Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas es producida por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, que presenta tres estados morfológicos en su ciclo biológico: amastigote, tripomastigote y epimastigote. Aproximadamente 25 millones de personas en América latina, son afectadas por este parásito. El tratamiento clínico actual se hace con las drogas antichagásicas nifurtimox y benznidazol, que actúan mediante la formación de radicales libres y/o intermediarios electrofílicos durante su metabolismo. Al respecto, el glutatión (GSH) y derivado bis-glutationil-espermidina (tripanotión, T(SH)2) son los principales agentes antiradicalarios con los que cuenta el parásito. Previamente se ha reportado que la susceptibilidad del T. cruzi a la acción de ambas drogas depende del contenido de glutatión libre y conjugado. L-Butionina (S, R) Sulfoximina (BSO) es un inhibidor de la enzima γ-glutamilcisteína sintetasa (γ-GCS), etapa limitante en la síntesis de glutatión y por tanto puede hacer más susceptible al parásito al efecto de nifurtimox y benznidazol. En esta Memoria se estudió el efecto de nifurtimox y benznidazol con o sin BSO, en un modelo in vitro de infección con T. cruzi usando células VERO como hospedero. En este modelo, BSO 25 μM disminuyó el IC50 de nifurtimox y benznidazol (concentración necesaria para disminuir en un 50% el número de amastigotes por cien células VERO o índice endocítico) en cerca del 60%. Estos resultados indican que BSO es capaz de aumentar el efecto tripanocida de las drogas antichagásicas nifurtimox y benznidazol, sobre la forma amastigota de T. cruzi, en todas las cepas estudiadas. Por otra parte, también se estudió el efecto de nifurtimox y benznidazol y su asociación con BSO en un modelo in vivo. Los resultados indican que al usar sólo BSO se obtiene un 100% de sobrevida de los ratones infectados con la cepa Tulahuén de T. cruzi y además, disminuye las parasitemias a niveles indectables más rápidamente de lo que ocurre en el grupo control. Actualmente no se han desarrollado drogas más efectivas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Este estudio sugiere que el uso de BSO en combinación con nifurtimox o benznidazol podría disminuir las dosis clínicas de ambas drogas para obtener resultados similares, o bien acortar la duración del tratamiento, incidiendo posiblemente en una menor tasa de aparición de RAM producidas por estos fármacos / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 1020095

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Se realizó la infección de un grupo de ratones hembras enteras de la cepa BALB/c y de otro grupo de hembras ovariectomizadas con 2000 tripomastigotes sanguíneos del clon Dm28c de Trypanosoma cruzi. Los resultados obtenidos mostraron que el modelo de infección provocó 100% de mortalidad en hembras ovariectomizadas y sólo un 50% en el grupo de hembras enteras transcurridos 90 días post-infección. El nivel máximo de parasitemia se detectó en el grupo de hembras enteras y fue de 2,6 x 105 parásitos/mL, a su vez, el grupo de hembras ovariectomizadas presentó una parasitemia máxima de 1,8 x 105 parásitos/mL. En el estudio histopatológico de corazón y músculo esquelético, en relación a lesiones y número de pseudoquistes, ambos grupos presentaron alteraciones más marcadas en músculo esquelético pero en general las hembras ovariectomizadas presentaron lesiones inflamatorias más graves, mayor daño tisular y la presencia de un mayor número de pseudoquistes. Las diferencias observadas, en cuanto a la mortalidad e intensidad de daño, en los tejidos indicaría que la presencia o ausencia de hormonas ováricas sería un factor importante en la evolución de la infección con T. cruzi, que se ha postulado previamente las diferencias en la susceptibilidad a la infección entre machos y hembras estaría asociada a los niveles de estrógenos, hormona que cumple un importante rol en la regulación del sistema inmune, y actuaría también como un factor clave en la supervivencia de las hembras normales

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Trypanosoma cruzi, es un parásito protozoo, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, patología endémica en Latino América. La transmisión de esta enfermedad es producida por un insecto vector triatomino que, luego de alimentarse de la sangre de un mamífero, deposita sus deyecciones con las formas infectivas del parásito (tripomastigotes) las que ingresan al torrente sanguíneo a través de la lesión cutánea generada por el insecto. Una vez dentro, el parásito invade macrófagos y se divide al adoptar la forma amastigote. Luego de replicarse, los amastigotes retoman nuevamente la forma de tripomastigotes, se liberan del macrófago y por vía sanguínea o linfática invaden corazón, ganglios y otros tejidos. Las drogas usadas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son efectivas durante la fase aguda de la infección; sin embargo, su efectividad es sólo parcial en la enfermedad crónica y generan diversos efectos secundarios. Para establecer una infección crónica, algunos parásitos resisten el estrés oxidativo y reparan el daño al DNA, generado por especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno (ROS/RNS) producidas por las células del sistema inmune del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaría con la capacidad de reparación del DNA, donde la vía de reparación por escisión de bases (BER) juega un rol fundamental. En el inicio de esta vía participan DNA glicosidasas que reconocen bases nucleotídicas alteradas en el DNA, catalizando la hidrólisis del enlace N-glicosídico, originando un sitio abásico apurínico/apirimidínico. En esta memoria de título se determinó el efecto de la sobreexpresión de las DNA glicosidasas TcNTH1 and TcOGG1 en epimastigotes expuestos a estrés oxidativo. Se crearon dos líneas de epimastigotes de T. cruzi recombinantes para las glicosilasas TcNTH1 y TcOGG1 A diferencia de lo descrito para enzimas ortólogas de humanos, ambas DNA glicosidasas fueron localizadas principalmente en el núcleo del parásito. Por otra parte, no se evidenciaron diferencias significativas en la viabilidad de epimastigotes transfectados y controles expuestos a peróxido de hidrogeno. Nuestros resultados confirman la presencia de la vía BER en T. cruzi. Como ha sido observado en estudios realizados en células de otros organismos eucariontes, la sobrexpresión de DNA glidosidasas no incrementa la viabilidad celular frente a agentes oxidantes. En un futuro cercano se espera purificar y caracterizar ambas DNA glicosidasas, así como estudiar la viabilidad de tripomastigotes transfectados / - FONDECYT 1090124 - FONDECYT 11100053 - Proyecto - Bicentenario Anillo ACT 112

Proyecto de Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Debido a la gran importancia eco-epidemiológica y clínica de los linajes de Trypanosoma cruzi, en este estudio se analizaron 229 muestras de Triatoma infestans (56,3%) y Mepraia spinolai (43,7%) silvestres infectados por este protozoo, provenientes de seis localidades de la zona endémica de Chile. Se utilizó la técnica de DNA blot, para la detección de la región hipervariable de los minicírculos del kDNA a través de sondas específicas marcadas para los linajes TcI, TcII, TcV y TcVI. TcI resultó el linaje más abundante en ambas especies de triatominos y en la mayoría de las localidades, seguido de TcII. El linaje TcV se detectó exclusivamente en T. infestans de la localidad de Calera de Tango. Además, se observó una mayor cantidad y tipos de infecciones mixtas en esta última especie, asociado a un índice de diversidad de Shannon Weaver significativamente mayor. Finalmente, también se encontraron diferencias significativas en la proporción de los linajes TcI, TcV y TcVI según estación del año, siendo todos más frecuentes en verano. Este estudio es la primera descripción de los linajes de T. cruzi circulando en las localidades de El Maqui, El Sobrante y El Atajo. Además muestra por primera vez una mayor diversidad de linajes y proporción de infecciones mixtas en T. infestans por sobre M. spinolai, y se analizan sus posibles causas e impactos. / Fondecyt 1100339 y 1120122

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas constituye un problema de salud pública en el continente americano. De acuerdo a la OMS existirían 18.000.000 personas con esta parasitosis. Brasil con 5.000.000 y Argentina con 2.200.000 infectados, son los países más afectados. En Chile se estiman que existen actualmente 200.000 chagásicos crónicos. Existen características clínicas regionales de la Enfermedad de Chagas, siendo la cardiopatía y las megaformaciones las principales manifestaciones en la etapa crónica. El diagnóstico es abordado desde el punto de vista clínico-epidemiológico y se orienta en función de la etapa de la infección. En los casos agudos, debido a la elevada parasitemia, los métodos de elección son parasitológicos y en la etapa crónica, por las fluctuantes y bajas parasitemias, la detección de T. cruzi es más compleja. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en sangre periférica de individuos chagásicos, ha permitido aumentar la sensibilidad diagnóstica. Recientemente, se ha aplicado PCR en deyecciones de triatominos alimentados mediante xenodiagnóstico (XD) en chagásicos crónicos sometidos a tratamiento quimioterapéutico. Con el fin de conocer la sensibilidad y precocidad de la detección de kDNA de T. cruzi en deyecciones de triatominos alimentados mediante XD en pacientes con enfermedad de Chagas crónica, a 25 infectados con XD (+) (Grupo I) y 25 infectados con XD (-) (Grupo II), se aplicó PCR al pool de deyecciones de triatominos incubados durante 30, 60 y 90 días. En todos los casos con XD (+) se detectó la banda específica de 330 pb. Mientras a los 60 días el XD era positivo en el 84% de los casos, PCR tuvo un 100% de positividad. En el Grupo II, de chagásicos con XD (-) a los 30, 60 y 90 días, 9 casos (36%) tuvieron PCR positivo. Los resultados permiten concluir que PCR aplicado en deyecciones de triatominos es una herramienta más precoz para detectar T. cruzi que el XD, ya que a los 30 días, XD y PCR tienen un 44% y un 92% de positividad, respectivamente. El 100% de los casos es pesquisado mediante PCR a los 60 días, mientras que el XD necesita 90 días para obtener el mismo resultado. El XD actúa como un medio de cultivo biológico para amplificar T. cruzi, lo que permite aplicar PCR en las deyecciones, por esta razón, ambas técnicas son complementarias / Financiamiento: Proyectos DI SAL 03/06-2 y Fondecyt 1040731

Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita. / Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.

No presente trabalho verificamos o papel dos Leucotrienos na modulação da resposta imune durante a fase aguda da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi, usando como modelo camundongos deficientes da enzima 5-lipoxigenase (5-LOko). Os nossos dados demonstram que camundongos infectados pelo T. cruzi produzem metabólitos do ácido aracdônico como PGE2, LTB4 e LTC4. Comparados aos animais controles, os animais 5-LOko apresenta parasitemia mais tardia e menor, tem menor parasitismo tissular, menor infiltrado de células inflamatórias no coração e musculatura esquelética e apresenta menor taxa de mortalidade durante a fase aguda, indicando que animais deficientes de leucotrienos são mais resistentes a infecção pelo parasito. Animais 5-LOko está relacionado com a manutenção de números elevados de células F4/80+ e redução de células CD11b+ durante a infecção e menor número de células T ativadas expressando os marcadores CD4+CD69+, CD4+CD25+, CD4+CD44+ e CD8+CD69+, números inalterados de células T regulatórias CD4+CD25+GITR+ e menor produção de anticorpos parasito-específicos do isotipo IgG2a. O controle eficiente de parasitas por animais 5-LOko está associado ao aumento de células Gr-1+ e CD11c+GR-1+, produção aumentada IL-12, IFN-g, e produzirem menos PGE2, IL-10, ao contrario, animais controles, incapazes de controlar parasitas circulantes, produzem mais PGE2 e IL-10 e menos IL-12 e IFN-g. A baixa mortalidade de animais 5-LOko correlaciona com a produção de PGE2 e IL-10, produzir muita IL-12 e menos IFN-g e NO e baixíssima parasitemia. A mortalidade maior de animais controles envolve a produção IFN-g e altos níveis de LTB4, LTC4, NO e ausência de IL-10, IL-1b, PGE2 e números elevados de parasitas circulantes. Ainda macrófagos de animais 5-LOko apresentam maior capacidade de adesão/internalização de tripomastigotas e alta atividade tripanocida por mecanismo independente da geração de NO. Estes dados em conjunto demonstram que mediadores lipídicos produzidos pela enzima 5-lipoxigenase como LTB4 e LTC4 modulam negativamente a capacidade dos camundongos para geração de uma resposta imune capaz de controlar os parasitos durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi. / Accumulating studies have indicated that 5-lipoxigenase (5-LO) converted lipid mediators as leukotrienes acts modulating the host immune response against infectious diseases. The precise role of leukotrienes during the protozoan infection is unknown. In this work we evaluate the role of leukotrienes during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection using as model the 5-lypoxigenase deficient mice (5-LOko). Our results show that PGE2, LTB4 and LTC4 are produced during the Trypanosoma cruzi infection. 5-LOko infected mice are more resistant than control mice as judge by the lower parasitemia, decreased number of parasite nest and inflammatory cells in the heart and skeletal muscle and low rate of mortality. The resistance of 5-LOko mice is associated with the increased capacity of spleen cells to produce cytokines as IL-12 and IFN-g; sustained capacity to produce detectable levels of IL-10 and PGEe and low NO serum levels than control mice. In contrast, the wild type mice are extremely susceptible and are unable to control parasites efficiently. The susceptibility is associated with increased levels of IL-10 and PGE2 and low IL-12 and IFN-g production. The high mortality rate in wild type mice is related with high LTB4, LTC4 and NO levels and bias to produce only type 1 cytokines. Also we shown that resistant 5-LOko mice present increased number of spleen cells expressing GR-1+, GR-1+CD11c+, F4/80+ and lower numbers o spleen cells expressing CD4+CD69+, CD4+CD25+, CD4+CD44+, CD8+CD69+ and CD11b+ and low serum levels of parasite-specific IgG2a than wild type mice and do not present alteration in TREG expressing CD4+CD25+GITR+. Importantly, IFN-g and- LPS activated macrophage from 5-LOko mice but not from wild type mice, present high capacity to recognize typomastigotes, internalize them and strong capacity to kill intracellular parasite as NO independent pathway. The results implicate that high levels leukotrienes, NO and pure type 1 cytokines production is associated to susceptibility to parasite. In contrast, leukotrienes deficiency led to an balanced immune response with relative high levels of type 1 cytokines and relative low levels of NO, type 2 cytokines and PGE2 that efficiently control the parasites. Also indicate that 5-lipoxigenase converted lipid mediators contribute negatively to generation of an effective immune response during the acute phase of T. cruzi infection.

Doctor en Bioquímica / El cáncer, una de las causas más frecuentes de muerte en el mundo, es un gran desafío para el desarrollo de terapias específicas anti-tumores o de sus metástasis. Ya sea la inmunoterapia anti-tumoral ó la terapia anti-angiogénica, son estrategias con un muy buen potencial en la lucha contra el cáncer. La primera busca activar la respuesta de linfocitos T tumor-específicos, mientras que la segunda bloquea o retarda el crecimiento del tumor al interferir con el abastecimiento adecuado de nutrientes y oxígeno y con la remoción de productos catabólicos tóxicos. La inmunoterapia requiere de la identificación de Antígenos Asociados Tumores (TAA) que se expresen preferencialmente en tejidos con alto nivel proliferativo, como los tumores. Un TAA adecuado para este tipo de terapia debe ser esencial para la mantención de la viabilidad del tumor y ser blanco de linfocitos T citotóxicos. Survivina (Surv), cumple con estos requisitos. Por otra parte, en vertebrados, Calreticulina (CRT), proteína altamente pleiotrópica, además de su participación en procesos de presentación antigénica en células presentadoras de antígeno (APCs), puede translocarse a la membrana externa e interactuar con C1 del complemento. A pesar de la enorme distancia evolutiva entre el Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, y los mamíferos, CRT del parásito (TcCRT) comparte una gran cantidad de características estructurales y funcionales con sus homólogos vertebrados. Recientemente, hemos propuesto que el efecto anti-neoplásico asociado a la infección por T. cruzi, se debería, al menos parcialmente, a la capacidad anti-angiogénica de TcCRT, al interactuar con células endoteliales, interfiriendo con su multiplicación, movilidad y capacidad morfogénica capilar. En estas actividades, la proteína parasitaria es más efectiva que su contraparte humana. Por estas razones, nuestra Hipótesis de Trabajo propuso que, la inmunización genética con Surv y la administración concomitante de TcCRT, genera una actividad anti-tumoral mayor que con solo uno de estos productos. Los principales resultados obtenidos señalan que: i) De acuerdo a lo esperado, rTcCRT no afecta la proliferación in vitro de células de un melanoma murino B16-F10, ii) la inmunización genética con pSurv, en conjunto con rTcCRT (ó su dominio R), retrasa el crecimiento del tumor, iii) aumentando la sobrevida de los animales tratados. iv) El tratamiento combinado pSurv-rTcCRT inhibe la angiogénesis tumoral. v) rTcCRT se une a los melanocitos, promueve la incorporación de C1q humano y la fagocitosis macrofágica y, vi) La combinación de la inmunización con pSurv y pSec-Surv, más la inoculación i.v. con rTcCRT, inhibe sinérgicamente la metástasis pulmonar. Es probable que una secuencia de eventos se desencadene primariamente por la actividad anti-angiogénica de TcCRT, en el tumor, generando una respuesta al estrés derivado, siendo translocada CRT de la célula tumoral a la membrana externa, donde captura C1, evento que promueve la fagocitosis de la célula tumoral, por parte de las APCs. La presentación de péptidos derivados de antígenos TAA debiera ocurrir (Surv incluida), con la consiguiente inducción de actividad inmune anti-tumor. Independientemente, Surv podría también mediar actividad inmune anti-células endoteliales. En consecuencia, el retardo en el crecimiento tumoral y aumento en la sobrevida de los animales tratados con pSurv-rTcCRT se debería a la combinación de efectos sobre distintos blancos moleculares, colaborando y potenciando el efecto final. / Cancer, the most frequent cause of death worldwide, is a great challenge for the development of specific anti-tumor and metastasis treatment. Either immune anti-tumor or anti-angiogenic therapies, are potentially promising in the struggle against cancer. Immune therapy seeks to activate the response of antigen-specific T lymphocytes, thus allowing selective elimination of tumor cells, while anti-angiogenesis blocks or delays tumor growth by interfering with nutrient or oxygen supply and with the removal of catabolic toxic products. Immune therapy for cancer treatment requires the identification of Tumor Associated Antigens (TAA), specifically expressed in tissues with high proliferative levels, such as tumors. A TAA useful for this therapy must be essential for tumor liability and also serve as a target for cytotoxic T lymphocytes. Survivin (Surv), fulfills these requirements. On the other hand, in vertebrates, Calreticulin (CRT), a highly pleiotropic protein, besides its participation in antigen presenting cells (APCs), can translocate to the external membrane and interact with complement C1. In spite of the great evolutionary distance between Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas´ disease, and mammals, parasite CRT (TcCRT) shares many structural and functional properties with its vertebrate counterparts. Recently, we have proposed that the anti-tumor effect associated to T. cruzi infection is at least partially due to the TcCRT anti-angiogenic capacity. Thus, upon interacting with endothelial cells, TcCRT interferes with their multiplication, mobility and capacity to generate capillaries. In all these activities, the parasite protein is more effective than its human counterpart. For these reasons, the Working Hypothesis proposes that genetic immunization with Surv and concomitant TcCRT administration, generates a greater anti-tumor activity than each of these products, administered separately. The principal results obtained indicate that: i) As expected, while rTcCRT does not affect the in vitro proliferation of B16-F10 tumor cells, ii) genetic immunization with pSurv, together with rTcCRT (or its R domain), slows the growth of the B16-F10 murine melanoma iii) increasing survival of treated animal. iv) pSurv-rTcCRT treatment inhibits tumor angiogenesis. v) rTcCRT binds to B16-F10 melanocytes, promotes the incorporation of human C1q and consequent macrophage phagocytosis and, vi) The combination of immunization with pSurv and pSecSurv plus rTcCRT i.v. inoculation, synergistically inhibits lung metastasis. Perhaps, a sequence of events is primarily unleashed by the TcCRT anti-angiogenic activity in the tumor. As a response to derived stress, tumor cell CRT is translocated to the external membrane, where it captures C1, an event that promotes tumor phagocytosis by APCs. TAA-derived antigen presentation (Surv included) should follow, with the induction of anti-tumor immune activity. Independently, Surv could also mediate anti-endothelial cell immune activity. Consequently, the slower tumor growth and increased survival of the animals treated with pSurv-rTcCRT is due to the combined effects on different molecular targets, collaborating and enhancing the overall effect. / Fondap

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-11Bitstream added on 2014-06-13T19:07:43Z : No. of bitstreams: 1 kohatsu_aan_me_arafcf.pdf: 1504236 bytes, checksum: 9c5b88c167195f46b5fed183a5266203 (MD5) / No momento há apenas dois fármacos disponíveis para o tratamento da doença de Chagas, nifurtimox e benzonidazol, ambos de ações limitadas. Assim, a compreensão dos mecanismos utilizados por T. cruzi para diminuir os efeitos citotóxicos de fármacos e a busca de potenciais moléculas para quimioterapia, bem como os alvos para elas, são de extrema importância. O aumento na produção de certas enzimas do metabolismo oxidativo seria responsável pela resistência das cepas do parasito ao benzonidazol (BZ). Tais enzimas são: triparedoxina peroxidase (mTcTXNPx) que catalisa a redução de peróxidos, superóxido dismutase (mTcSOD) que realiza a dismutação do ânion superóxido e old yellow enzyme (cTcOYE) que está envolvida na redução de substâncias tripanossomicidas, como naftoquinonas e compostos nitroheterocíclicos. Estudos demonstram que a atividade antimalarial da cloroquina foi aumentada com a adição de ferroceno. Neste trabalho, foram avaliadas as diferenças de suscetibilidade entre seis cepas de T. cruzi (Y, Bolívia, SI1, SIGR3, SI8 e QMII) em relação a três estruturas derivadas de diaminas do ferroceno e a expressão das proteínas antioxidativas. A substância AAC09 mostrou maior citotoxicidade, com CI50 de 2,21 μM para a cepa menos resistente (cepa Y) e 15,20 μM (cepa QMII) para a mais resistente, enquanto que para BZ foi 27,28 μM (cepa SI1) e 105,28 μM (cepa SIGR3), respectivamente. Após tratamento, a expressão das enzimas mTcTXNP (25,5 kDa) e cTcOYE (43 kDa) não aumentaram em cepas mais resistentes aos derivados de diaminas do ferroceno e BZ. Por outro lado, somente ocorreu aumento de expressão de mTcTXNPx na cepa Y tratada com BZ. Os resultados obtidos mostraram que cada cepa apresenta distinta suscetibilidade a um agente oxidativo e as cepas mais resistentes não aumentaram a expressão das... / At the moment there are only two drugs available for the treatment of Chagas disease, nifurtimox and benznidazole, both of use restricted. Understanding the mechanisms used by T. cruzi to reduce de cytotoxic effects of drugs and finding potential molecules for chemotherapy, as well as targets for them, are extremely important. Resistance to benznidazole (BZ) in T. cruzi strains may be caused by increased production of enzymes that act on oxidative metabolism. Such enzymes are: tryparedoxin peroxidase (mTcTXNPx), which catalyzes the reduction of peroxides, superoxide dismutase (mTcSOD), which performs the dismutation of superoxide anion and old yellow enzyme (cTcOYE), which is related to the reduction of trypanocidal substances, such as naphthoquinones and nitroheterocyclic compounds. Studies showed that the antimalarial activity of chloroquine was increased with the addition of ferroceno. Herein the susceptibilities in six T. cruzi strains (Y, Bolivia, SI1, SIGR3, SI8 and QMII) were analyzed in relation to three structures of ferrocene diamine derivatives and the expression of antioxidant proteins. The AAC09 substance showed higher cytotoxicity, with IC50 of 2.21 μM for the less resistant strain (Y strain) and 15.20 μM (QMII strain) for more resistant, whereas to BZ was 27.28 μM (strain SI1) and 105.28 μM (SIGR3), respectively. After treatment, the expression of the enzymes mTcTXNP (25.5 kDa) and cTcOYE (43 kDa) did not increase in more resistant strains to ferrocene diamine derivatives and BZ. However, there was increased expression of mTcTXNPx only in the Y strain treated with BZ. The results showed that each strain exhibited different susceptibility to oxidative agent and the most resistant strains did not enhance expression of these enzymes. Based on these findings, probably other mechanisms may be... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: João Aristeu da Rosa / Banca: Maurício Bacci Junior / Resumo: No momento há apenas dois fármacos disponíveis para o tratamento da doença de Chagas, nifurtimox e benzonidazol, ambos de ações limitadas. Assim, a compreensão dos mecanismos utilizados por T. cruzi para diminuir os efeitos citotóxicos de fármacos e a busca de potenciais moléculas para quimioterapia, bem como os alvos para elas, são de extrema importância. O aumento na produção de certas enzimas do metabolismo oxidativo seria responsável pela resistência das cepas do parasito ao benzonidazol (BZ). Tais enzimas são: triparedoxina peroxidase (mTcTXNPx) que catalisa a redução de peróxidos, superóxido dismutase (mTcSOD) que realiza a dismutação do ânion superóxido e old yellow enzyme (cTcOYE) que está envolvida na redução de substâncias tripanossomicidas, como naftoquinonas e compostos nitroheterocíclicos. Estudos demonstram que a atividade antimalarial da cloroquina foi aumentada com a adição de ferroceno. Neste trabalho, foram avaliadas as diferenças de suscetibilidade entre seis cepas de T. cruzi (Y, Bolívia, SI1, SIGR3, SI8 e QMII) em relação a três estruturas derivadas de diaminas do ferroceno e a expressão das proteínas antioxidativas. A substância AAC09 mostrou maior citotoxicidade, com CI50 de 2,21 μM para a cepa menos resistente (cepa Y) e 15,20 μM (cepa QMII) para a mais resistente, enquanto que para BZ foi 27,28 μM (cepa SI1) e 105,28 μM (cepa SIGR3), respectivamente. Após tratamento, a expressão das enzimas mTcTXNP (25,5 kDa) e cTcOYE (43 kDa) não aumentaram em cepas mais resistentes aos derivados de diaminas do ferroceno e BZ. Por outro lado, somente ocorreu aumento de expressão de mTcTXNPx na cepa Y tratada com BZ. Os resultados obtidos mostraram que cada cepa apresenta distinta suscetibilidade a um agente oxidativo e as cepas mais resistentes não aumentaram a expressão das... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: At the moment there are only two drugs available for the treatment of Chagas disease, nifurtimox and benznidazole, both of use restricted. Understanding the mechanisms used by T. cruzi to reduce de cytotoxic effects of drugs and finding potential molecules for chemotherapy, as well as targets for them, are extremely important. Resistance to benznidazole (BZ) in T. cruzi strains may be caused by increased production of enzymes that act on oxidative metabolism. Such enzymes are: tryparedoxin peroxidase (mTcTXNPx), which catalyzes the reduction of peroxides, superoxide dismutase (mTcSOD), which performs the dismutation of superoxide anion and old yellow enzyme (cTcOYE), which is related to the reduction of trypanocidal substances, such as naphthoquinones and nitroheterocyclic compounds. Studies showed that the antimalarial activity of chloroquine was increased with the addition of ferroceno. Herein the susceptibilities in six T. cruzi strains (Y, Bolivia, SI1, SIGR3, SI8 and QMII) were analyzed in relation to three structures of ferrocene diamine derivatives and the expression of antioxidant proteins. The AAC09 substance showed higher cytotoxicity, with IC50 of 2.21 μM for the less resistant strain (Y strain) and 15.20 μM (QMII strain) for more resistant, whereas to BZ was 27.28 μM (strain SI1) and 105.28 μM (SIGR3), respectively. After treatment, the expression of the enzymes mTcTXNP (25.5 kDa) and cTcOYE (43 kDa) did not increase in more resistant strains to ferrocene diamine derivatives and BZ. However, there was increased expression of mTcTXNPx only in the Y strain treated with BZ. The results showed that each strain exhibited different susceptibility to oxidative agent and the most resistant strains did not enhance expression of these enzymes. Based on these findings, probably other mechanisms may be... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre