Resumo não disponível.

Submitted by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-28T15:10:58Z No. of bitstreams: 1 Publico-3.pdf: 6480834 bytes, checksum: d814f384d8939a2b58fe297c38e074fd (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-28T15:13:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Publico-3.pdf: 6480834 bytes, checksum: d814f384d8939a2b58fe297c38e074fd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T15:13:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Publico-3.pdf: 6480834 bytes, checksum: d814f384d8939a2b58fe297c38e074fd (MD5) Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Agência Internacional de Energia Atômica (IAEA) / Nós identificamos em T. cruzi uma nova família de retroelementos sítioespecífico chamada TcTREZO (Trypanosoma cruzi Tandem Repetitive Element ZO). O elemento TcTREZO é uma repetição de natureza composta sendo constituído por seqüências presentes em outras localidades do genoma não associadas ao elemento. Análise da distribuição do TcTREZO no genoma indica claramente que o elemento está inserido em sítios específicos do genoma. A maioria dos elementos TcTREZO é flanqueada por seqüências conservadas. A região 5´ do elemento é flanqueada por uma seqüência conservada de 68-pb e a região 3´ por um domínio de aproximadamente 500 pb cujas extremidades não são muito bem definidas. Análises de hibridação em “northern blot” e amplificação por RT-PCR indicam a presença de transcritos TcTREZO poliadenilados cujo tamanho (1,6 kb) corresponde ao tamanho do elemento completo. Também foram detectados transcritos de ~ 0,2 kb derivados de uma pequena região do elemento TcTREZO. O número de cópias do elemento foi estimado como sendo de ~ 1800 cópias por genoma haplóide. TcTREZO parece ter sido formado por inserção de seqüências em um elemento progenitor. Uma vez associadas entre si, essas foram amplificadas com sucesso gerando um novo elemento que representa ~ 5 % do genoma de T. cruzi. TcTREZO poderia ter sido originado por um único evento de inserção após o qual o aumento do número de cópias teria ocorrido por “crossing-over” desigual ou conversão gênica. O fato de TcTREZO ser encontrado apenas em T. cruzi sugere que ele possa ter tido algum papel na especiação deste parasita por amplificação e distribuição no genoma. TcTREZO insere-se em sítios específicos, sugerindo que uma endonuclease específica pode ser a responsável por sua inserção em sítios únicos do genoma. / A new family of site-specific retroelements identified in Trypanosoma cruzi, which we named TcTREZO, is described here. TcTREZO appears to be a composite repeated element, since three subregions may be defined within it on the basis of sequence similarities with other T. cruzi sequences. Analysis of the distribution of TcTREZO in the genome clearly indicates that it displays site specificity for insertion. Most TcTREZO elements are flanked by conserved sequences. There is a highly conserved 68-bp sequence at the 5’ end of the element and a sequence domain of ~500 bp without a well-defined borderline at the 3’ end. Northern blot hybridization and RT-PCR analyses showed that TcTREZO transcripts are expressed as oligo (A)-terminated transcripts whose length corresponds to the unit size of the element (1.6 kb). Transcripts of ~0.2 kb derived from a small part of TcTREZO are also detected in steady-state RNA. The copy number of TcTREZO sequences was estimated to be ~ 1800 copies per haploid genome. TcTREZO appears to have been assembled by insertions of sequences into a progenitor element. Once associated with each other, these subunits were amplified as a new transposable element with such remarkable success that TcTREZO comprises ~ 5 % of the T. cruzi genome. TcTREZO could presumably have originated from a single insertion event after which its copy number increased, possibly through unequal sister-chromatid exchange or gene conversion. As it is only present in T. cruzi, TcTREZO could have played a role in the speciation of this parasite by amplification and genome-wide dispersion. TcTREZO shows site specificity for insertion, suggesting that a sequence-specific endonuclease could be responsible for its insertion at a unique site.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:24Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00197.pdf: 1371304 bytes, checksum: c513b282e60ab12fa193b0ce8b343766 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente trabalho avaliou-se o papel das proteínas de membrana de lisossomos, LAMP-1 e LAMP-2 no processo de invasão de amastigotas extracelulares de T. cruzi. Foram utilizadas células MEF (murine embrionic fibroblast) nocaute para uma ou ambas as proteínas. Três diferentes pares linhagens de células selvagem/duplo nocaute foram utilizados, além de uma linhagem de célula nocaute para LAMP-1 e uma para LAMP-2. Amastigotas extracelulares invadiram mais eficientemente duas das células duplo nocaute, mas não uma terceira. Quando comparado às células selvagem, os amastigotas também invadiram mais eficientemente as células nocaute para LAMP-2, mas não as LAMP-1 nocaute. Adicionalmente, tanto células HeLa, quanto duas linhagens de MEF selvagem foram tratadas com siRNA para as proteínas LAMP. O tratamento promoveu diminuição na expressão das referidas proteínas, mas não houve diferença significativa na invasão entre as células tratadas e as células controle, indicando que essas proteínas não são importantes na invasão dos amastigotas extracelulares. Para explicar a maior permissividade à invasão em determinados tipos celulares, a taxa de exocitose de lisossomos foi avaliada. Felizmente, uma maior taxa de exocitose de lisossomos correlacionou-se com maior taxa de infectividade. Além disso, uma cinética de aquisição do marcador lisossomal CD63/LIMP-2 mostrou que nas células em que a taxa de invasão é maior em relação à célula selvagem correspondente, a aquisição do marcador lisossomal é maior em tempos iniciais de invasão, corroborando a importância da exocitose de lisossomos no processo de invasão. Ademais uma cinética de aquisição de marcador lisossomal (LAMP-1, neste caso) também foi realizada em células HeLa e Vero e foi demonstrado que também nestas células os amastigotas extracelulares de T. cruzi valeram-se da exocitose de lisossomos para o sítio de internalização do parasita. Finalmente, estudos anteriores realizados com as mesmas células MEF nocaute para LAMP utilizadas aqui haviam demonstrado que proteínas LAMP são necessárias para a fusão do fagossomo com o lisossomo no caso da fagocitose mediada por receptor. Porém, surpreendentemente, aqui foi possível notar vacúolos parasitóforos claramente marcados com CD63/LIMP-1 nas células duplo nocaute, indicando que, ao menos nas células MEF os AE de T. cruzi invadiram as células por um mecanismo diferente da fagocitose mediada por receptor. / In the present work the role of LAMP-1 and LAMP-2 in invasion by extracellular amastigotes of T. cruzi was evaluated. Murine embryonic fibroblast (MEF) knockout for one or both proteins were used. Three different pairs of wild type/double knockout cells were used, besides one single LAMP-1 or LAMP-2 knockouts cell lineage. Extracellular amastigotes invasion rate was higher for two of the double knockout clones but not for the other one. When compared to their respective wild type clones, the extracellular amastigotes showed higher infectivity in LAMP-2 knockouts, but no difference was seen in LAMP-1 knockout cells. In addition, HeLa and two wild type lineages of MEFs were submitted to siRNA treatment. Although the siRNA treatment was efficient, since down regulation in protein expression was observed, there was no difference in amastigotes cell invasion in cells treated in comparison to the controls. These results indicated that LAMP proteins were not important to extracellular amastigotes cell invasion. To explain the reason for a higher invasion rate observed in some cells, lysosomal exocytosis was evaluated. Fortunately, higher lysosomal exocytosis correlated with a higher invasion rate. Moreover, it was performed a CD63/LIMP-2 acquisition kinetics and the same cells that showed higher invasion rate, presented higher lysosomal marker acquisition in early invasion times. Taken together, these findings suggest that lysosomal exocytosis was important to amastigotes cell invasion. Lysosomal marker acquisition kinetics (LAMP-1 here) were performed also in HeLa and Vero cells. Once again lysosome exocytosis was important to extracellular amastigotes cell invasion. Finally, previous results with the same MEFs used in this study demonstrated that LAMP proteins were essential to phagosome-lysosome fusion. Here, it was demonstrated that in knockout cells parasitophorous vacuoles are clearly CD63/LIMP-1 stained, indicating that in MEFs, extracellular amastigotes enter cells by a mechanism other than receptor-mediated phagocytosis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10907a.pdf: 1648639 bytes, checksum: bf4fac985206b2244ac3ec1870393d34 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:50Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10907a.pdf: 1648639 bytes, checksum: bf4fac985206b2244ac3ec1870393d34 (MD5) Publico-10907b.pdf: 902711 bytes, checksum: 9db986617af48f452457bb57d5021d5e (MD5) / As infestinas são inibidores de serinoproteases do tipo Kazal encontrados no intestino médio anterior do barbeiro Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae), um dos principais vetores da doença de Chagas. Neste trabalho, o cDNA do precursor das infestinas foi clonado mostrando a presença de um peptídeo sinal hipotético e sete domínios de inibidores de proteases do tipo Kazal sendo quatro correspondentes as infestinas 1-2 e infestina 3-4, e três novos domínios. Por análise em Northern blot, foi confirmada a síntese de apenas um transcrito de infestina 1-7, de aproximadamente 1800 pb, no intestino médio anterior do inseto. Os três novos domínios de infestina foram denominados de infestina 1R, 2R e 3R. As infestinas 2R-3R são 77% idênticas em seqüência de aminoácidos a infestina 1-2. Em contraste as demais infestinas, a infestina 1R apresenta duas características diferentes marcantes: 1) aminoácido hidrofóbico na posição P1 do sítio reativo do inibidor e, 2) ser processado como um domínio único do tipo Kazal de acordo com predição. Estas duas características foram demonstradas experimentalmente pela purificação da infestina 1R nativa de intestino de T. infestans a qual inibiu elastase de neutrófilos, quimotripsina e subtilisina A e a análise por espectroscopia de massas confirmou o processamento como um único domínio do tipo Kazal. A infestina 1R recombinante foi expressa em bactéria E. coli e apresentou a mesma constante de dissociação para elastase de neutrófilos em relação a proteína nativa. rINF1R também foi capaz de inibir subtilisina A, quimotripsina e proteinase K, mas não foi capaz de inibir trombina nem os ensaios de coagulação (TP e TTPA). Procurando pela função biológica de infestina 1R e atividades biologicas da molecula, verificamos que a forma recombinante foi capaz de interagir com o parasita da doenca de Chagas Trypanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) ligando-se as formas tripomastigotas de T. cruzi e interferiu na invasao de celulas epiteliais em cultura. Na concentracao final de 10 ƒÊM, rINF1R bloqueou completamente a invasao e, na mesma concentracao, foi capaz de inibir o crescimento das formas epimastigotas em cultura. Para elucidar qual regiao de rINF1R era responsavel por esta atividade, um peptideo ciclico contendo a regiao do sitio reativo de rINF1R baseado na estrutura de SFTI-1 (Sun Flower Trypsin Inhibitor 1) denominado 1RSFTI foi sintetizado o qual tambem foi capaz de interferir na invasao celular de T. cruzi. Ensaios de invasao de celulas LLCMK2 por T. cruzi cepa Y utilizando diferentes inibidores de proteases sugerem que atividade proteolitica do tipo subtilisina pode ser importante para a invasao de celulas por T. cruzi. O perfil de expressao do precursor das infestinas alimentando artificialmente com sangue humano contendo extrato das formas tripomastigotas de T. cruzi mostrou aumento de expressao de duas vezes apos 12 h em relacao aos que se alimentaram apenas com sangue nas mesmas condicoes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-05-31T21:14:12Z No. of bitstreams: 1 Adriana Lima de Oliveira. Microquimerismo fetal em fêmeas de camundongos - CPqGM - Dissertação Mestrado - 2008.pdf: 3543169 bytes, checksum: e3a8306c07bffce080c07532d96950f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-31T21:14:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriana Lima de Oliveira. Microquimerismo fetal em fêmeas de camundongos - CPqGM - Dissertação Mestrado - 2008.pdf: 3543169 bytes, checksum: e3a8306c07bffce080c07532d96950f0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O papel da persistência de células fetais no organismo materno pós-gestação (microquimerismo materno-fetal) é ainda pouco estudado. Para investigar o potencial de reparo tecidual destas células em lesões de coração e músculo esquelético, avaliamos a presença de células fetais nestes órgãos durante a infecção aguda por T. cruzi de fêmeas parturientes que tiveram filhotes GFP+. Fêmeas C57Bl/6 foram infectadas com tripomastigotas da cepa Colombiana de T. cruzi no oitavo dia pós-parto e sacrificadas no 30º dia pós-infecção. A presença de células fetais GFP+ foi avaliada por citometria de fluxo (sete dias pós-parto), por imunofluorescência utilizando anticorpos anti-GFP e por PCR em tempo real usando sondas específicas para o gene GFP de origem fetal. Células fetais GFP+ foram detectadas na circulação de 20% das fêmeas analisadas. Em secções de corações e de músculo esquelético de fêmeas infectadas, detectaram-se células fetais GFP+, algumas das quais expressando miosina, um marcador de células de músculo estriado. No fígado a presença de células GFP+ também foi detectada, porém estas não apresentaram expressão de albumina. Já em secções de coração, músculo esquelético e fígado de fêmeas sadias com fetos fluorescentes não foram encontradas células GFP+. A presença do trasngene gfp de origem fetal, avaliada pela metodologia de PCR em tempo real, é aumentada pela infecção por T. cruzi no coração e músculo esquelético, em comparação com fêmeas parturientes sadias. A presença do transgene gfp de origem fetal é mais elevada no coração do que no músculo esquelético de fêmeas infectadas. Em conclusão, os resultados sugerem que células fetais participam do processo de reparo de lesões do coração e do músculo esquelético, pelo menos no modelo de infecção aguda por T. cruzi. / The role of fetal cells persistence in maternal organism after gestation (fetal-maternal microchimerism) is poorly understood. To investigate the regenerative potential of these cells in heart and muscle lesions, we evaluated the presence of fetal cells in these organs during the acute infection by T. cruzi of parturient female mice which had GFP+ puppies. C57Bl/6 female mice were infected with trypomastigotes of Colombian strain T. cruzi on the 8th day post-partum, and sacrificed on the 30º day post-infection. The presence of GFP+ fetal cells was evaluated by flow cytometry (7 days post-partum) and by immunofluorescence using anti-GFP specific antibodies and by real time PCR using specific probes for GFP gene of fetal origin 30 days post-partum. GFP+ fetal cells were detected in the circulation in 20% of the analyzed females. GFP+ cells were also detected in heart and striated muscle section of T. cruzi-infected mice, some of which expressed myosin, a marker of striated muscle cells. In the liver, GFP+ cells were also found, but none co-expressing albumin. In sections of heart, striated muscle and liver of healthy chimeric females, we did not find GFP+ cells. The presence of gfp transgene of fetal origin, evaluated by real time PCR, was increased by infection with T. cruzi in the heart and skeletal muscle, compared to healthy parturient females. The presence of gfp transgene of fetal origin is higher in the heart than in the striated muscle of infected females. In conclusion, our results suggest that fetal cells participate in the regenerative process in the heart and striated muscle, at least in the model of acute T. cruzi infection.

Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-06-06T15:32:21Z No. of bitstreams: 1 denise_gj_batista_ioc_bp_0023_2009.pdf: 5405466 bytes, checksum: 0bb4fce7e31b0593bb33cff01fa3e688 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-06T15:32:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 denise_gj_batista_ioc_bp_0023_2009.pdf: 5405466 bytes, checksum: 0bb4fce7e31b0593bb33cff01fa3e688 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / No centenario da descoberta da doenca de Chagas (DC), esta parasitose negligenciada causada pelo Trypanosoma cruzi e importante causa de mortalidade e morbidade na America Latina, sem vacinas ou agentes quimioterapicos satisfatorios. Esta tese objetivou analisar atividade, seletividade e mecanismos de acao sobre o T.cruzi de 04 classes de compostos (fluorquinolonas - FQ, tiossemicarbazonas - TS, diamidinas aromaticas - DA e arilimidamidas – AIA – uma nova classe a partir de DA) in vitro e in vivo. FQ como NOR e SPAR sao antibioticos com ampla acao bactericida, atuando sobre o DNA via toposoimerases. Embora SPAR e NOR nao tenham sido ativas, seus complexos metalicos de cobre-fenantrolina foram efetivos sobre tripomastigotas e formas intracelulares de T.cruzi, (IC50 1,62 a 4,65µM). TS sao agentes anti-tumorais e microbicidas que atuam sobre ribonucleotideo redutases e cisteina proteases. Todas TS apresentaram baixa toxicidade (>200µM) sobre celulas de mamiferos. Embora N4-metil-4-nitrobenzaldeido-tiossemicarbazona, N4-metill-4-nitroacetofenona-tiossemicarbazona e seus complexos metalicos de manganes (Mn) não tenham sido ativos, o complexo de Mn da N4-metil-4-nitrobenzofenona-tiossemicarbazona revelou-se moderadamente ativo sobre formas sanguineas (IC50 19µM). A terceira classe foi DA, ligantes de DNA com excelente atividade sobre diversos patogenos. Embora todas tenham baixa toxicidade sobre cardiomiocitos, somente tres (DB1645, DB1582 e DB1651) foram ativas contra formas sanguineas e intracelulares (IC50 entre 0,15 a 13,3µM), com atividade relacionada a curvatura das moleculas (sendo as moleculas lineares as nao efetivas). Todas DA localizam-se no nucleo e kDNA dos parasitos, com maior acumulo na ulti Analise in vitro da AIA DB766 sobre T.cruzi revelou: (i) excelente atividade sobre formas sanguineas (60nM) e intracelulares (25nM), mantendo otima acao mesmo quando o parasito e incubado com 96% de sangue de camundongo, sugerindo assim, um potencial uso profilatico, (ii) ação sobre diferentes cepas (peridomiciliares/silvestres), incluindo as naturalmente resistentes ao benznidazole (BZ), com superior eficacia que BZ, (iii) localizacao em compartimentos ricos em DNA, induzindo danos ultra-estruturais na mitocondria. Com base no excelente indice de seletividade (>533 e 714), ensaios foram conduzidos durante a infeccao aguda experimental por T.cruzi (cepas Y e Colombiana), em doses diarias ou alternadas =100mg/kg/dia da DB766 sozinha ou associada ao BZ, administradas via ip ou p.o. por ate 20 dias, com primeira dose no inicio da parasitemia. DB766 (25 e 50mg/kg/dia ip e 100mg/kg/dia p.o.) reduziu (>90%) a carga parasitaria (sangue e tecido cardiaco) e protegeu 90-100% contra mortalidade, com semelhante eficacia ao BZ. AIA reverteu inflamacao e alteracoes eletricas cardiacas e protegeu contra lesoes hepaticas e musculares induzidas pela infeccao. Doses sub-otimas de BZ associado com a DB289 (DA - pro-droga da DB75 – via p.o.) ou com a DB766 (ip) resultaram em =99% reducao de parasitemia e 100% de protecao sobre mortalidade. BZ (p.o)+DB766 (ip) resultou em cura parasitologica (2 em 15 animais) avaliada por hemocultivo e PCR. AIA foi a mais ativa e seletiva sobre T. cruzi, estimulando a continuidade de ensaios pre-clinicos com representantes desta classe visando identificacao de novos farmacos para a DC / In the centenary of the discovery of Chagas' disease (AD), this parasitosis caused by Trypanosoma cruzi neglected and important cause of morbidity and mortality in Latin America, no vaccines or chemotherapeutic agents satisfactory. This thesis aims to analyze activity, selectivity and mechanisms of action of T. cruzi on the 04 classes of compounds (fluoroquinolones - CF thiosemicarbazones - TS, aromatic diamidines - DA and arilimidamidas - AIA - a new class from DA) in vitro and in vivo. CF as NOR and SPAR are antibiotics with broad antibacterial action, acting on the DNA via toposoimerases. Although SPAR and NOR have not been active, their metallic complexes of copper-phenanthroline were effective on trypomastigotes and intracellular forms of T. cruzi (IC50 1.62 to 4.65 mM). TS are anti-tumor agents and microbicides that act on ribonucleotide reductase and cysteine ​​proteases. All TS showed low toxicity (> 200μM) on cells of mammals. Although N4-methyl-4-nitrobenzaldehyde thiosemicarbazone, N4-methyl-4-nitroacetophenone thiosemicarbazone and its metal complex of manganese (Mn) were not active, the complex of Mn N4-methyl-4-nitrobenzophenone thiosemicarbazone revealed was moderately active on blood forms (IC50 19μM). The third class was DA, DNA binders with excellent activity against many pathogens. Although all have low toxicity cardiomyocyte, only three (DB1645, DB1582 and DB1651) were active against blood forms and intracellular (IC 50 from 0.15 to 13.3 mM), activity related to the curvature of the molecules (the molecules being the non-linear effective). OF all located in the nucleus and kDNA from parasites, with greater accumulation in the ulti In vitro analysis of EIA DB766 on T.cruzi revealed: (i) excellent activity against bloodstream forms (60nm) and intracellular (25nm), while maintaining optimal action even when the parasite and incubated with 96% blood of mice, thus suggesting a potential prophylactic use, (ii) act on different strains (peridomestic / wild), including naturally resistant to benznidazole (BZ), with higher efficacy than BZ, (iii) location compartments rich DNA damage inducing ultrastructural the mitochondria . Based on the excellent selectivity index (> 533 and 714), tests were conducted during experimental acute infection by T. cruzi (Y and Colombian strains) in daily doses or alternate = 100mg/kg/day of DB766 alone or associated with BZ, administered ip or po for up to 20 days with the first dose at the onset of parasitaemia. DB766 (25 100mg/kg/day and 50mg/kg/day ip and po) reduced (> 90%) the parasite load (blood and cardiac tissue) and 90-100% protected against mortality, with similar efficacy to the BZ. EIA reversed inflammation and cardiac electrical changes and protected against liver injury induced by infection and muscle. Sub-optimal doses of BZ associated with DB289 (DA - pro-drug of DB75 - via po) or DB766 (ip) resulted in ≥ 99% reduction of parasitemia and 100% protective on mortality. BZ (po) + DB766 (ip) resulted in parasitological cure (2, 15 dogs) assessed by blood culture and PCR. EIA was the most active and selective against T. cruzi, encouraging the continuation of pre-clinical trials with representatives of this class in order to identification of new drugs for AD

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-24T16:40:43Z No. of bitstreams: 1 lysangela_r_alves_ioc_bcm_0005_2010.pdf: 12423469 bytes, checksum: 674a41c28ac9c8cf38b2ee15fb9b891b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-24T16:40:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lysangela_r_alves_ioc_bcm_0005_2010.pdf: 12423469 bytes, checksum: 674a41c28ac9c8cf38b2ee15fb9b891b (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Em tripanossomatídeos a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. Acredita-se que a estabilidade do mRNA e o acesso aos polissomos sejam fortemente regulados, permitindo ao Trypanosoma cruzi uma rápida adaptação à diferentes condições ambientais as quais está exposto durante seu ciclo de vida. A regulação pós-transcricional requer uma associação entre mRNAs e determinadas proteínas formando complexos ribonucleoprotéicos (mRNPs). Nosso objetivo foi investigar a dinâmica de associação entre os mRNAs e proteínas, isolando e caracterizando proteínas e complexos protéicos ligados a mRNAs poliA+ das frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas em fase exponencial de crescimento e epimastigotas sujeitos a estresse nutricional. As amostras obtidas foram analisadas por espectrometria de massas (LC-MS/MS) e posteriormente comparadas. Nós identificamos 542 proteínas e dentre essas 24 estavam presentes em todas as frações analisadas, enquanto que outras eram exclusivas de uma fração específica: epimastigota frações polissomal (0,37%) e pós-polissomal (2,95%); estresse frações polissomal (13,8%) e pós-polissomal (40,78%). Proteínas sabidamente envolvidas com metabolismo de mRNA foram identificadas, sendo que esse resultado é importante para confirmar a confiabilidade da nossa técnica de isolamento das mRNPs. Essa abordagem em larga escala possibilitou uma análise mais completa da composição dos mRNPs e a dinâmica durante o estresse nutricional em T. cruzi. A partir dos dados obtidos nós selecionamos 6 proteínas para caracterização: fator de elongação 1-alfa (EF1-), proteína de ligação a RNA com domínio dedo de zinco (ZF-211.70), proteína de ligação a RNA com domínio cold shock (CD-33.60), prostaglandina F 2 alfa sintase (PF2 S), prostaglandina F sintase (PFS) e uma proteína hipotética com domínio de fator de replicação A (Hip -11.150). Os anticorpos contra as proteínas EF1-, ZF-211.70, PF2S e PFS apresentaram reatividade específica com uma proteína única de tamanho esperado, já as proteínas CD-33.60 e Hip-11.150 apresentaram um reatividade baixa ou inexistente em extratos de epimastigotas e por isso não foram utilizadas para os ensaios posteriores. Ensaios de imunofluorescência, sedimentação de polissomos em gradiente de sacarose e expressão ao longo do ciclo de vida nos permitiu uma caracterização inicial das proteínas selecionadas, etapas importantes para aprofundarmos o estudo na regulação de expressão gênica em T. cruzi. / Gene regulation is mainly posttranscriptional in trypanosomatids. The stability of mRNA and access to polysomes are thought to be tightly regulated, allowing Trypanosoma cruzi to adapt to the different environmental conditions during its life cycle. Posttranscriptional regulation requires the association between mRNAs and some proteins to form mRNP complexes. We investigated the dynamic association between proteins and mRNAs, using poli(T) beads to isolate and characterize proteins and protein complexes bound to poli -A+ mRNAs. The protein content of these fractions was analyzed by mass spectrometry (LC -MS/MS). We identified 542 protein component of the mRNP complexes associated with mRNAs. Twenty-four of the proteins obtained were present in all fractions, whereas some other proteins were exclusive to a particular fraction: epimastigote polysomal (0.37%) and postpolysomal (2.95%) fractions; stress polysomal (13.8%) and postpolysomal (40.78% ) fractions. Several proteins known to be involved in mRNA metabolism were identified, and this was considered important as it made it possible to confirm the reliability of our mRNP isolation approach. This procedure allowed us to have a first insight into the composition and dynamics of mRNPs in T. cruzi. From the results obtained we selected six proteins for characterization: elongation factor 1-alpha (EF1-), zinc finger RNA binding protein (ZF-211.70), RNA binding protein with a cold-shock domain (CD-33.60), prostaglandin F 2 alfa synthase (PF2S), prostaglandin F synthase (PFS) and a hypothetical protein with a replication factor domain (Hip-11.150). The antibodies produced against EF1-, ZF-211.70, PF2S and PFS recognized a specific protein of expected size in epimastigote protein extracts; however, the CD-33.60 and Hip-11.150 antibodies did not recognized a specific protein and they were not used for further experiments. Immunofluorescence assays, polysome profile in sucrose density gradient and the expression pattern through the parasite life cyle with the selected proteins allowed us a preliminary characterization and further studies will help to elucidate the posttranscriptional regulation and the formation of RNA regulons in T. cruzi.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69316.pdf: 16389099 bytes, checksum: 74eb72078f131d9d9be7efc37391f1e6 (MD5) 69316.pdf.txt: 484412 bytes, checksum: 46c33af71747059817ce7b4a20b609af (MD5) 69316.pdf.jpg: 1433 bytes, checksum: 084dde94865696f7af0cab1566875cf5 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que representa um grave problema de saúde pública. Assim, compreender a biologia da interação T. cruzi-hospedeiros constitui um grande desafio, uma vez que o ciclo de vida deste parasito exige um repertório de adaptações para garantir sua dispersão em hospedeiros vertebrados e invertebrados. O presente estudo demonstra o potencial das proteínas com propriedade de ligação à heparina (PLHs) em atuar no ciclo biológico do T. cruzi. Durante este trabalho foi oportuno isolar uma fração de proteínas hidrofóbicas com propriedade de ligação à heparina, com massas moleculares entre 70 kDa e 59 kDa em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi por cromatografia de afinidade à heparina. A presença destas proteínas na superfície celular destes parasitos foi confirmada por ressonância plasmônica de superfície. Tais ensaios também foram decisivos na determinação da especificidade e estabilidade da ligação das PLHs a heparina, heparam sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS). Os ensaios de competição realizados indicaram que a interação entre PLHs e GAGs pode influenciar a adesão dos epimastigotas à superfície de células epiteliais do trato intestinal de Rhodnius prolixus O envolvimento de GAGs na invasão de amastigotas em cardiomiócitos, célula alvo da infecção pelo T. cruzi, também foi demonstrado através de ensaios de competição com 20 \03BCg/ml de GAGs solúveis, incluindo heparina, HS, CS, dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS). Uma drástica redução no nível de infecção foi evidenciada apenas com heparina e HS, atingindo 82% e 65% de redução da invasão, respectivamente. Ensaios com células deficientes em GAGs (CHO-745) corroboraram o importante papel destes componentes de matriz extracelular no processo de reconhecimento e invasão de amastigotas. Na continuidade deste estudo, avançamos na caracterização bioquímica de PLHs, na determinação da expressão e distribuição espacial destas proteínas em tripomastigotas. As análises por citometria de fluxo revelaram que PLHs são abundantes na superfície de tripomastigotas, clone Dm28c, e a detecção destas proteínas por imunofluorescência indireta revelou uma localização predominante na membrana flagelar do parasito. Com os ensaios de zimografia realizados neste trabalho, revelamos que as PLHs de tripomastigotas tem atividade de protease sobre gelatina em uma ampla faixa de pH (5,5 - 8,0). A sensibilidade destas enzimas a presença de inibidores de serino protease indicam que as PLHs de tripomastigotas têm propriedades similares à tripsina. O conjunto de resultados deste trabalho aponta para o importante papel das PLHs em todas as etapas do ciclo biológico do T. cruzi a partir de eventos de adesão e invasão celular, através do reconhecimento de glicosaminoglicanos sulfatados / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected tropical disease that causes a serious public health problem. Thus, understanding the biology of the T. cruzi-hosts interaction is a major challenge, since the life cycle of this parasite requires a repertoire of adaptations to ensure their dispersion in vertebrate and invertebrate hosts. The present study demonstrates the potential of proteins with heparin-binding property (HBPs) to act in the biological cycle of T. cruzi. During this study, it was opportune to isolate a hydrophobic protein fraction with property to bind to heparin, with molecular weights ranging from 70 kDa to 59 kDa, in epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi by heparin affinity chromatography. The presence of these proteins on the cell surface of these parasites was confirmed by surface plasmon resonance. These assays were also decisive in determining the specificity and stability of the binding of HBPs to heparin, heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS). The competition assays indicated that the interaction between HBPs and GAGs can influence the adhesion of the epimastigote to the surface of epithelial cells of the intestinal tract of Rhodnius prolixus. The involvement of GAGs in the invasion of amastigotes in cardiomyocytes, target cell of T. cruzi infection, was also demonstrated by competition assays with 20 μg/ml of soluble GAGs, including heparin, HS, CS, dermatan sulfate (DS) and keratan sulfate (KS). A drastic reduction in the level of infection was observed only with heparin and HS, reaching 82% and 65% reduction of the invasion, respectively. Experimental assays using cells deficient in GAGs (CHO-745) corroborated the important role of extracellular matrix components in the recognition and invasion of amastigotes. In continuation of this study, we advanced in the biochemical characterization of HBPs and also determined the expression and spatial distribution of these proteins in trypomastigotes. The flow cytometric analysis revealed that HBPs are abundant at the surface of trypomastigotes, Dm28c clone, and the detection of these proteins by indirect immunofluorescence revealed a predominant location in the flagellar membrane of the parasite. With the zymography assays conducted in this work, we revealed that HBPs of trypomastigotes have proteinase activity on gelatin in a wide pH range (5.5 - 8.0). The sensitivity of these enzymes in the presence of serine proteinase inhibitors indicates that HBPs of trypomastigotes have properties similar to trypsin. All together, the results of this study points out to the important role of HBPs at all stages of the life cycle of T. cruzi from events of adhesion and cell invasion, through the recognition of sulfated glycosaminoglycans

Made available in DSpace on 2014-07-22T17:04:59Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) samanta_xavier_ioc_dout_2013.pdf: 10283235 bytes, checksum: 159d2a0096921c251fd5eff48ab974d1 (MD5) samanta_xavier_ioc_dout_2013.pdf.txt: 417077 bytes, checksum: c2e29d62fc4bf7ee16caa4ddcfaacce7 (MD5) samanta_xavier_ioc_dout_2013.pdf.jpg: 1617 bytes, checksum: 1e2f81bb3223bf77f0d4efcfa222cec9 (MD5) Previous issue date: 2013-11-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente, os casos de doença de Chagas aguda (DCA) vêm sendo devidos à ingestão de alimento contaminado por formas infectivas do vetor, as formas metacíclicas, e/ou devido à invasão de domicílios por triatomíneos silvestres infectados atraídos pela luz. O novo perfil epidemiológico que a doença de Chagas vem adquirindo, exige um novo olhar e o delineamento de novas ferramentas na definição de medidas de vigilância e controle. O carater recorrente dos surtos de DCA demonstra que ainda não se encontrou medidas de controle efetivas dentro deste novo perfil epidemiológico. Trypanosoma cruzi é um táxon extremamente heterogêneo, inclui 6 genótipos que infectam centenas de espécies de mamíferos e vetores em ciclos de transmissão complexos com características e particularidades locais e temporais. Nosso objetivo foi avaliar a aplicação da análise geoespacial por Lógica Fuzzy, como ferramenta a ser utilizada para reconhecer áreas de risco e fornecer elementos para definição de ações sustentáveis de vigilância epidemiológica na região Amazônica. Para tanto, inicialmente geramos dados referentes à distribuição das DTUs TcIII e TcIV, descritas como típicas da Amazônia, nos biomas brasileiros Observamos que estas DTUs não estão restritas à Amazônia e sim estão amplamente dispersas na natureza tendo sido encontradas infectando seis ordens de mamíferos e distribuidas por cinco biomas. Em seguida geramos dados sobre as variáveis envolvidas no ciclo enzóotico de T. cruzi em três localidades de Abaetetuba/Pará, onde são registrados casos recorrentes de DCA. Este estudo mostrou distintos perfis enzóoticos em cada localidade sendo a infecção de cães por T. cruzi a única característica comum às áreas e sinalizadora da existência de um ciclo silvestre de transmissão em áreas de atividade humana. Esses dados nos levaram a avaliar e validar o uso de cães como sentinela de áreas de risco e a sua detecção como medida de vigilância epidemiológica. Assim, concluímos como ponto de corte para definir uma área de risco epidemiológico e a implementação de programas de sensibilização e educação a soroprevalência de cães deve ser >=30%. O conjunto destes resultados nos permitiu concluir que o ciclo enzóotico de transmissão de T. cruzi é dinâmico, sazonal, multifatorial e modifica-se conforme as condições ambientais naturais e conseqüentemente com a utilização da paisagem pelo homem Com o conjunto de variáveis gerados por nós e obtidos referentes as variáveis entomológicas, ambientais, meteorológicos (CEPETEC) e dados de casos de doença de Chagas (SINAN e SESPA). Após iniciou-se a construção de mapas protótipos de áreas de risco como forma de consolidar critérios de definição de áreas estratégicas de ação e assim prevenir novos casos de DCA. Foi testada a abordagem geoespacial por interpolação e álgebra de mapas como uma ferramenta do diagnóstico ambiental das variáveis reguladoras da transmissão de T. cruzi na natureza. O conjunto das variáveis primárias e secundárias foi tratado pelo método fuzzy de inferência espacial na construção de um modelo de integração. O modelo demonstrou a possibilidade de usar essa nova abordagem na identificação de áreas com diferentes graus de risco, permitindo uma representação contínua e integrada das variáveis envolvidas na transmissão de T. cruzi na natureza / Currently, cases of Acute Chagas Disease (ACD) have occurred due to the ingestion of food contaminated with infective forms of the vector, me tacyclic forms, and or due to the household invasion by infected triatomines attracte d by artificial light. This new Chagas disease epidemiological profile, requires a new loo k and the design of new tools for the definition of surveillance and control strategies. The character recurrent ACD outbreaks demonstrate that we still haven ́t found effective c ontrol measures for this new epidemiological profile. Trypanosoma cruzi is an extremely heterogeneous taxon that includes 6 genotypes, which infect hundreds of mamm als and vectors species within complex transmission cycles with local and temporal peculiarities.. Our objective was to evaluate the application of geospatial analysis by Fuzzy Logic as a tool to be used to recognize risk areas and provide elements for defin ing sustainable epidemiological surveillance in the Amazon region. Therefore, we in itially generated data regarding the distribution of DTUs TcIII and TcIV, described as t ypical of the Amazon, throughout other Brazilian biomes. We observed that these DTUs are n ot restricted to the Amazon but they are widely dispersed in nature as they were found i nfecting six mammalian orders and were distributed in five biomes. Then, we generated data on the variables involved in the T. cruzi enzootic cycles in three different localities of th e municipality of Abaetetuba, Pará State, where recurrent cases of ACD are registered. This s tudy revealed distinct enzootic profiles in each location. Dogs’ infection by T. cruzi was the only common feature among those areas, thus they signaling the existence of a sylvatic tra nsmission cycle in areas of human activity. These results led us to evaluate and validate the u se of dogs as sentinel of risk areas and its use as a surveillance tool. We defined that dogs’ s eroprevalence of ≥ 30% is the cut off to define an area of epidemiological risk and thus can didate to the implementation of surveillance and education programs. Altogether, th ese results allowed us to conclude that the T. cruzi enzootic transmission cycle is dynamic, seasonal, multifunctional and modifies itself according to the environmental conditions an d, consequently, with the human landscape modification. Putting together the set of variables generated by us, the assembled entomological, environmental and meteorological (CE PETEC) variables, and the data on Chagas disease cases (SINAN and SESPA), we began to build prototypes of risk maps as an approach to consolidate criteria for the demarca tion of strategic areas for the implementation of actions to prevent further ACD ca ses. We tested the geospatial interpolation and map algebra approach as a diagnos tic tool of the environmental variables which regulate the T. cruzi transmission in nature. The set of primary and sec ondary variables were treated by the fuzzy method of spati al inference in order to build an integrated model. This model demonstrated the possibility to u se this novel approach in order to identify areas with different degrees of risk, thus allowing a continuous and integrated representation of the variables involved in the T. cruzi transmission in nature

Made available in DSpace on 2014-08-11T12:37:22Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) mayara_chambela_ipec_mest_2012.pdf: 742104 bytes, checksum: 539c5f43343ecbe7c2210f60bd4c0bba (MD5) mayara_chambela_ipec_mest_2012.pdf.txt: 105697 bytes, checksum: 68a4cd335d5a44f983249fa1fd40abb1 (MD5) mayara_chambela_ipec_mest_2012.pdf.jpg: 1466 bytes, checksum: 0ef650b996154e2ccb253b8e5bdde533 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A resposta imune é muito importante para a proteção contra doenças. Estudos têm avaliado a resposta imunológica de pacientes com doença de Chagas na tentativa de explicar a fisiopatologia da doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar as concentrações das citocinas séricas IL-4, IL- 10, IL-12, TNF- e IFN- em pacientes nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas. Foi realizado um estudo caso-controle de 115 indivíduos. Os indivíduos infectados foram divididos em estágios conforme o consenso brasileiro de doença de Chagas: indeterminados ou sem cardiopatia aparente (eletrocardiograma e ecocardiograma normais); cardíacos A (eletrocardiograma alterado e ecocardiograma normal); cardíacos C (eletrocardiograma e ecocardiograma alterados com ICC compensável) e cardíacos D (eletrocardiograma e ecocardiograma alterados com ICC refratária). Também foram incluídos indivíduos não infectados pelo T. cruzi. Foram incluídos 30 pacientes indeterminados; 31 cardíacos A; 14 cardíacos C, 11 cardíacos D e 29 indivíduos não infectados Entre as citocinas pró-inflamatórias, o IFN- apresentou maior concentração sérica em relação às citocinas IL-12 e TNF- . Os cardíacos no estágio A apresentaram maiores concentrações de TNF- , entretanto houve uma queda significativa nas concentrações desta citocina à medida que observamos os estágios mais avançados da CCC. Tanto os indeterminados quanto os cardíacos apresentaram altos níveis de TFN- e IFN- e baixos níveis de IL-4 e IL-10, demonstrando um perfil predominante de Th1, com uma resposta imune não balanceada. Este estudo demonstrou uma proporcionalidade direta nas concentrações das citocinas pró-inflamatórias e antiinflamatórias em relação à FEVE, em todos os grupos de pacientes estudados, sugerindo que essa correlação poderia ser utilizada como um possível marcador de evolução para a CCC / The immune response is very important for protectio n against diseases. Studies have evaluated the immune response of patients with Chagas’ diseas e in an attempt to explain the pathophysiology of the disease. The aim of this stu dy was to evaluate serum concentrations of cytokines IL-4, IL-10, IL-12, TNF- α and IFN- in patients in different clinical forms of Chagas’ disease. We conducted a case-control study of 115 i ndividuals. Infected individuals were divided into 4 stages as the Brazilian consensus of Chagas disease: indeterminate patients or without apparent heart disease (normal electrocardiogram an d echocardiogram) cardiac patients on the stage A (electrocardiogram changes and normal echoc ardiogram), cardiac patients on the stage C (electrocardiogram and echocardiogram altered with compensable CHF) and cardiac patients on the stage D (electrocardiogram and echocardiogram c hanged with refractory CHF). Also were included uninfected individuals with T. cruzi . We included 30 indeterminate patients, 31 cardiac patients on the stage A, 14 cardiac patients on the stage C, 11 cardiac patients on the stage D and 29 uninfected individuals. Among the pro-inflammato ry cytokines, IFN- showed higher serum levels in relation to IL-12 and TNF- α . The cardiac patients on the stage A had higher concentrations of TNF- α , however, there was a significant decrease in the concentrations of this cytokine in the same time that we observed the late r stages of the CCC. Both indeterminate and cardiac patients showed high levels of TFN- α and IFN- and low levels of IL-4 and IL-10, demonstrating a dominant Th1 profile with an imbala nced immune response. This study demonstrated a direct proportionality in concentrat ions of pro-inflammatory and anti- inflammatory cytokines with respect to the LVEF in all groups of patients, suggesting that this correlation could be used as a marker of progressio n to CCC.