O presente trabalho teve como principal objetivo obter plantas transgênicas, dos cultivares porta-enxerto limão \'Cravo\' e laranja azeda e de cultivares copa de laranja doce, expressando genes que possam influenciar no nível de resistência ao vírus da tristeza dos citros (CTV) e, possivelmente à morte súbita dos citros. Buscou-se ainda estudar a organogênese in vitro de espécies cítricas. Experimentos para a indução da organogênese in vitro foram realizados a partir de segmentos de epicótilos de plântulas germinadas in vitro de espécies cítricas avaliando-se: a resposta organogênica de três diferentes regiões do epicótilo, na presença (1,0 mg.L-1) ou ausência de BAP, em meio MT, e a regeneração em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) adicionadas ao meio MT. Também avaliou-se a regeneração de segmentos internodais de limão ?Cravo? e laranja azeda em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) em meio MT; e de laranja azeda em meio de cultura MT e DBA3, suplementados com diferentes concentrações de BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) e ANA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). Foi utilizado o método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando-se tecido juvenil coletado de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais) como explantes. Utilizou-se a estirpe EHA105 de A. tumefaciens, contendo os plasmídeos: a) pCTV-CP: contendo o gene da capa protéica do CTV; b) pCTV-dsCP: contendo repetições invertidas do gene da capa protéica do CTV, interligadas pelo intron do gene da quitinase de citros; c) pCTVcons: contendo uma seqüência conservada antisense do CTV. As construções gênicas foram elaboradas a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e o terminador NOS. Foram utilizados também os genes de seleção nptII e o repórter GUS. As gemas adventícias desenvolvidas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e por PCR e a confirmação da transformação genética foi feita por Southern Blot. A expressão da proteína do CTV foi verificada pelo teste serológico de PTA-ELISA. A resposta morfogênica em função da região do epicótilo e das concentrações da citocinina BAP é dependente do cultivar de citros. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP proporcionou um maior número de gemas adventícias regeneradas por explante, tanto em segmentos de epicótilo como em segmentos internodais dos cultivares de citros estudados. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP é essencial na regeneração de gemas adventícias em segmentos internodais de laranja azeda. Foi possível regenerar plantas transgênicas, pelo protocolo de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens de limão \'Cravo\' contendo o gene da capa protéica do vírus da tristeza dos citros (pCTV-CP) utilizando-se segmentos de epicótilo e segmentos internodais como fonte de explante, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos internodias; e de laranja \'Hamlin\' contendo o gene da capa protéica do CTV, com as construções gênicas pCTV-dsCP e pCTV-CP, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos de epicótilo como fonte de explante. / The objective of the present work was to obtain transgenic plants of rootstocks Rangpur lime and sour orange as well as sweet orange scion varieties, expressing genes that would possibly influence the levels of resistance to the Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death disease. The in vitro organogenesis of Citrus species was also studied. In vitro organogenesis experiments were conducted with epicotyl segments obtained from in vitro germinated seedlings of different Citrus species in order to evaluate: organogenic response of three epicotyl regions, in the presence (1,0 mg.L-1) or absence of BAP, in MT medium, and the regeneration using different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) added to MT medium. The regeneration of internodal segments of Rangpur lime and sour orange was evaluated in MT medium with different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) as well as sour orange regeneration in MT and DBA3 mediums, supplemented with different concentrations of BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) and NAA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). The Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation method of juvenile tissue obtained from in vitro (epicotyls) or green house cultivated plants (internodal segments) was used in this work. The EHA 105 strain was used with the following plasmids: a) pCTV-CP: containing the coat protein gene from CTV; b) pCTV-dsCP: containing inverted repeats of the coat protein gene from CTV interconnected by the Citrus quitinase gene intron; c) pCTVcons: containing an antisense sequence of CTV untranslated region. The gene constructs were built from the pCAMBIA 2201 plasmid, and contained the 35S promoter and the NOS terminator. The nptII selection gene and the GUS reporter gene were also used. The adventitious buds developed were identified as transgenic by GUS histochemical test and PCR, these results were later confirmed by Southern Blot. The transgenic coat protein expression was detected by the serological test PTA-ELISA. The morphogenic response related to the epicotyl region and BAP cytokinin were dependent on the Citrus varieties. The addition of BAP cytokinin to the culture medium showed a greater number of adventitious buds regenerated per explant in both epicotyl and internodal segments of the Citrus varieties studied. The addition of BAP to the culture medium is essential for the regeneration of adventitious buds in sour orange internodal segments. Using the Agrobacterium mediated genetic transformation protocol it was possible to regenerate transgenic plants of different varieties and gene constructs: Rangpur lime containing the coat protein gene of CTV (pCTV-CP) using epicotyl and internodal segments as explant source, and an antisense sequence of CTV untranslated region using internodal segments as explant source; Hamlin sweet orange containing the coat protein gene of CTV in constructions pCTV-CP and pCTV-dsCP, and an antisense sequence of CTV untranslated region using epicotyl segments as explant source.

A hibridação somática é uma nova opção em programas de melhoramento de espécies cítricas, obtendo-se híbridos somáticos que podem manter integralmente a combinação genética de ambos os progenitores envolvidos na hibridação. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a propagação e crescimento de combinações parentais de híbridos somáticos com potencial para serem utilizados como porta-enxertos e verificar possíveis resistências/tolerâncias à infecção de tronco e raízes por Phytophthora nicotianae e ao vírus da tristeza dos citros (CTV). Os híbridos somáticos utilizados nos trabalhos foram: limão 'Cravo' + laranja azeda, laranja 'Caipira' + limão 'Cravo', laranja 'Caipira' + tangerina 'Cleópatra', laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano', laranja 'Caipira' + limão 'Rugoso', tangerina 'Cleópatra' + limão 'Volkameriano', tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda, limão 'Cravo' + tangerina 'Sunki', laranja 'Ruby Blood' + limão 'Volkameriano', laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Valência' + Fortunella obovata. Na propagação dos híbridos, estacas de 15 cm de comprimento foram retiradas de plantas matrizes dos respectivos híbridos somáticos e submetidas ao enraizamento em câmara de nebulização intermitente por 100 dias. Posteriormente, foram analisadas o sistema radicular das estacas e parte aérea. Em seguida, foram transplantadas para sacos plásticos, conduzidas em haste única e mantidas em casa-de-vegetação por 210 dias, realizando-se avaliações mensais em relação à parte aérea e ao final avaliações do sistema radicular. Para os ensaios de infecção por Phytophthora nicotianae e CTV, foram utilizadas mudas dos respectivos híbridos somáticos oriundos de estacas e ainda a inclusão de plantas testemunhas. Para os testes de resistência/tolerância a P. nicotianae, utilizou-se o método da agulha para o teste de infecção de tronco, sendo as lesões quantificadas após 25 dias da inoculação. Para o teste de podridão das raízes e radicelas, o substrato foi infectado com estruturas do patógeno, sendo analisados a parte aérea das plantas quinzenalmente e o sistema radicular após 60 dias da instalação do ensaio. Para o teste de tolerância dos híbridos somáticos ao CTV, adotou-se o método de união dos tecidos (enxertia), analisando-se a parte aérea das plantas mensalmente em três avaliações. No enraizamento das estacas, os híbridos laranja 'Caipira' + tangerina 'Cleópatra', laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano', limão 'Cravo' + tangerina 'Sunki' e laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' apresentaram melhores resultados, sendo que os híbridos laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' se destacaram em relação ao desenvolvimento das estacas após o tranplantio. Os híbridos somáticos tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda, limão 'Cravo' + tangerina 'Sunki', tangerina 'Cleópatra' + limão 'Volkameriano', laranja 'Ruby Blood' + limão 'Volkameriano', laranja 'Rohde Red' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano' apresentaram bons resultados em relação à redução da podridão do tronco e os híbridos somáticos tangerina 'Cleópatra' + limão 'Volkameriano', tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda, laranja 'Caipira' + limão 'Volkameriano' e laranja 'Caipira' + limão 'Cravo' apresentaram tolerância a podridão das raízes e radicelas ocasionado por P. nicotianae. Os híbridos tangerina 'Cleópatra' + laranja azeda e laranja 'Valência' + Fortunella obovata apresentaram intolerância ao vírus da tristeza dos citros. / Somatic hybridization is a new alternative in citric species breeding, yielding somatic hybrids which may integrally keep the genetic combination of both progenitors involved in the hybridization. Thus, the objective of this work was to study the propagation and growth of somatic hybrids parental combinations with potential to be used as rootstock and to verify possible resistance/tolerance to trunk and roots infection by Phytophthora nicotianae and citrus tristeza virus (CTV). This work applied the following somatic hybrids: 'Cravo' lemon + sour orange, 'Caipira' orange + 'Cravo' lemon, 'Caipira' orange + 'Cleopatra' tangerine, 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Caipira' orange + 'Rough' lemon, 'Cleopatra' tangerine + 'Volkamerian' lemon, 'Cleopatra' tangerine + sour orange, 'Cravo' lemon + 'Sunki' tangerine, 'Ruby Blood' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Valência' orange + Fortunella obovata. In hybrids propagation, stem cuttings of approximately 15 cm length were excised from matrix plants of respective somatic hybrids and submmited to rooting in intermitent nebulization chamber for 100 days. Later, the stem cuttings root system and air part were analyzed. In sequence, they were transplanted to plastic bags, conduced in only one hast and kept in greenhouse during 210 days, when monthly evaluations were performed concerning the air part and, in the end, root system evaluations. For the Phytophthora nicotianae and CTV infection essays, plants derived from the respective somatic hybrids originated from stem cuttings were used, as well as control plants. For the resistance/tolerance to P. nicotianae analysis, the needle method for the trunk infection test was applied, being the lesions quantified after 25 days post-inoculation. For the roots and radicels flashening test, substrate was infected with pathogen structures and the air part of the plants was analyzed at every 15 days; roots were analyzed 60 days after the essay implementation. To evaluate the somatic hybrids tolerance to CTV, it was adopted the method of tissues union (grafting), where the air part of the plants was analyzed once a month in three evaluations. On the stem cuttings rooting, the hybrids of 'Caipira' orange + 'Cleopatra' tangerine, 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Cravo' lemon + 'Sunki' tangerine and 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon presented the best results, with the hybrids of 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon being the top concerning the stem cuttings development after transplanting. The somatic hybrids of 'Cleopatra' tangerine + sour orange, 'Cravo' lemon + 'Sunki' tangerine, 'Cleopatra' tangerine + 'Volkamerian' lemon, 'Ruby Blood' orange + 'Volkamerian' lemon, 'Rohde Red' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon showed good results related to reducing the trunk flashening, and the somatic hybrids of 'Cleopatra' tangerine + 'Volkamerian' lemon, 'Cleopatra' tangerine + sour orange, 'Caipira' orange + 'Volkamerian' lemon and 'Caipira' orange + 'Cravo' lemon presented tolerance to roots and radicels flashening caused by P. nicotianae. The hybrids of 'Cleopatra' tangerine + sour orange and 'Valência' orange + Fortunella obovata showed to be intolerant to citrus tristeza virus.