SUMOylation and ubiquitination are important post-translational modifications. While ubiquitination is well known for targeting proteins for degradation, SUMOylation often regulates the intracellular localization of substrates. In the first project of this dissertation, we developed proteomic strategies to identify novel SUMOylated proteins in mammalian cells. In the second project, we investigated the regulation of protein ubiquitination in the NF-κB signaling pathway in the context of Paget’s disease of bone (PDB). Identification of SUMOylated proteins has been a challenge because of low abundance of SUMOylation substrates. Here, we utilized a mass spectrometry (MS)-based proteomic approach to identify novel SUMOylated proteins in mammalian cells. Seventy-four unique proteins were commonly identified in the collection of four SUMO-1 plasmids, thus considered candidate SUMOylated proteins. Many of these proteins are associated with the nucleus. The results were validated by confirming SUMOylation of a novel substrate Drebrin and a well known substrate Ran-GAP1. Furthermore, the potential SUMOylation sites in Drebrin have been identified and confirmed using site-directed mutagenesis. PDB is a disorder characterized by increased bone turnover containing hyperactive osteoclasts. Mutations in Sequestosome 1 (p62) are associated with 40% of familial PDB. P62 is a scaffold protein and plays a critical role in regulating ubiquitination of TRAF family signaling molecules and mediating the activation of NF-κB by RANK and TNFα ligands. P62 also plays a critical role in shuttling substrates for autophagic degradation. The objective of this project is to determine the effects of PDB-associated p62 mutants on NF-κB signaling and autophagy. We compared the effect of wild-type (WT) p62 and PDB mutations (A381V, M404V and P392L) on the TNFα-induced NF-κB signaling using an NF-κB luciferase assay. Our results show that these p62 mutations increased the NF-κB signaling. In addition, we found that the PDB mutations did not change the interaction between p62 and the autophagy marker protein LC3. In summary, the PDB mutations in p62 are likely gain-of-function mutations that can increase NF-κB signaling and potentially contribute to disease progression. Based on the results, we proposed a model to speculate the synergetic role of p62 PDB mutant on NF-κB signaling and autophagy.

La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée depuis Caenorhabditis elegans jusqu'aux mammifères en passant par Drosophila melanogaster. Elle est requise dès le développement embryonnaire et contrôle de nombreux processus comme la différenciation et le choix du destin cellulaire, la prolifération, ou encore le maintien de stocks de cellules souches et l'apoptose. La voie est basée sur l'activité du récepteur Notch, un hétérodimère transmembranaire qui est activé lors de contacts intercellulaires par la liaison de ses ligands qui sont également des protéines transmembranaires. Suite à cette activation, le récepteur subit une série de deux clivages protéolytiques internes, respectivement catalysés par une métalloprotéase ADAM et par le complexe multi-protéique γ-secrétase. Ce dernier clivage libère le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, cette forme étant ensuite transportée dans le noyau où elle active directement la transcription des gènes cibles de la voie Notch en se liant à ses co-facteurs de transcription, CSL et Mastermind. Le récepteur Notch est régulé à diverses étapes par des processus d'ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé et endocytosé contrôle sa dégradation dans les lysosomes. Les processus d'ubiquitination sont réversiblement contrôlés par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n'a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases - les enzymes responsables de la déubiquitination - impliquées dans les deux processus d'ubiquitination décrits précédemment. Nous avons pour cela mis au point deux cribles en immunofluorescence permettant de tester une banque de shRNA qui cible l'expression des 91 déubiquitinases connues ou putatives du génome humain. Le premier crible m'a permis d'identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d'initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle protéine portant une activité déubiquitinase. eIF3f est recrutée au récepteur Notch via l'E3 ubiquitine ligase Deltex, et régule positivement la voie de signalisation Notch en déubiquitinant le récepteur Notch activé avant le clivage γ-secrétase, favorisant ainsi la production de la forme transcriptionnellement active de Notch. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs déubiquitinases candidates, dont le rôle dans la régulation du trafic intracellulaire du récepteur Notch non activé est en cours de validation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les molécules classiques du CMH de classe II sont responsables de la présentation de peptides exogènes par les cellules présentatrices d’antigène aux lymphocytes T CD4+. Cette présentation antigénique est essentielle à l’établissement d’une réponse immunitaire adaptative. Cependant, la reconnaissance d’auto-antigènes ainsi que l’élimination des cellules du Soi sont des problèmes à l’origine de nombreuses maladies auto-immunes. Notamment, le diabète et la sclérose en plaque. D’éventuels traitements de ces maladies pourraient impliquer la manipulation de la présentation antigénique chez les cellules dont la reconnaissance et l’élimination engendrent ces maladies. Il est donc primordial d’approfondir nos connaissances en ce qui concerne les mécanismes de régulation de la présentation antigénique. La présentation antigénique est régulée tant au niveau transcriptionnel que post-traductionnel. Au niveau post-traductionnel, diverses cytokines affectent le processus. Parmi celles-ci, l’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, cause une rétention intracellulaire des molécules du CMH II. Son mécanisme d’action consiste en l’ubiquitination de la queue cytoplasmique de la chaîne bêta des molécules de CMH II. Cette modification protéique est effectuée par MARCH1, une E3 ubiquitine ligase dont l’expression est restreinte aux organes lymphoïdes secondaires. Jusqu’à tout récemment, il y avait très peu de connaissance concernant la structure et les cibles de MARCH1. Considérant son impact majeur sur la présentation antigénique, nous nous sommes intéressé à la structure-fonction de cette molécule afin de mieux caractériser sa régulation ainsi que les diverses conditions nécessaires à son fonctionnement. Dans un premier article, nous avons étudié la régulation de l’expression de MARCH1 au niveau protéique. Nos résultats ont révélé l’autorégulation de la molécule par formation de dimères et son autoubiquitination. Nous avons également démontré l’importance des domaines transmembranaires de MARCH1 dans la formation de dimères et l’interaction avec le CMH II. Dans un second article, nous avons investigué l’importance de la localisation de MARCH1 pour sa fonction. Les résultats obtenus montrent la fonctionnalité des motifs de localisation de la portion C-terminale de MARCH1 ainsi que la présence d’autres éléments de localisation dans la portion N-terminale de la protéine. Les nombreux mutants utilisés pour ce projet nous ont permis d’identifier un motif ‘‘VQNC’’, situé dans la portion cytoplasmique C-terminale de MARCH1, dont la valine est requise au fonctionnement optimal de la molécule. En effet, la mutation de la valine engendre une diminution de la fonction de la molécule et des expériences de BRET ont démontré une modification de l’orientation spatiale des queues cytoplasmiques. De plus, une recherche d’homologie de séquence a révélé la présence de ce même motif dans d’autres ubiquitines ligases, dont Parkin. Parkin est fortement exprimée dans le cerveau et agirait, entre autre, sur la dégradation des agrégats protéiques. La dysfonction de Parkin cause l’accumulation de ces agrégats, nommés corps de Lewy, qui entraînent des déficiences au niveau du fonctionnement neural observé chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. La valine comprise dans le motif ‘’VQNC’’ a d’ailleurs été identifiée comme étant mutée au sein d’une famille où cette maladie est génétiquement transmise. Nous croyons que l’importance de ce motif ne se restreint pas à MARCH1, mais serait généralisée à d’autres E3 ligases. Ce projet de recherche a permis de caractériser des mécanismes de régulation de MARCH1 ainsi que de découvrir divers éléments structuraux requis à sa fonction. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de contrôle de la présentation antigénique par les molécules de CMH II. / Classical MHC class II molecules are responsible for the presentation of exogenous peptides to CD4+ T cells, which is essential for the establishment of the adaptive immune response. However, problems with recognition of auto-antigens and the subsequent cell elimination are at the root of numerous autoimmune diseases. Manipulation of the antigen presentation pathway in order to eliminate cells that present self-antigens could serve as potential treatments of many autoimmune disorders. It is therefore essential to deepen our knowledge regarding the mechanisms regulating antigen presentation. Antigen presentation is regulated both transcriptionally and post-translationally. Whereas many cytokines affect the latter, IL-10, an anti-inflammatory cytokine, causes the intracellular retention of MHC II molecules. This phenotype is the result of the ubiquitination of MHC II -chain cytoplasmic tail by MARCH1. MARCH1 is an E3 ubiquitin ligase expressed in secondary lymphoid organs. Until recently, little was known about the structure-function and the targets of MARCH1. Considering its major impact on antigen presentation, we were interested to study this E3 ligase in order to reveal how it is regulated and what are the required conditions for its function. In a first report, we have investigated the regulation of MARCH1’s protein expression. Our results revealed its autoregulation via dimer formation and autoubiquitination. In addition, we have demonstrated the involvement of MARCH1’s transmembrane domains for dimerization and MHC II interaction. In a second article, we highlighted the importance of MARCH1 localization for its function. Our results indicated that localization motifs in the C-terminal portion of MARCH1 were functional and revealed the presence of some sorting elements in the N-terminal portion of the molecule. A panel of mutant were used and allowed us to identify a ‘’VQNC’’ motif, located in the C-terminal cytoplasmic portion of MARCH1, in which the valine is central for the molecule’s function. Indeed, point-mutation of the valine led to a decrease in MARCH1 ability to relocate MHC II whereas BRET experiments revealed a modification in the spatial organization of the cytoplasmic tails. Moreover, a blast of sequence homology showed the presence or that same motif in others ubiquitine ligases, one of which is Parkin. Parkin is highly expressed in the brain and seems to be implicated in protein aggregates’ degradation. It was reported that malfunction of Parkin leads to the accumulation of aggregates, called Lewy bodies, responsible for the neural functions deficiencies observed in patients with Parkinson disease. Interestingly, a family for which the sickness was genetically transmitted has a mutated valine in the VQNC motif. We believe that the importance of this motif is not restricted to MARCH1 and could be generalized to others E3 ubiquitin ligases. This project enabled us to characterize the regulation mechanisms of MARCH1. In addition, we discovered various structural elements required for its function. Altogether, our data allows for a better understanding of the mechanisms controlling MHC II molecules antigen presentation.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24194号 / 医博第4888号 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 伊藤 能永, 教授 中川 一路 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

<p>Proteins belonging to the Cbl family are multidomain scaffolds that participate in numerous processes, assembling signaling complexes and mediating attachment of ubiquitin to receptor and non-receptor tyrosine kinases.</p><p>We characterized a novel role for Cbl and Cbl-b in ligand-dependent internalization of growth factor receptors. Upon stimulation with epidermal growth factor (EGF), Cbl proteins associate with EGF receptor, become phosphorylated, and bind to the three SH3 domains of CIN85, which brings endophilins to the complex with active receptors. Endophilins can induce internalization of the plasma membrane, contributing to formation of clathrin-coated pits. We identified a minimal binding domain for CIN85 in the carboxyl termini of Cbl/Cbl-b and observed constitutive association between CIN85, Cbl/Cbl-b and oncogenically stimulated receptor tyrosine kinases. In addition to functioning as a ubiquitin ligase, Cbl forms a complex with CIN85 and endophilin, which is required for efficient endocytosis and downregulation of membrane receptors.</p><p>In EGF stimulated cells, we observed inducible modification of CIN85 and related CMS proteins by attachment of a single ubiquitin molecule. Monoubiquitination of CIN85 was mediated by the RING finger and dependent on the carboxyl terminal part of Cbl/Cbl-b, and demanded an intact carboxyl terminus of CIN85. Prolonged stimulation with EGF induced concomitant degradation of EGF receptors, Cbl, and monoubiquitinated forms of CIN85 in lysosomes.</p><p>Cbl regulates cytoskeletal processes in a variety of cell systems. We identified SH3P2, a protein with SH3 domain and ankyrin repeats, as a Cbl partner and described its phosphorylation by Src and its distribution in fibroblasts and osteoclasts. SH3P2 formed inducible complexes with Cbl and actin in spread cells and colocalized with dynamic actin structures.</p><p>Our data contribute to better understanding of the role of Cbl in downregulation of receptor tyrosine kinases as well as in controlling actin rearrangement.</p>