessa espécie, ainda não foram estudados. Também não foram estudados as mudanças ocorridas no genoma desta espécie durante a sua evolução. Estas mudanças são particularmente relevantes uma vez que a maioria das espécies estreitamente relacionadas com M. perniciosa não é fitopatogênica. Desta forma a compreensão da evolução deste modo de vida na espécie poderia ajudar a entender a evolução de fungos fitopatógenos em geral. Este trabalho tem como objetivo ampliar o conhecimento sobre o surgimento da patogenicidade em M. perniciosa analisando a evolução dos genes potencialmente relacionados a ela, aumentando assim o conhecimento sobre a vassoura de bruxa e ajudando na busca por uma maneira de controlar a doença. Para isso, foram estudados os padrões de evolução de diversos genes ligados ao processo de necrose característica da vassoura de bruxa e genes candidatos a terem sido obtidas por transferência horizontal de genes (HGT). Os resultados indicam que a evolução da patogenicidade em M. perniciosa envolveu tanto à aquisição de novos genes quanto a utilização para novas funções de outros já presentes nos ancestrais saprotróficos. Em particular, a busca de genes horizontalmente transferidos encontrou dois genes potencialmente envolvidos na doença que ainda não tinham sido estudados, sugerindo que a análise evolutiva a nível genômico é um instrumento relevante para a escolha de genes candidatos para análises em bancada. / Abstract: Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora is a hemibiotrophic basidiomycete fungus that causes witches' broom disease in cocoa (Theobroma cacao L.). This disease is characterized by the production of hyperplasic and hypertrophic stems and parthenogenetic fruits during biotrophic life-phasee, followed by necrosis of infected tissues during necrotrophic life-phase. This is the main disease affecting the cocoa production in South America and the Caribbean, causing a decrease of more than 65% in the production in southern Bahia, the main producing region. Several genes related to pathogenicity were found in M. perniciosa as part of the Witches' Broom Genome Project. However the patterns of evolution of these genes, that could help to understand the evolution of plant pathogenicity in this species, were not yet studied. Also the changes occurred in this species at a genomic level during its evolution were not studied. These changes are particularly relevant since the majority of species closely related to M. perniciosa is not phytopathogenic and so the understanding of this evolution would help to understand the evolution of plant pathogens in general. This work attempts to increase the knowledge about the emergence of pathogenicity in M. perniciosa studding the evolution of genes potentially related to it, therefore increasing the knowledge about the witches' broom and helping in the search for a way to control the disease. To do that, it were studied the evolutionary patterns of several genes related with the necrosis process characteristic of witches' broom and genes candidate to have been obtained by horizontal gene transfer (HGT). These later were detected by a genome level screening. The results indicate that the evolution of plant pathogenicity in M. perniciosa involved both the acquisition of new genes and the use of genes already present in the saprotrophic ancestral in new functions. In particular, the search for horizontally transferred genes found two genes potentially involved in the disease which were not yet studied, suggesting that the evolutionary analysis at the genomic level is a relevant tool to the choice of genes candidate to laboratory analysis. / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O gênero Phytomonas está associado a enfermidades devastadoras em plantações de interesse econômico, enquanto que outros vegetais parasitados não apresentam nenhum dano aparente. A seqüência-consenso de um agrupamento de ESTs de P. serpens determinado anteriormente apresentou alta similaridade com indolpiruvato descarboxilases (IPDCs) de fitobactérias e putativas piruvato/indolpiruvato descarboxilases de Leishmania spp. A enzima IPDC está na via de biossíntese do ácido 3-indolil acético, um dos hormônios vegetais mais importantes. Verificamos que o gene IPDC está presente em diversos isolados de Phytomonas, em múltiplas cópias (cerca de 104 cópias em P. serpens e 200 cópias em P. françai), contíguas e concentradas em uma banda cromossômica. Análises filogenéticas e amplificações por PCR com oligonucleotídeos degenerados apontam o clado Phytomonas-Leishmania como grupo-irmão de IPDCs de fitobactérias, sugerindo um processo de transferência horizontal anterior à separação dos tripanossomatídeos do clado que também inclui Leptomonas, Herpetomonas e Crithidia. / The genus Phytomonas is associated to devastating diseases in commercially important crops, whereas in other plant species no apparent damage is observed. The consensus sequence of one group of ESTs of P. serpens previously determined showed high similarity with indolepyruvate decarboxylases (IPDCs) from phytobacteria and putative pyruvate/indolepyruvate decarboxylases of Leishmania spp. The enzyme ipdC participates in the biosynthetic pathway of the indole-3-acetic acid, one of the most important plant hormones. We found that the IPDC gene is present in several Phytomonas isolates, in multiple copies (about 104 copies in P. serpens and 200 copies in P. françai, in tandem and concentrated in one chromosomal band. The phylogenetic analyses and data of PCR amplifications with degenerated primers point the clade Phytomonas-Leishmania as a sister group of IPDCs of phytobacteria, suggesting a process of horizontal gene transfer prior to the separation of the trypanosomatid clade that also includes Leptomonas, Phytomonas, Herpetomonas, Leishmania and Crithidia.

Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (“Open Reading Frame”, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes “core” que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained

Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (“Open Reading Frame”, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes “core” que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained