Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T20:14:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-29T18:49:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T18:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) Previous issue date: 2014 / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é responsável por uma significante mortalidade e morbidade nas Américas Central e do Sul, afetando um número significativo da população mundial. A doença desenvolveu-se ao longo de décadas e a presença de mediadores inflamatórios e a hipertrofia cardíaca são características comuns. Buscando uma compreensão dos mecanismos moleculares que ocorrem no processo inflamatório e que subsidiem a caracterização de marcadores moleculares na patologia chagásica, a proteína COX-2 tornou se objeto de estudo. Sabe- se que a regulação desta proteína pode se dar a nível transcricional e/ou pós traducional, envolvendo um conjunto de fatores protéicos e incluindo a participação de miRNAs. Estudos recentes tem mostrado uma possível co-regulação indireta entre os níveis de PTEN e de COX-2, mas até o momento, os resultados preliminares ainda não elucidaram esses mecanismos. Particularmente, em relação à Doença de Chagas, poucos são os estudos que focam na elucidação do processamento do mRNAs na doença e nos fatores que co-regulam a proteína COX-2. Sendo assim, objetivou se nesse estudo analisar os moduladores do processo pró-inflamatório/ hipertrófico em células H9c2 infectadas pela cepa Berenice-62 do T.cruzi, buscando a caracterização de marcadores moleculares do processo inicial da Doença de Chagas. Para isso, os tempos de infecção de 0, 2, 6, 12, 24 e 48 horas foram estudados, logo após 2 horas de interação com o parasito. A comprovação da infectividade foi feita por ensaios de microscopia pela coloração com Giemsa e Dapi. A análise transcricional de genes correlatos ao processo inflamatório/ hipertrófico e de microRNAs foram realizados por ensaios de qRT-PCRs e as análises das proteínas COX-2, PTEN, P-PTEN foram investigadas nos ensaios de Western blots. Outros ensaios bioquímicos, como o de viabilidade celular e o de mensuração de prostaglandina E2, foram realizados. Com os resultados, conclui-se que a infecção com a cepa Be-62 diminui a viabilidade celular após 48 horas de infecção e modula os níveis de expressão dos marcadores de hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β –myhc, além de modular o ambiente pró-inflamatório nos intervalos iniciais de infecção, considerando-se o aumento da expressão e da atividade da proteína COX-2 e no aumento na produção de PGE2. Os resultados também demonstraram uma relação entre os genes Cox-2, Pten, Akt, sugerindo uma possível correlação cruzada entre COX-2 e PTEN. Os microRNAs-26b, -463,-1 e -21, respectivamente, indicaram uma possível regulação pós-traducional das proteínas COX-2 e PTEN, demonstrando um papel fundamental na instalação do quadro de hipertrofia. Estudos futuros poderão validar o papel dessas moléculas como marcadores moleculares e espera-se que os resultados do presente estudo possam direcionar a caracterização de moléculas que auxiliem no prognóstico e tratamento da doença de maneira direcionada, considerando-se a grande variabilidade genética das cepas do T. cruzi. ____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is responsible for significant mortality and morbidity in Central and South America, affecting a significant number of the world population. The disease develops over decades and the presence of inflammatory mediators and cardiac hypertrophy are common features. Searching for an understanding of the molecular mechanisms that occur during the inflammatory process, and that subsidize the characterization of molecular markers in Chagas disease, COX - 2 protein became an object of study. It is known that the regulation of this protein can occur at transcriptional and/ or post- translational level, involving a number of protein factors and including the involvement of miRNAs. Recent studies have shown a possible indirect co-regulation in the levels of PTEN and COX - 2, but so far the preliminary results not yet elucidated these mechanisms. Particularly in relation to Chagas disease, there are few studies that focus on the elucidation of the processing of mRNAs in this disease and in the factors that co - regulate COX - 2 protein. Therefore, this study was aimed to analyze the hypertrophic/ proinflammatory process modulators in H9c2 cells infected with strain Berenice -62 of the Trypanosoma cruzi, searching for characterize the molecular markers of the initial process of Chagas disease. For this reason, the time of infection of 0, 2, 6, 12, 24 and 48 hours were studied soon after 2 hours from the interaction with the parasite. The proof of the infectivity was performed by microscopy assays by the staining with Giemsa and Dapi. The transcriptional analysis of genes related to the inflammatory / hypertrophic process and microRNAs were performed by qRT- PCR assays and the analyzes of COX-2, PTEN, PTEN - P proteins were explored in Western blots assays. Other biochemical assays such as cell viability and measurement of prostaglandin E2 were performed. From the results, it is concluded that infection with Be- 62 strain decreases cell viability after 48 hours of infection and modulates the levels of expression of markers of cardiac hypertrophy Anf and Bnp β - myhc, in addition to modulate the environment pro-inflammatory in the initial intervals of infections, considering the increased expression and COX -2 protein activity and in the increased production of PGE2. The results also demonstrated a relationship among cox-2, pten, akt genes suggesting a possible cross- correlation between COX-2 and PTEN. MicroRNAs-26b, - 463, -21 and -1 respectively indicate a possible posttranslational regulation of COX-2 and PTEN protein, demonstrating a crucial role in the installation of hypertrophy. Future studies could validate the role of these molecules as molecular markers and it is expected that the results of this study may direct the characterization of molecules that assist in the prognosis and treatment of disease in targeted way, considering the high genetic variability of strains of T. cruzi.

Orientador : Dr. Samuel Goldenberg / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2007 / Inclui bibliografia / O Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, que continua sendo um importante problema de saúde pública na América Latina. Os estudos sobre o T. cruzi têm sido facilitados pela possibilidade de cultivo e diferenciação in vitro dos principais estágios evolutivos do parasita. Este trabalho aborda o estudo de aspectos morfológicos e moleculares da diferenciação in vitro de tripomastigotas metacíclicos para amastigotas (amastigogênese extracelular). Extensas mudanças morfológicas foram caracterizadas por microscopia óptica e eletrônica durante a diferenciação, como brotamento, crescimento e liberação de uma estrutura muito semelhante à forma amastigota, com capacidade replicativa e positiva para a marcação com o anticorpo alfa-Ssp-4 específico para amastigotas. Análises por espectrometria de massas mostraram que o perfil lipídico total é alterado, com aumento na proporção de liso-lipídios durante a diferenciação, podendo estar correlacionado às alterações morfológicas observadas no processo de amastigogênese. Com o intuito de obter amostras enriquecidas de membrana plasmática, foi elaborada uma nova estratégia, baseada na interação biotina/avidina. Tal estratégia visou o estudo mais detalhado dos constituintes da membrana, visto que foi observada alteração em sua forma, sugerindo sua relevância para o processo de diferenciação. Foram também feitas análises do transcritoma de amastigotas extracelulares utilizando microarranjos de DNA, comparando-os com os demais estágios, principalmente tripomastigotas metacíclicos e amastigotas obtidos de cultura de células. Estas análises proporcionaram uma visão geral dos grupos de genes diferencialmente expressos entre tripomastigotas metacíclicos e amastigotas extracelulares, no qual se pode destacar como aumentados em amastigotas genes envolvidos na replicação, reparo e transcrição do DNA, e no processamento de RNA. Também foram detectados genes com o mesmo padrão de expressão em amastigotas extracelulares e amastigotas de cultura de célula, sugerindo a proximidade entre os dois tipos de formas replicativas intracelulares. Tais grupos gênicos podem ser agora melhor investigados, corroborando para a elucidação dos mecanismos de regulação de sua expressão, suas funções em cada estágio e sua importância durante a diferenciação. Os dados aqui apresentados abrem muitas perspectivas para a investigação da amastigogênese, um fenômeno ainda pouco conhecido, de vital importância para o T. cruzi e que pode conter novas informações para o desenvolvimento de terapias para doença de Chagas. / Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas’ disease, which still represents an important public health problem in Latin America. Studies on T. cruzi have been rendered feasible by the possibility to reproduce under in vitro culture conditions the life-cycle of the parasite. This work is focused on the description of the morphological and molecular changes occurring in the course of the in vitro differentiation of metacyclic trypomastigotes to amastigotes (extracellular amastigogenesis). The morphological changes have been characterized by optical and electron microscopy investigation during differentiation, including budding, development and release of a structure resembling to amastigote forms. These extracellular amastigotes are able to replicate and react with an antibody against the Ssp-4 antigen, which is specific for amastigotes. Mass-spectrometry analyses have shown total lipid profile changes during amastigogenesis, with an increase in lyso-lipids ratios during differentiation; this could be related to morphological alterations observed in the course of the amastigogenesis process. In order to obtain plasma membrane enriched samples, a new strategy was elaborated based on biotin/avidin affinity purification. The strategy aims to identify plasma membrane and its components, since important morphological changes occur during amastigogenesis which are very likely relevant to differentiation process. Furthermore, the transcriptome analysis of extracellular amastigotes is described using DNA microarrays to compare metacyclic trypomastigotes and cell culture derived amastigotes. These analyses allowed a broad comparison between metacyclic trypomastigotes and extracellular amastigotes differentially expressed group of genes, such as those involved in replication, repairing and transcription of DNA, and processing of RNA, almost all of them more expressed in extracellular amastigotes. Genes presenting similar expression patterns have been also observed in extracellular and intracellular amastigotes, suggesting the similarity between these developmental forms. These genes are being investigated in order to get further insight into the mechanisms involved in their expression regulation and their relevance to the differentiation process. The data presented herewith pave the way to investigate the amastigogenesis process, an important step of T. cruzi life-cycle.

Em Trypanosoma cruzi os sítios de replicação estão localizados na periferia nuclear. A fim de entender a dinâmica das moléculas envolvidas na replicação, Orc/Cdc6 foi usado como marcador da maquinaria de pré-replicação e PCNA como marcador da maquinaria de replicação durante o ciclo celular da forma epimastigota. Ambas as moléculas apresentaram dois padrões de localização nuclear: padrão disperso e periférico. Em ensaio de dupla marcação três combinações dos padrões de Orc/Cdc6 e TcPCNA foram encontrados durante G1/S: Orc/Cdc6 periférico e PCNA disperso, ambos dispersos e ambos periféricos. Por meio destes resultados pudemos concluir que durante G1 ambas as moléculas se encontram dispersas. Ao final desta fase, Orc/Cdc6 migra para periferia nuclear enquanto PCNA permanece disperso, migrando para a periferia nuclear quando a célula entra em S, quando a replicação do DNA irá ocorrer. Assim, a replicação na periferia nuclear não se deve à localização prévia das moléculas de replicação nesta região, mas sim à migração destas moléculas para os sítios apropriados. / In Trypanosoma cruzi the replication sites are located at nuclear periphery. In order to analyse the dynamics of molecules involved in replication, Orc/Cdc6 was used as a marker of pre-replication machinery and PCNA as a marker of replication machinery during the cell cycle of epimastigote form. Both molecules presented two nuclear patterns: dispersed pattern and peripheral pattern. Double-labeling assay showed three different patterns of Orc/Cdc6 and PCNA in the nucleus: Orc/Cdc6 at nuclear periphery and PCNA dispersed, both dispersed and both at nuclear periphery. This data allowed us to conclude that during early G1 phase both molecules are dispersed in the nucleus and during late G1 Orc/Cdc6 goes to nuclear periphery while TcPCNA remains dispersed, moving to nuclear periphery, where DNA replication will take place, when S phase starts. Thus, the replication of DNA at nuclear periphery is not due to localization of replications factors at nuclear periphery; instead it depends on the movement of these factors to the appropriated sites.

Em Trypanosoma cruzi os sítios de replicação estão localizados na periferia nuclear. A fim de entender a dinâmica das moléculas envolvidas na replicação, Orc/Cdc6 foi usado como marcador da maquinaria de pré-replicação e PCNA como marcador da maquinaria de replicação durante o ciclo celular da forma epimastigota. Ambas as moléculas apresentaram dois padrões de localização nuclear: padrão disperso e periférico. Em ensaio de dupla marcação três combinações dos padrões de Orc/Cdc6 e TcPCNA foram encontrados durante G1/S: Orc/Cdc6 periférico e PCNA disperso, ambos dispersos e ambos periféricos. Por meio destes resultados pudemos concluir que durante G1 ambas as moléculas se encontram dispersas. Ao final desta fase, Orc/Cdc6 migra para periferia nuclear enquanto PCNA permanece disperso, migrando para a periferia nuclear quando a célula entra em S, quando a replicação do DNA irá ocorrer. Assim, a replicação na periferia nuclear não se deve à localização prévia das moléculas de replicação nesta região, mas sim à migração destas moléculas para os sítios apropriados. / In Trypanosoma cruzi the replication sites are located at nuclear periphery. In order to analyse the dynamics of molecules involved in replication, Orc/Cdc6 was used as a marker of pre-replication machinery and PCNA as a marker of replication machinery during the cell cycle of epimastigote form. Both molecules presented two nuclear patterns: dispersed pattern and peripheral pattern. Double-labeling assay showed three different patterns of Orc/Cdc6 and PCNA in the nucleus: Orc/Cdc6 at nuclear periphery and PCNA dispersed, both dispersed and both at nuclear periphery. This data allowed us to conclude that during early G1 phase both molecules are dispersed in the nucleus and during late G1 Orc/Cdc6 goes to nuclear periphery while TcPCNA remains dispersed, moving to nuclear periphery, where DNA replication will take place, when S phase starts. Thus, the replication of DNA at nuclear periphery is not due to localization of replications factors at nuclear periphery; instead it depends on the movement of these factors to the appropriated sites.

Orientador: Hyun Mo Yang / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Cientifica / Made available in DSpace on 2018-08-15T07:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_LiciaSilva_M.pdf: 2109455 bytes, checksum: 069de481ab0344fa7d803510e59bfd4a (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A ação da resposta imunológica na infecção de Trypanosoma cruzi envolve dois mecanismos: um que resulta na produçao de anticorpos específicos contra antígenos do parasita e outro correponde a resposta imunológica celular com atividade citotoxica, que mata as celulas infectadas ou aqueles que expressam antígeno parasitario pela acao de linfócitos T citotóxicos. Com o objetivo de abordar o processo de infeccao por Trypanosoma cruzi e o mecanismo de delimitacao no organismo do hospedeiro promovida pelo sistema imunologico, dois modelos matematicos da interacao entre sistema imune e Trypanosoma cruzi são apresentadas. Apesar da simplicidade da dinamica das populacoes isoladas de organismos patogenicos e das celulas, a descriçao da interacao entre eles se torna altamente complexo. Assim, apresentamos o desenvolvimento de dois modelos simplificados pela necessidade de anaílise quantitativa das respostas humoral e celular / Abstract: The action of the immune response in the infection of Trypanosoma cruzi involves two mechanisms: one that results in the production of specific antibodies against antigens of the parasite and the cellular immune response with cytotoxic activity, which kills infected cells or those expressing antigen parasitic by the action of cytotoxic T lymphocytes. Aiming to address the process of infection by Trypanosoma cruzi and the mechanism of delimitation in the organism of the host promoted by immune system, two mathematical models of the interaction between system immune and Trypanosoma cruzi are presented. Despite of the simplicity of the dynamic of the isolated populations of pathogen and the cells, the description of the interaction of them becomes highly complex. Hence, we present the development of two simplified models by the necessity of quantitative analysis of humoral e cell responses / Mestrado / Biomatematica / Mestre em Matemática Aplicada

Orientador: Hyun Mo Yang / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_LuizFernandodeSouza_M.pdf: 2050755 bytes, checksum: 1743132cb43cdc46b8799405dfa205c2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O organismo humano possui um complexo sistema de defesa: o sistema imunológico. Tal sistema apresenta diferentes respostas para diferentes ataques ao organismo. A co-infecção por parasitas como protozoário Tripanossoma cruzi e o vírus HIV aciona dois importantes mecanismos de defesa: a imunidade humoral a imunidade celular. Devido à fase crônica da Doença de Chagas, na maioria dos casos assintomática, esta é reativada quando as principais células de defesa do corpo, linfócitos T CD4 não ativos, sucumbem pela ação do vírus HIV. Com o objetivo de estudar a dinâmica de co-infecção por parte das doenças, Doença de Chagas e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, a resposta do sistema imunológico humano, um modelo matemático de equações diferenciais ordinárias autônomas não linear é elaborado. Tal modelo apresenta de forma simplificada a dinâmica entre sistema imunológico, protozoário Tripanossoma cruzi, vírus HIV e células alvo. Após simplificações, obtemos dois sub modelos, com o objetivo de elucidar os mecanismos de defesa do sistema imunológico: imunidade humoral e imunidade celular. A análise quantitativa dos modelos de imunidade faz-se necessária devido a suas complexidades. Sub casos são abordados, com o objetivo de avaliar a eficiência de anticorpos e células que secretam citocinas / Abstract: The human body has a complex system of defense: the immune system. Such a system has different answers for different attacks to the body. Co-infection by parasites such as Trypanossoma cruzi and HIV triggers two important defense mechanisms: humoral immunity cellular immunity. Due to the chronic phase of Chagas's disease, in most cases asymptomatic, it is reactivated, when the main defense cells of the body, linfocity T CD4 no active, succumb by the action of HIV. Aiming to study the dynamics of co-infection by the disease, Chagas's Disease and Acquired Immunode ficiency Syndrome, the response of the human immune system, a mathematical model of autonomous ordinary differential equations nonlinear is elaborate. This model presents a simplified dynamic among the immune system, protozoan Trypanossoma cruzi, HIV and target cells. After simplifications, we get two sub models, aiming to elucidate the defense mechanisms of the immune system: humoral and cellular immunity. Quantitative analysis of models of immunity is necessary due to its complexities. Sub cases are dealt with to evaluate the effectiveness of antibodies and cells that secrete cytokines / Mestrado / Matematica Aplicada / Mestre em Matemática Aplicada