Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas,Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-24T19:05:26Z No. of bitstreams: 1 2014_RicardoCamargo.pdf: 4754357 bytes, checksum: 6816b37d8d754523a1dc517382a3970b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-04T18:12:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_RicardoCamargo.pdf: 4754357 bytes, checksum: 6816b37d8d754523a1dc517382a3970b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-04T18:12:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_RicardoCamargo.pdf: 4754357 bytes, checksum: 6816b37d8d754523a1dc517382a3970b (MD5) / Ao longo da evolução o Trypanosoma cruzi (agente etiológico da doença de Chagas) desenvolveu estratégias bastante eficientes para evadir-se do sistema imune de seu hospedeiro mamífero. Como consequência, a infecção por este organismo tende a ser crônica, sugerindo que o T. cruzi escapa da vigilância do sistema imune por meio da regulação negativa das vias de processamento de antígenos. Na via de apresentação de antígenos intracelulares MHC de classe I, a grande maioria dos peptídeos antigênicos é gerada pelo proteassoma, um complexo proteico multicatalítico responsável pela degradação de proteínas. Entretanto, sob estimulação com interferon-γ (IFN-γ), as subunidades catalíticas β1, β2 e β5 do proteassoma constitutivo são substituídas pelas subunidades β1i/LMP2, β2i/MECL-1 e β5i/LMP7, formando o imunoproteassoma. O imunoproteassoma tem a sua atividade proteolítica modificada e especializada na geração de peptídeos apresentados pelas moléculas de MHC de classe I. Nesse cenário, nós avaliamos se a expressão e a atividade do proteassoma constitutivo, do imunoproteassoma e também de outros componentes da via de MHC classe I são alteradas pela infecção com T. cruzi em linhagem de célula não imune. Em análises por RT-PCR e géis bidimensionais, foi demonstrado que a expressão e a composição do proteassoma constitutivo não são afetadas pelo parasita. Em contraste, nós mostramos que a biossíntese das subunidades do imunoproteassoma β1i, β2i, β5i, de PA28β, de TAP1 e da molécula de MHC de classe I foi inibida em culturas de células infectadas e tratadas com IFN-γ. Nessas culturas, as atividades proteolíticas do proteassoma também foram drasticamente reduzidas. Em experimentos de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência, nós constatamos que a infecção com T. cruzi reduz a densidade de moléculas de MHC de classe I na superfície da célula hospedeira. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que o protozoário Trypanosoma cruzi é capaz de modular especificamente a sua infecção por meio de um mecanismo pós-transcricional que inibe a expressão dos componentes da via de MHC de classe I.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-09-09T16:36:15Z No. of bitstreams: 1 2013_MaraOlimpiaMachado.pdf: 1881289 bytes, checksum: d18ed6a8947e91ea0320ab3f94f39319 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-09-10T12:41:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MaraOlimpiaMachado.pdf: 1881289 bytes, checksum: d18ed6a8947e91ea0320ab3f94f39319 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-10T12:41:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MaraOlimpiaMachado.pdf: 1881289 bytes, checksum: d18ed6a8947e91ea0320ab3f94f39319 (MD5) / A doença de chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, encontra-se entre as Doenças Tropicais Negligenciadas com maiores taxas de prevalência no Brasil. A transmissão se da, principalmente, por duas vias: pelas fezes do vetor triatomíneo e por transfusão sanguínea. Seu agente etiológico é o Trypanosoma cruzi, um protozoário flagelado. Nos vertebrados, os tripomastigotas, forma infectante do T. cruzi, podem aderir e penetrar em quase qualquer célula hospedeira. Nesses processos estão interligadas as proteínas da superfície celular e as secretadas. Para caracterização das proteínas secretadas/excretadas pelo tripomastigota, utilizou-se a abordagem proteômica por nanoLC-MS/MS. Identificou-se as proteínas totais secretadas e realizou-se estudos preliminares de proteínas glicosiladas e fosforiladas. Os dados foram analisados por bioinformática. Encontrou-se um total de 535 proteínas distintas, destas 24 eram proteínas glicosiladas e 40 fosforiladas. Em sua grande maioria, baseado em algoritmos de predição por análise de sequencias, apresentam-se como secretadas, principalmente pela via não clássica (65%) e não pela via clássica (15%). As demais proteínas (20%) não foram preditas como secretadas, porém entre estas incluem-se proteínas já descritas anteriormente como liberadas no meio extracelular. Isso reflete provavelmente a limitação dos softwares bioinformáticos disponíveis e da peculiaridade do modo de liberar proteínas pelo parasito no meio externo. Este estudo apresenta uma abordagem adequada para identificar uma grande diversidade de proteínas secretadas no sobrenadante da cultura de T. cruzi e oferece novas perspectivas para o estudo de moléculas potencialmente envolvidas nas fases iniciais da infecção, já que tais proteínas são mediadores-chave da interação parasito-hospedeiro. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis, is found to be one of the Tropical Neglected Diseases with highest prevalence in Brazil. The transmission occurs, mainly, for two ways: the vector triatomine faecal matter and blood transfusions. Its etiological agent is Trypanosoma cruzi, a flagellate protozoan. On vertebrate, the trypomastigote, infected form of T. cruzi, can adhere and penetrate in almost any host cell. On these processes both the secreted and the cellular surface protein are nterlocking. To character both secreted/ excreted proteins by trypomastigote, was used a proteomics approach by nanoLC-MS/MS. It was identify the total secreted proteins and preliminary studies of glucose and phosphorylation was held. The data were analyzed by bioinformatics. It was found a total of 535 distinct proteins, among 24 were glycosylated and 40 were phosphorylated. The great part, based on sequential analysis of prediction algorithms, was presented as secreted, mainly by a non-classical way (65%), and not by a classic way (15%). The remaining proteins (20%) were not predicted as secreted, however among them there are proteins described previously released into the extracellular environment. This, probably, reveals the limitation of bioinformatic software available and the peculiarity of the mode of release proteins by the parasite in his medium. This study presents an adequate approach to identify a great diversity of proteins secreted in the T. cruzi culture supernatant and it also offers new perspective to the study of molecules potentially involved on the initial phases of the infection, since such proteins are key mediators of the interaction parasite-host.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-12-10T11:52:52Z No. of bitstreams: 1 2013_AdrianoRiosdaSilva.pdf: 2698684 bytes, checksum: a4ee07376019a8db08cbc39e71515b1f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-12-11T15:35:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_AdrianoRiosdaSilva.pdf: 2698684 bytes, checksum: a4ee07376019a8db08cbc39e71515b1f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-11T15:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_AdrianoRiosdaSilva.pdf: 2698684 bytes, checksum: a4ee07376019a8db08cbc39e71515b1f (MD5) / A doença de Chagas é uma patologia que acomete milhares de pessoas no mundo inteiro, principalmente no continente Americano. O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, é transmitido principalmente pelo inseto triatomíneo durante o repasto sanguíneo. Além da transmissão vetorial, a doença de Chagas pode ser adquirida por via transfusional, congenital ou pelo consumo de alimentos contaminados. A possibilidade da transmissão sexual da doença de Chagas foi sugerida por Carlos Chagas em 1909, entretanto, poucos trabalhos foram publicados sobre o tema desde então. O presente trabalho teve como objetivo investigar a transmissão sexual do Trypanossoma cruzi no modelo experimental murino. Para isso, foram feitos testes parasitológicos, sorológicos e moleculares em 20 camundongos infectados e em seus parceiros sexuais, inicialmente sadios. Os resultados mostraram que após o acasalamento com animais infectados, os parceiros sexuais apresentaram testes sorológicos positivos em 60% dos casos, enquanto que o DNA nuclear do parasito foi identificado no sangue dos animais analisados. Além disso, duas fêmeas inicialmente sadias apresentaram testes de hemocultura positivos após acasalarem com machos infectados, confirmando assim a trasmissão sexual do T. cruzi. Os resultados dos testes sorológicos e moleculares dos filhotes mostraram uma discrepância entre a sorologia e os resultados de PCR, sendo que o teste molecular apresentou uma maior sensibilidade. A taxa de infecção congênita obtida pelos métodos sorológicos revelaram que 14% dos filhotes provenientes dos Grupos A e B adquiriram a infecção, enquanto que o teste de PCR demonstrou uma positividade de 58%. A análise histopatológica não foi capaz de mostrar a presença de ninhos de amastigotas no coração dos animais infectados, tanto pela via intraperitonial, como pela via sexual. No entanto, pôde-se observar a presença de extenso infiltrado inflamatório destruindo as fibras cardíacas em todos os animais infectados. A análise de imunohistoquímica realizada em cortes histológicos de testículos de camundongos infectados revelou uma grande quantidade de formas amastigotas no túbulo seminífero e epidídimo. A capacidade de infecção do sêmem proveniente de indivíduo infectado pelo T. cruzi foi verificada. As análises histopatológicas mostraram a presença de ninhos de amastigotas no coração de fêmeas infectadas a partir da inoculação intra-vaginal de sêmen humano. Dessa forma, nossos resultados mostram que ocorreu transmissão sexual do Trypanosoma cruzi em camundongos. / Chagas disease is a condition that affects thousands of people worldwide, mainly in the Americas. Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, is transmitted primarily by triatomine insect during blood feeding. Besides vetorial transmission, Chagas disease can be acquired by blood transfusion, congenital or by consumption of contaminated food. The possibility of sexual transmission of Chagas disease has been suggested by Carlos Chagas in 1909, however, few studies have been published on the subject since then. The present study aimed investigate sexual transmission of Trypanosoma cruzi in experimental murine model. For this, parasitological, serological and molecular infected mice and their sexual partners, initially healthy. The results showed that after mating with animals infected sexual partners serological tests showed positive in 60% of cases, while the nuclear DNA of the parasite was identified in blood from all animals analyzed. In addition, two healthy females initially showed positive blood culture tests after mating with infected males, thus confirming the sexually transmitted T. cruzi. The results of serological and molecular tests of pups showed a discrepancy between serology and PCR results, and the molecular test showed a higher sensitivity. Congenital infection rate obtained by serological methods showed that 14% of the from Groups A and B acquired infection, whereas the PCR test showed an 58% positivity. Histopathological analysis was not able to show the presence of nests of amastigotes in the hearts of infected animals, either by intraperitoneal as through sex. However, it was observed the presence of extensive inflammatory infiltrate destroying cardiac fibers in all infected animals. Immunohistochemical analysis performed in histological testis infected mice revealed a large amount of amastigotes in seminiferous tubule and epididymis. The ability of infection semen from individual infected with T. cruzi was verified. The histopathological analysis showed the presence of nests of amastigotes in the heart of infected females from intravaginal inoculation of human semen. Thus, our results show that there was sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mice.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-03-07T10:56:16Z No. of bitstreams: 1 2013_RaquelSilvadeNegreiros.pdf: 6245785 bytes, checksum: 5da9f4c315f41c976088353b8d4780e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-03-07T12:29:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_RaquelSilvadeNegreiros.pdf: 6245785 bytes, checksum: 5da9f4c315f41c976088353b8d4780e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-07T12:29:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_RaquelSilvadeNegreiros.pdf: 6245785 bytes, checksum: 5da9f4c315f41c976088353b8d4780e9 (MD5) / Diversos isolados e cepas de Trypanosoma cruzi são classificados em seis grupos genéticos ou discrete typing units (DTUs), TcI a TcVI. A cepa G estudada no presente trabalho pertence ao DTU TcI e foi isolada de um gambá da região Amazônica brasileira. Parasitos pertencentes a essa cepa apresentam um genoma não híbrido e menor que da cepa CL Brener. Além disso, tripomastigotas metacíclicas da cepa G são qualificados como pouco virulentas e, surpreendentemente, amastigotas axênicas são altamente infectivas. Dentro de um amplo projeto do nosso grupo de pesquisa que envolve o futuro sequenciamento do genoma da cepa G de T. cruzi, está inserida a análise proteômica de epimastigotas em larga escala que auxiliará na anotação dos genes. Para isso, foi realizada a análise por LC-MS/MS dos peptídeos gerados por digestão em gel do lisado proteico de epimastigotas. Foram feitas três buscas automatizadas em bancos de dados. Para a primeira busca, utilizando-se do banco de dados de Trypanosoma spp. e outros tripanossomatídeos, 1.460 proteínas foram identificadas. Para a segunda busca, no banco de dados apenas da cepa CL Brener, foram obtidas 953 identificações. Para ambas as buscas, foi utilizado o algoritmo do programa Sequest. Já com a utilização do algoritmo do PEAKS, foram detectadas 2.947 proteínas a partir do confronto dos espectros MS/MS com o banco de dados das cepas CL Brener e Sylvio X10/1. Considerando essa última abordagem, este é o proteoma mais abrangente realizado até hoje disponível independentemente do estágio de vida. Em todas as buscas, a via metabólica mais abundante em número de anotações foi metabolismo de purinas, o que está condizente com o alto requerimento energético de formas epimastigotas replicativas. A via glicólise também foi listada entre as dez vias metabólicas mais representativas em todas as buscas, provavelmente devido à presença de glicose no meio de cultivo e à preferência por essa hexose como fonte de carbono por epimastigotas. Todas as buscas resultaram na predominância de proteínas preditas a serem secretadas pela via não clássica e na identificação de diversas proteínas integrais de membrana potenciais, mostrando que a extração de proteínas por solubilização com SDS foi eficiente para o propósito de um proteoma abrangente. Particularmente, na busca 3, foram identificadas várias proteínas candidatas a alvos de drogas estudadas pelo nosso grupo, como leucil-aminopeptidase (LAP), oligopeptidase B (OPB), proliloligopeptidase (POP), metiltioadenosina fosforilase (MTAF) e catepsina B. Em relação às famílias multigênicas de T. cruzi, a terceira busca resultou na identificação de uma grande quantidade de membros das famílias de transsialidases (TS), mucin-associated surface proteins (MASP), mucinas, proteínas retrotransposon hot spot (RHS) e dispersed gene family 1 (DGF-1) e glicoproteínas de 63 kDa (gp63). Portanto, podemos concluir que a busca no banco de dados das cepas CL Brener e Sylvio X10/1 foi a mais satisfatória. Este proteoma representa um avanço significativo para o conhecimento do conjunto de proteínas expresso em T. cruzi e, também, um passo importante para a elucidação da sequência genômica da cepa G de T. cruzi. / Many isolates and strains of Trypanosoma cruzi are classified into six genetic groups or DTUs (discrete typing units), TcI to TcVI. G strain studied in the present work belongs to DTU TcI and was isolated from an opossum of Brazilian Amazon. G strain parasites have a non-hybrid and smaller genome than CL Brener strain. Moreover, G strain metacyclic trypomastigotes forms are characterized as low virulent and surprisingly axenic amastigote forms are highly infective. Within a broad project of our research group, which involves the subsequent genome sequencing of T. cruzi G strain, high-throughput proteomic analysis of epimastigotes is inserted to help gene annotation. For this, LC-MS/MS analysis of peptides generated by in-gel digestion of epimastigote protein lysate was accomplished. Three database automated searches were done. The search using the database of Trypanosoma spp. and other trypanosomatids allowed identification of 1.460 proteins. Secondly the search against T. cruzi CL Brener strain database resulted in 953 identifications. For both searches, Sequest algorithm was employed. With the use of PEAKS algorithm, 2.947 were detected from search against both CL Brener and Sylvio X10/1 strains database. Considering the last approach, this is the most abrangent proteome that has been revealed so far regardless the life stage of the parasite. In all searches, the most abundant metabolic pathway in number of annotations was purine metabolism, which is consistent with high energy requirement of replicative epimastigote forms. The glycolysis pathway also was related to the ten most representative metabolic pathways in all searches, probably due to the presence of glucose in culture medium and the preference for this hexose as carbon source by epimastigotes. All searches revealed the predominance of proteins secreted by non classical pathway and in the identification of many potential integral membrane proteins, showing that protein extraction was efficient for the purpose of an in-depth proteome. Notedly, with the search against both CL Brener and Sylvio X10/1 strains database, several drug target candidates studied by our group, as leucyl aminopeptidase (LAP), oligopeptidase B (OPB), prolyl oligopeptidase (POP), methylthioadenosine phosphorylase (MTAF) and cathepsin B were detected. In relation to multigenic families of T. cruzi, the third search resulted in the identification of a large amount of members of families of trans-sialidases (TS), mucin-associated surface proteins (MASP), mucins, retrotransposon hot spot (RHS) and dispersed gene family 1 (DGF- 1) proteins and 63 kDa glycoproteins (gp63). Therefore, we conclude that the search against both CL Brener and Sylvio X10/1 strains of T. cruzi was the most satisfactory. This proteome represent a significant advance in understanding the set of proteins expressed in T. cruzi and also an important step for elucidation of genome sequence of T. cruzi G strain.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A doenÃa de Chagas, considerada uma doenÃa negligenciada, à uma infecÃÃo parasitÃria causada pelo Trypanosoma cruzi e endÃmica em diversos paÃses. No Brasil, apenas o Benzonidazol à usado para o tratamento da doenÃa. Nesse contexto, o potencial terapÃutico das toxinas vem cada vez mais conquistando espaÃo e despertando grandes interesses da comunidade cientÃfica. Os venenos de invertebrados tÃm apresentado grande interesse como fonte de substÃncias bioativas. Os mastoparanos, a classe mais amplamente descrita de peptÃdeos isolados a partir da peÃonha de vespas, ja evidenciaram diferentes atividades biolÃgicas. Assim, os peptÃdeos isolados tÃm despertado interesse cientÃfico como fonte de modelos moleculares para o possÃvel desenvolvimento de novas terapias farmacolÃgicas. Este estudo investigou o efeito do peptideo mastoparano (MP) isolado do veneno da vespa Polybia paulista sobre cepa Y de Trypanosoma cruzi e seu possÃvel mecanismo de aÃÃo. Formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas, tratadas com diferentes concentraÃÃes de MP e incubadas durante 24, 48 e 72 horas. Formas tripomastigotas de T. cruzi obtidas atravÃs de infecÃÃo de cÃlulas LLCMK2 foram subcultivadas, tratadas com diferentes concentraÃÃes de MP e incubadas durante 24 horas. Para investigar a participaÃÃo das espÃcies reativas de oxigÃnio (ERO) no efeito citotÃxico do mastoparano sobre formas epimastigotas de T.cruzi, placas foram incubadas com a CI50 de 24h de MP e a anÃlise da emissÃo de fluorescÃncia foi realizada em citometria de fluxo apÃs adiÃÃo de DCF. O efeito de mastoparano sobre o potencial de membrana mitocontrial das formas epimastigotas foi realizado pelo ensaio com rodamina 123. A citotoxicidade foi avaliada sobre celulas Raw 264.7 e a viabilidade dos macrÃfagos foi determinada utilizando o ensaio com MTT. No estudo de Docking molecular, obteve-se inicialmente a estrutura tridimensional do mastoparano a partir da sequÃncia primÃria em programa especÃfico. ApÃs anÃlise dos sÃtios de ligaÃÃo entre peptÃdeo e enzima TcGAPDH, a estrutura cristalogrÃfica do complexo TcGAPDH-chalepina foi utilizada para comparaÃÃo. O mastoparano inibiu o crescimento das formas epimastigotas de T. cruzi, apresentando uma CI50 de 102 Âg/mL, 53,95 Âg/mL e 58,51 Âg/mL para 24, 48 e 72 horas de incubaÃÃo respectivamente. Na anÃlise da produÃÃo de espÃcies reativas houve um aumento significativo na intensidade relativa de fluorescÃncia, quando comparado ao grupo controle. O peptideo alterou o potencial da membrana mitocondrial do parasita. Para as formas tripomastigotas a CI50 foi 8,83 Âg/mL apÃs 24h de incubaÃÃo. A citotoxidade do mastoparano avaliada em macrÃfagos nÃo induziu morte celular significativa nas diferentes concentraÃÃes estudadas. No estudo de docking, foi evidenciado o acoplamento do mastoparano na TcGAPDH, demonstrando os diferentes sÃtios de ligaÃÃo dos resÃduos de aminoÃcidos do centro ativo da enzima e comparando a semelhanÃa na posiÃÃo ocupada pela molÃcula chalepina na TcGAPDH. Conclui-se que o mastoparano apresentou atividade tripanocida envolvendo a participaÃÃo do estresse oxidativo e alteraÃÃo do potencial de membrana sem apresentar citotÃxica em cÃlulas de macrÃfagos e parece inibir a TcGAPDH de T. cruzi. Portanto, o mastoparano se destaca como importante molÃcula bioativa contra os parasitas.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4832_1.pdf: 2954122 bytes, checksum: 114e1392fcb9a2531af70397ba35de41 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Os liquens são associações simbióticas entre algas e fungos que produzem uma variedade de produtos altamente complexos e peculiares, com marcada ação antimicrobiana. As substâncias liquênicas têm demonstrado importante atividade biológica, tornando-se viável o seu estudo contra protozoários parasitas. A doença de Chagas, uma doença parasitária endêmica, representa um sério problema de saúde pública em toda a América Latina, particularmente no Brasil. A quimioterapia disponível atualmente é insatisfatória por ter eficácia limitada, principalmente no estágio crônico da doença, e por induzir efeitos colaterais tóxicos no hospedeiro. Além disso, o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, apresenta resistência a uma variedade de drogas. Neste trabalho o extrato orgânico etéreo e o ácido barbático purificado de Cladonia salzmannii Nyl. foram testados em diferentes concentrações (5, 10, 20 e 40 g/mL) contra formas epimastigotas do T. cruzi para verificação de sua atividade tripanosomicida in vitro. O efeito inibitório do extrato etéreo na proliferação do parasita foi estatisticamente significante apenas após 72h de cultivo, para todas as concentrações. As culturas tratadas com ácido barbático purificado não apresentaram inibição significante nas concentrações mais baixas e no mesmo tempo de incubação acima descrito. A análise ultraestrutural da forma epimastigota tratada com extrato etéreo e ácido barbático purificado, demonstrou alterações nas organelas citoplasmáticas. Danos mais severos, incluindo formação de bolhas e ruptura da membrana plasmática, foram observados nas concentrações mais altas. A microscopia eletrônica de varredura confirma os dados obtidos na microscopia eletrônica de transmissão, particularmente quanto a desestruturação da membrana plasmática e flagelar. Os resultados apontam o uso do ácido barbático como uma alternativa para o desenvolvimento de novas drogas contra o T. cruzi

Submitted by Rafael Santana (rafael.silvasantana@ufpe.br) on 2018-02-20T18:35:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao TIAGO FRANCA BARRETO versao final revisada com ficha.pdf: 1881406 bytes, checksum: 12e01eebda9019e211cef41ad935a421 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-20T18:35:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertacao TIAGO FRANCA BARRETO versao final revisada com ficha.pdf: 1881406 bytes, checksum: 12e01eebda9019e211cef41ad935a421 (MD5) Previous issue date: 2017-01-25 / CAPES / O parasita Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, que figura como um dos graves problemas de saúde pública de países em desenvolvimento. Único fármaco disponível para a terapêutica da doença de Chagas, o benznidazol (BNZ) é um derivado 2- nitroimidazol com largo espectro de atividade farmacológica antiparasitária. Entretanto, o BNZ apresenta entraves biofarmacotécnicos: grandes doses administradas, tratamentos prolongados, a alta incidência de reações adversas; tudo devido a sua baixa solubilidade aquosa, uma vez que pertence à classificação biofarmacêutica de classe II. O papel da tecnologia farmacêutica é, então, prover alternativas capazes de incrementar a solubilidade do BNZ e modular sua liberação a fim de obter um tratamento alternativo de maior qualidade e com maior aceitação pelo paciente. Neste contexto, o presente trabalho objetivou desenvolver Drug Delivery Systems (DDS) à base de BNZ e do excipiente inovador Zeolitic Imidazolate Framework (ZIF-8), a fim de utilizá-lo nos estudos de pré-formulação de forma farmacêutica de liberação prolongada para o tratamento alternativo da doença de Chagas. Os sistemas foram obtidos em diferentes proporções molares após otimização de um método ex situ de incorporação do fármaco. A maior eficiência de incorporação foi o critério escolhido para a seleção do melhor DDS. Em seguida, foram realizadas diferentes caracterizações físico-químicas visando avaliar a formação do sistema e a cinética de liberação in vitro do fármaco através de ensaios de dissolução e diálise sob condições sink e non-sink. Para fins comparativos, foram utilizadas misturas físicas na proporção molar de 1:1. Os dados de liberação foram analisados através da área sob a curva (AUC) e ajuste dos resultados quanto aos métodos modelo-dependente e -independente. O sistema BNZ:ZIF-8 1:1 (mol:mol) obtido em acetona foi o selecionado por apresentar maior eficiência de incorporação (em média 38%) após 4 dias de agitação intermitente. As diferentes técnicas de caracterização utilizadas corroboraram a formação do sistema. Os estudos de liberação in vitro do BNZ através de dissolução e de diálise mostraram que houve modulação da liberação do fármaco de acordo com o pH utilizado em condições sink e non-sink. A modulação da liberação foi corroborada tanto pelo ajuste dos resultados a diferentes modelos cinéticos e alteração do mecanismo de liberação do fármaco, quanto pela diferença entre os perfis de liberação comprovada pelo fator de semelhança. Assim, em pH 4,5 o sistema apresentou uma liberação mais rápida, com efeito burst, enquanto que em pH 7,6 houve uma liberação prolongada, mais lenta e sem efeito burst. Em vista dos argumentos apresentados, fica evidente que foi obtido um DDS pH-dependente promissor a ser utilizado como inovador carreador do BNZ em formas farmacêuticas destinadas ao tratamento alternativo da doença de Chagas. / Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas’ disease and consist in one of the major public health problems in developing countries. Only drug available for the treatment of Chagas’ disease, benznidazole (BNZ) is a 2-nitroimidazole derivative with broad-spectrum antiparasitic activity. However, BNZ has biopharmaceutical barriers: large doses, prolonged treatments, the high incidence of adverse reactions; all due to its low aqueous solubility, since it belongs to the biopharmaceutical classification II. Therefore, pharmaceutical technology provides alternatives capable of increasing the solubility of the BNZ and modulate its release in order to obtain an alternative treatment with higher quality and greater patient acceptance. In this context, this study aimed to develop a Drug Delivery Systems (DDS) based on BNZ and the innovative excipient Zeolitic Imidazolate Framework (ZIF-8) aiming to use it in the pre- formulation studies of extended release dosage forms to alternative treatment of Chagas’ disease. The systems were obtained at different molar ratios after optimization of an ex situ method of drug incorporation. The largest uptake efficiency was the criterion used for selecting the best DDS. Then, different characterizations were performed to evaluate the system obtainment, including the kinetics of drug in vitro release through dissolution tests and dialysis under sink and non-sink conditions. For comparison, physical mixtures (PM) were used in the molar ratio 1:1. The release data were analyzed by the area under the curve (AUC) and setting the kinetic results through methods model dependent and independent. The BNZ:ZIF-8 1:1 (mol:mol) system was selected because of its higher incorporation efficiency (38%) after 4 days of intermittent agitation. The different characterization techniques corroborated the obtainment of the system. In vitro release studies of BNZ through dissolution and dialysis showed that there was modulation of the drug release according to the pH used in sink and non-sink conditions. Modulation of the release was corroborated by the adjustment of the results to different kinetic models and alteration of the mechanism of drug release, as well as by the difference between the release profiles evidenced by the similarity factor. Thus, at pH 4.5 the system showed a faster release with burst effect, while at pH 7.6 there was a prolonged, slower release with a reduce in the burst effect. Finally, it is evident that a promising DDS pH-sensitive was obtained to be used as the novel carrier of BNZ in dosage forms intended for the alternative treatment of Chagas' disease.

Orientador: Julia Keiko Sakurada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T19:57:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ortiz_SilviaCollettaBarretodaCosta_M.pdf: 2223480 bytes, checksum: 1e2219d880f15f009d33fae0450e4a34 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Trabalhos descritos anteriormente evidenciam que vários genes estão envolvidos na regulação da resposta imune à infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi. O objetivo do presente trabalho foi identificar a região cromossomial que conferisse resistência ou susceptibilidade ao parasita, utilizando linhagens isogênicas de camundongos livres de patogênos específicos como modelo. Foram avaliados os níveis de parasitemia e a taxa de mortalidade de animais inoculados com a cepa "Y" do T cruzi. Desta maneira, as linhagens C57BL/6 e CBA foram caracterizadas como resistentes enquanto que, as linhagens A/J e C3H/HeP foram classificadas como susceptíveis à infecção pelo parasita. Acasalamentos recíprocos entre as linhagens A/J (susceptível) e C57BL/6 (resistente) foram realizados para determinação do tipo de herança e para análise da resistência nos animais híbridos (F1) e segregantes (F2). A análise dos DNAs dos animais resistentes e susceptíveis foi feita através do estudo dos marcadores polimórficos utilizando-se da técnica de PCR ("Polymerase Chain Reaction") nos cromossomos 1, 2, 4 , 8, 10, 13, 15, 16, e 19 dos animais segregantes. Os resultados obtidos não permitiram detectar uma concentração do gene da linhagem parental resistente (C57BL/6), ou da linhagem parental susceptível (A/J), significativamente maior do que seria esperado numa distribuição ao acaso. Entretanto, esses dados experimentais abrem novas perspectivas de pesquisa que permitem dar continuidade ao estudo da genética de resistência, investigando agora os cromossomos restantes / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Julia Keiko Sakurada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T15:09:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assis_AngelaMariade_M.pdf: 2780125 bytes, checksum: ed0382f3c176db7f9c21e4d7373bbba3 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Para investigar a doença de Chagas experimental, camundongos BALB/c normais e C.B-17 scid/scid deficientes em linfócitos T e B funcionais foram inoculados com diferentes doses dos estoques tripomastigota de cultura (Tc) e tripomastigota sangüícola (Ts) da cêpa Y de Trypanosoma cruzi. Os resultados obtidos com camundongos BALB/c mostraram que somente a dose 105 do estoque Ts foi capaz de matar 60% dos animais e com os camundongos SCIO a infecção foi letal com todas as doses e ambos os estoques do parasita. Esse perfil foi significantemente alterado, após a repopulação dos animais com 2x107 células esplênicas do camundongo BALB/c, e desafiados, em tempos diferentes, com o estoque Tc, mostrando um desvio no nível de parasitemia e controle da mortalidade. Os animais repopulados com células tímicas, apresentaram uma modificação no nível de parasitemia quando desafiado com baixa dose de parasita do estoque de virulência atenuada (Tc). Os estudos de imunoproteção realizados em camundongos SCIO através da imunização passiva com várias doses do soro anti- T. cruzi obtidos de animais cronicamente infectados, foi no sentido de verificar o efeito dos anticorpos na ausência de imunidade celular. Observou-se um deslocamento no período de pré-patência nos animais que receberam uma única dose do anticorpo e as doses adicionais de anticorpos não alteraram a infecção. O conjunto de resultados mostrou que as células esplênicas foram efetivas no controle da parasitemia e mortalidade, enquanto que as células tímicas foram eficientes em controlar o nível de parasitemia, ressaltando a importância da imunidade celular e humoral no desenvolvimento de uma resposta protetora durante o período de infecção / Abstract: In order to investigate the experimental Chagas disease, normal BALB/c mice and deficient C.B-17 scid/scid in functional T and B Iymphocytes were inoculated with different doses of Tc and Ts storages of the Y strain of Trypanosoma cruzi. The results obtained showed a lethal infection only in SCIO mice. This profile was changed significantly after the repopulation of SCIO mice with 2x107 splenic cells of BALB/c mice and challenges with the Tc storage at different intervals, showing a deviation of the parasitemia levels and the mortality control. In the animais repopulated with thymic cells a change was observed in the parasitemia leveI. To verify the role of the antibody in the absence of cellular immunity, SCIO mice were immunized passively with various doses of anti- T.cruzi serum obtained from infected animais. A dislocation was then observed, in the pre-patent period only in the animais that received a unique dose of antibodies. The group of results indicated that the splenic cells were effective in the control of the parasitemia and mortality levei, while the thymic cells were effective in the control of parasitemia levei, stressing the importance of cellular and humoral immunity in the development of a protecting response during the period of infection / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas

Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita. / Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.