Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-05-25Bitstream added on 2014-06-13T19:28:49Z : No. of bitstreams: 1 silva_im_me_rcla.pdf: 340011 bytes, checksum: 05cf698f37e837803ba622b1fe6bf9e7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As cianotoxinas são produzidas por diversos gêneros de cianobactérias, possuem ação hepatotóxica e foram as responsáveis por vários casos de intoxicação em mamíferos. Estudos com hortaliças têm demonstrado os efeitos das microcistinas (MCs) sobre a germinação de sementes, o desenvolvimento das plântulas e o metabolismo, além do acúmulo nos tecidos foliares. O que caracteriza uma importante via de contaminação para o homem através da irrigação com água contendo cianotoxinas. Esse trabalho teve como objetivo investigar os efeitos da aplicação de extrato bruto de Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing, com linhagem produtora e não produtora de MCs, para a germinação de sementes, e o desenvolvimento de plântulas e plantas de rúcula, variedade Folha larga. Sementes germinadas em papel mata-borrão foram expostas a concentrações entre 0,5 a 100 μg.L-1 de MC-LR equivalente durante sete dias. Plantas cultivadas em vasos contendo substrato comercial para hortaliça foram irrigadas com solução aquosa contendo 0,5 a 10 μg.L-1 de MC-totais, ou seja, considerando todas as variantes presentes no extrato com MC. Valores de massa seca correspondentes foram empregados para o tratamento com extrato bruto sem microcistina, além de controle com água. Os resultados mostraram que MC-LR equivalente causou inibição de 30% no comprimento da parte aérea das plântulas e aumento na atividade da enzima peroxidase (POD). As concentrações aplicadas de MC-totais causaram o aumento na atividade da POD apenas para a planta jovem (folhas e raízes). Com isso, os resultados indicaram que não houve efeitos alelopáticos na germinação de sementes e na formação das plântulas, cujas sementes não foram susceptíveis aos tratamentos. O mesmo ocorreu com as plantas jovens e adultas expostas aos extratos brutos, nas concentrações testadas de MC-totais. Houve diferença no estresse... / Cyanotoxins are produced by several cyanobacteria genera. They have hepatotoxic action and have been responsible for several cases of intoxication. Studies on vegetables have shown the effects of microcystins (MCs) in seed germination, seedling development and metabolism. Another concern is the crop irrigation with water containing cyanotoxins due to the possibility of toxin accumulation in leaf tissues. This characterizes an important route of contamination to humans. The aim of this study was to investigate the effects of non-purified extracts of Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing in the germination of seeds, development of seedlings and plants of rocket (large-leaf variety). Effects of both, toxic and non-toxic strains, were evaluated. Seeds were germinated on filter paper and than exposed to MC solution (concentrations ranging from 0,5 to 100,0 μg.L-1 of MC-LR equivalent) during seven days. Plants growing in commercial substrate for vegetable were irrigated with MC solution (concentrations ranging from 0,5 to 10,0 μg.L-1 de MC-total). Treatments containing the non-toxic strain extract (dry mass equivalent of the toxic treatment) and water (negative control) were carried out together with the toxic ones. MC-LR equivalent treatment caused inhibition of 30% in shoot length and increased activity of peroxidase (POD) in seedlings. The applied concentrations of MC-total caused increase in POD activity in young plant (leaves and roots). On the other hand, allelopathic effects were not found either on seeds germination or seedling development. Also, no allelopathic effects were found in the juvenile and adult plants exposed to extracts with any of the MC-total concentrations. Young and adult plants had different oxidative stress responses when exposed to extracts of the MCs-producing strain. Therefore, future studies should be conducted with individuals at the young stages of ... (Complete abstract click electronic access below)

Crotalfina é um peptídeo sintetizado a partir da sequência de um composto analgésico purificado do veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus. Apesar da atividade opióide, ensaios moleculares indicam que esse peptídeo não se liga diretamente aos receptores opióides, sugerindo que a liberação de opióides endógenos sejam os responsáveis pela atividade analgésica. Baseado em dados da literatura que demonstram a estreita relação entre o sistema canabinóide e o sistema opióide, o objetivo deste projeto foi avaliar o possível efeito da crotalfina sobre o sistema canabinóide. Os resultados indicam que receptores canabinóides CB2 estão envolvidos na antinocicepção acarretada pela crotalfina, na vigência de hiperalgesia induzida por PGE2. Ainda, este efeito é dependente de liberação de opióides endógenos, particularmente dinorfina A, agonista endógeno de receptores opióides do tipo kappa, sendo essa liberação dependente da ativação de receptores CB2. / Crotalphine is a peptide synthesized based on the sequence of the analgesic compound purified from the Crotalus durissus terrificus snake venom. Despite the opioid activity, molecular assays indicate that this peptide does not directly bind to opioid receptors, suggesting that the endogenous opioid release could be responsible for analgesic activity. Based on data from literature demonstrating the close relationship between the cannabinoid and the opioid systems, the goal of this project was to evaluate the possible effect of crotalphine on the cannabinoid system. Results demonstrated that CB2 cannabinoid receptors are involved in the antinociception induced by crotalphine during PGE2-induced hyperalgesia. In agreement, this effect is dependent of the release of endogenous opioids, particularly dynorphin A, the endogenous agonist of kappa opioid receptors. This release is dependent of the CB2 receptor activation.

O adrenoceptor <font face=\"symbol\">b está presente na glândula de veneno de Bothrops jararaca, tanto no estado quiescente como no ativado por 4 dias, entretanto, quando estimulado, aumenta os níveis de AMPc somente em células secretoras no estado quiescente. Neste trabalho, estudamos funcionalmente o adrenoceptor <font face=\"symbol\">b durante o ciclo de produção de veneno e verificamos a sua função. Mostramos que a estimulação do adrenoceptor <font face=\"symbol\">b promove aumento na taxa de acidificação do meio extracelular em células quiescentes e ativadas por 4 dias, mas não por 15 dias. Em células quiescentes, a estimulação do adrenoceptor <font face=\"symbol\">b também promove o influxo de cálcio, via canais operados por voltagem e por receptor e a liberação de cálcio de estoques intracelulares sensíveis a tapsigargina. Em células ativadas por 4 dias, o aumento de cálcio citosólico é significativamente menor do que em células quiescentes, confirmando a dessensibilização deste receptor. PKA não participa desta sinalização. Dados in vivo mostram que o adrenoceptor <font face=\"symbol\">b é importante para desencadear o ciclo de produção de veneno. / <font face=\"symbol\">b adrenoceptor is present in quiescent and 4 days activated secretory cells of venom gland of Bothrops jararaca snake, however its stimulation increase cAMP production only in quiescent cells. In this work, we functionally characterized <font face=\"symbol\">b adrenoceptor during the venom production cycle and verified its function in venom production. We showed that the stimulation of <font face=\"symbol\">b adrenoceptor increases the rate of extracellular acidification in quiescent and 4 days activated cells, but not in 15 days activated cells. In quiescent cells, <font face=\"symbol\">b adrenoceptor stimulation also triggers calcium influx through voltage-operated and receptor-operated calcium channels, and calcium release from tapsigargin-sensitive stores. In 4 days activated cells, <font face=\"symbol\">b adrenoceptor stimulation promotes smaller increases in citosolic calcium concentration than in quiescent cells, confirming that this adrenoceptor undergoes to dessensitization. PKA does not participate in calcium signaling. In vivo experiments showed that <font face=\"symbol\">b adrenoceptor is important to trigger the cycle of venom production.

Os venenos de serpentes são misturas complexas com composição variada, possuindo constituintes orgânicos e inorgânicos. Dentre os compostos orgânicos, destacam-se as proteínas, tóxicas e/ou com altas atividades enzimáticas. Desta forma, os venenos desenvolvem importante papel na captura de presas e auxílio à digestão. Venenos de serpentes da família Viperidae apresentam ampla e variada gama de ações biológicas, como proteólise, coagulação, hemorragia, neurotoxicidade e miotoxidade. Populações de serpentes habitantes endemicamente em ilhas são bons modelos para estudos de evolução, especialmente quando comparadas a espécies de mesmo gênero que habitam o continente. Espécies ancestrais de serpentes do gênero Bothrops sofreram isolamento geográfico cerca de 9 mil anos atrás, quando no Período Pleistoceno porções de terra na região Sudeste do Brasil foram isoladas do continente, levando a formação de ilhas costeiras, devido a elevação do nível do mar. Tal isolamento deu origem a novas espécies insulares pertencentes ao gênero Bothrops. Estudos relacionados aos venenos destas espécies, suas especificidades e diferenças com relação a serpentes continentais são escassos. O Arquipélago de Alcatrazes localiza-se no litoral de São Paulo, distando aproximadamente 35 Km da costa. Não há relatos da existência de mamíferos na ilha, com exceção de morcegos. Serpentes adultas da espécie Bothrops alcatraz, endêmica da Ilha de Alcatrazes, apresentam características encontradas em serpentes juvenis do grupo das jararacas, como a dieta baseada exclusivamente em animais ectotérmicos e a composição diferenciada do veneno. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar as principais ações do veneno da serpente B. alcatraz, espécie endêmica e ilhoa, isolando cromatograficamente suas frações. Resultados indicam no veneno de B. alcatraz apresenta as atividades coagulante sobre plasma humano, fosfolipásica, miotóxica e edematogênica mais ativas quando comparadas com as ações do veneno de B. jararaca do continente. As ações proteolítica, hemorrágica e toxicidade para camundongos são mais potentes no veneno de B. jararaca. A presença de ação neurotóxica específica para artrópodes no veneno de B. alcatraz sugere a ação de uma fosfolipase A2, a qual foi isolada cromatograficamente. As propriedades e composição do veneno de B. alcatraz indicam uma provável evolução de toxinas adaptadas a seu tipo de presa/alimento. / Snakes venoms are complex mixtures with varied composition constituted by organic and inorganic molecules. The main organic components are proteins, which can be toxic and show high enzymatic activities, thus playing important role in prey capture and digestion in snakes. Viperidae snakes family show wide range of biological actions, as proteolytic, coagulant, hemorrhagic, neurotoxic and myotoxic activities. Snake populations inhabiting endemically islands are useful models for evolution studies, specially when compared to their congeneric continental species. Bothrops species ancestors from Southeastern Brazil underwent geographic isolation about 9 thousand years ago, during the Pleistocene Period, when land portions were separated from the continent by the sea. The isolation originated new (island endemic) Bothrops species. Studies related to those snake venoms, its specialties and differences among continental species of the genera Bothrops are scarce. The Alcatrazes Archipelago is located in São Paulo coast, 35 kilometer far from the continent. There are no register of mammals in those islands, except for bats. Bothrops alcatraz is endemic from the Alcatrazes Island. Adults show some similarities to young specimens from the continental jararaca group. They feed exclusively on ectothermic animals and their venom shows a different composition. The aim of this study was to analyze the endemic island snake, B. alcatraz, venom, isolating by chromatography the venom fractions. Results indicated that B. alcatraz venom presents coagulant, phospholipase, myotoxic and edema forming activities higher than continental B. jararaca venom. The proteolytic, haemorrhagic and mice toxicity are higher on B. jararaca venom. The specific neurotoxic action in arthropods of B. alcatraz venom suggests a phospholipase A2 action, which was isolated bt cromatography. The properties and composition of B. alcatraz venom indicates a possible evolution of toxins adapted to the prey kinds.

O veneno do peixe peçonhento Thalassophryne nattereri induz a formação de uma resposta imune protetora de longa duração caracterizada por células B produtoras de anticorpos de memória (Bmem) e de longa vida (ASC antibody secreting cells). A partir de uma combinação de abordagens in vivo e in vitro investigamos a participação dos linfócitos T de memória e moléculas sinalizadoras CD4 e CD28 sobre a diferenciação e manutenção das ASC e analisamos a relação hierárquica entre os 2 tipos de células B de memória. Demonstramos que as ASC requerem mediante a sua localização (tecido inflamado, baço ou medula óssea) ou a expressão de B220 a integração de diferentes sinais cognatos (BCR, linfócitos TcM e TeM e a sinalização CD4 ou CD28) ou solúveis (IL-17A e IL-23) para a sobrevivência e a amplificação da produção de anticorpos de memória. / Thalassophryne nattereri fish venom induces the formation of a protective immune response characterized by memory B cells (Bmem) and the long-lived antibody-secreting cells (ASC). From a combined in vivo and in vitro approaches, we investigated the participation of memory T lymphocytes and CD4 or CD28 signaling molecules on the differentiation and maintenance of ASC survival and analyzed the hierarchical relationship between the two types of memory B cells. We demonstrated that ASC require dependent by localization (inflamed tissue, spleen or bone marrow) or B220 expression the integration of different cognate signals (BCR, TcM and TeM lymphocytes, CD4 or CD28 signaling) or soluble (IL-17A and IL-23) to survival and amplification of the memory antibodies production.

O contato com as cerdas da lagarta de Premolis semirufa (Pararama) desperta sintomas da inflamação aguda e nos indivíduos poliacidentados pode causar deformidades comuns às sinovites crônicas (pararamose). No presente estudo foi mostrado que o extrato das cerdas da lagarta apresenta intensa atividade proteolítica, sendo capaz de ativar o Sistema Complemento, promover hidrólise de C3, C4 e C5 e a geração de anafilatoxinas. Análises cromatográficas do extrato permitiram o isolamento de uma serinoprotease de 82 kDa capaz de promover tais atividades. Em modelo murino, foi verificado que o extrato é capaz de induzir altos títulos de anticorpos, pronunciada reação inflamatória, ativação de linfócitos T e APCs, bem como produção de citocinas pró-inflamatórias. Os dados obtidos demonstram a existência, no extrato das cerdas da pararama, de várias enzimas que podem atuar em conjunto na geração e desenvolvimento das manifestações clínicas da pararamose. / The contact with the Premolis semirufas caterpillar bristles (Pararama) causes symptoms of the acute inflammation and, in the individuals after multiple accidents, joint deformities common to chronic synovitis (pararamose) can occur. In the current study it was shown that caterpillar bristles extract has intense proteolytic activity, being able to activate the Complement System, induce cleavage of C3, C4 and C5, and the generation of anaphylatoxins. Chromatographic analysis of the extract allowed the isolation of a serine protease with Mr of 82 kDa able to promote such activities. In murine model, it was demonstrated that the extract is able to induce high antibody titers, a pronounced inflammatory reaction, activation of T lymphocytes and APCs, as well as the generation of proinflammatory cytokines. The data obtained demonstrate the existence, in the pararama bristles extract, of numerous enzymes that can act together in the generation and development of clinical manifestations of pararamose.

As serpentes do gênero Crotalus contribuem com 7,7% dos acidentes ofídicos anuais no Brasil e apresentam a letalidade mais elevada. O veneno crotálico apresenta como componente majoritário a crotoxina, formada pelas sub-unidades fosfolipase A2 (PLA2) e crotapotina, responsável pelos efeitos neurotóxicos e miotóxicos observados nas vítimas de acidente. Nós resolvemos investigar novas estratégias de imunização no sentido de direcionar a produção de anticorpos contra as frações de maior toxicidade do veneno. Utilizamos cavalos como animais soroprodutores, divididos em três grupos experimentais, Animais foram imunizados com veneno de C. d. terrificus, crotoxina, ou PLA2. Os plasmas obtidos foram analisados por testes padrões contra diferentes antígenos crotálicos e comparados com antivenenos produzidos pelo Instituto Butantan. Os resultados obtidos mostram o reconhecimento cruzado do veneno das diferentes Crotalus por todos os antivenenos utilizados, e uma maior especificidade dos plasmas produzidos contra crotoxina e PLA2 pelos componentes de maior toxicidade. / The serpents from Crotalus genus contribute with 7.7% of the annual ophidic accidents in Brazil, and have the highest lethality. The crotalic venom shows crotoxin, formed by the sub-units phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin, as a major component and responsible for the neurotoxic and myotoxic effects shown by the snakebite victims. We decided to investigate new immunizations strategies focusing in orientating the immune response against the most toxic fractions of the venom. We used horses as serum producers, divided in three groups. Animals were immunized with either C. d. terrificus venom, crotoxin or PLA2. The plasmas obtained were analyzed by standart immunochemical tests against different crotalic antigens and compared with antivenoms produced by Instituto Butantan. The results show cross-recognition of all Crotalus venoms by the antivenoms, and a higher specificity from the plasmas produced against crotoxin and PLA2 for the most toxic components.

O veneno da subespécie de cascavel Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus) altera a coagulação, tem ação neurotóxica, miotóxica e efeito imunossupressivo. O veneno de C.d.terrificus e a sua fração majoritária, crotoxina (CTX), inibem a resposta celular e humoral, sendo esse efeito independente da indução de morte celular. O objetivo foi investigar os mecanismos envolvidos na imunossupressão exercida pela CTX. A CTX induz a produção de IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 e prostaglandina E2 (PGE2) pelas células dos camundongos que a receberam. Menor secreção de IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 e IL-12 foi observada nas culturas de células de camundongos imunizados e que receberam CTX. A CTX aumenta a expressão da enzima indoleamina 2,3 dioxigenase e a geração de células T reguladoras em camundongos imunizados com OVA e que receberam CTX. A CTX foi capaz de inibir a expressão de CD40, CD80, CD86 e de MHC de classe II em células de camundongos imunizados e nas células dendríticas (DCs) purificadas destes animais. Em culturas de DCs, a CTX induz alta secreção de IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 e PGE2 e menor de IL-12. / The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus (C.d.terrificus) changes the coagulation system and presents neurotoxic, myotoxic and immunosuppressive effect. The venom and its main fraction, crotoxin (CTX) inhibited both the cellular and humoral response. This effect is not due to induction of cell death. The objective was to investigate the immunosuppressive mechanisms of CTX. CTX induces production of IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 and prostaglandin E2 (PGE2) by cells of mice that received it. Lower secretion of IFN-<font face=\"Symbol\">&#947 and IL-12 was observed in the cultured cells from mice immunized that received CTX. CTX promotes increased expression of the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase and generation of regulatory T cells in mice immunized with OVA and receiving the toxin. CTX was able to inhibit the expression of CD40, CD80, CD86 and MHC II in mice immunized and in dendritic cells (DCs) purified from these animals. In cultures of DCs, CTX increased secretion of IL-10, TGF-<font face=\"Symbol\">&#946 and PGE 2 and lower IL-12.

Evidências clínicas e experimentais têm sugerido a existência de diferenças na sensação de dor e na resposta a fármacos analgésicos entre machos e fêmeas. A crotalfina (CRF), um peptídeo inicialmente isolado e caracterizado no veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus, apresenta efeito antinociceptivo, quando avaliado em diferentes modelos experimentais de dor aguda e crônica. O efeito deste peptídeo é de longa duração e mediado pela ativação de receptores opióides periféricos do tipo <font face=\"Symbol\">k e <font face=\"Symbol\">d. Contudo, os estudos com a crotalfina foram sempre realizados utilizando roedores machos. Assim, o presente projeto de pesquisa teve por objetivo avaliar a diferença na sensibilidade dolorosa e no efeito antinociceptivo da crotalfina, entre ratos machos e fêmeas. Os resultados mostraram que fêmeas apresentam menor limiar nociceptivo e maior sensibilidade à dor. A crotalfina apresentou maior potência antinociceptiva em fêmeas. A diferença na sensibilidade dolorosa e na resposta a analgésicos pode ser decorrente da presença de hormônios esteroidais gonadais. / Several clinical and experimental evidence have suggested the existence of sex differences in pain sensation and in the analgesic effect of opioid drugs in human and rodents. Crotalphine (CRP), a peptide first characterized in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus, displays potent and long-lasting opioid (peripheral <font face=\"Symbol\">k and <font face=\"Symbol\">d opioid receptors) analgesic activity in experimental models of acute and chronic pain. Due to its potent and long-lasting analgesic effect, pre-clinical trials with the synthetic peptide and analogues are now in progress. However, the experimental studies with CRP have always been developed in male animals. This study aims to evaluate the differences in pain sensation and in the analgesic response to CRP between male and female Wistar rats. Sex differences could be observed between male and female rats in relation to pain threshold. However, despite displaying opioid activity, the new analgesic peptide CRP is more effective in females than males. These differences could be related with sex hormones.

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T13:45:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Floriano_RafaelStuani_D.pdf: 3786286 bytes, checksum: a2855e3dd5b20280b1bf65e08007ab09 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho, nós examinamos a atividade neuromuscular do veneno de Bothriopsis bilineata smaragdina (serpente de floresta) e de sua toxina Bbil-TX (fosfolipase A2 Asp49) em preparações nervo-músculo isoladas de vertebrados. Em preparações BC, o veneno causou bloqueio neuromuscular concentração-dependente (0,1-30 ?g/mL) que não foi reversível por lavagem, com 50% de bloqueio ocorrendo em 90-15 min. Contratura muscular em resposta à ACh exógena e ao KCl não foram afetadas pelo veneno, mas houve um discreto aumento na liberação de CK após 60 min [UI/mL: de 80 ± 15 (basal) para 113 ± 22; n = 6; p > 0,05]. Em preparações NFD, o veneno (1, 10 e 30 ?g/mL) produziu marcante facilitação da neurotransmissão (~120% de aumento acima do basal) com a maior concentração seguida por bloqueio neuromuscular completo após 120 min; os efeitos com as menores concentrações foram considerados menos marcantes. O veneno aumentou o conteúdo quântico após 15 e 30 min de incubação seguido por significativa inibição ?90 min. No entanto, o veneno não alterou o potencial de membrana muscular ou a resposta despolarizante ao carbacol. Em ambas as preparações, incubação a 22-24 °C ao invés de 37 °C atrasou o início do bloqueio, como fez também a inibição da atividade PLA2 do veneno. Em preparações NFD curarizadas, o veneno produziu apenas uma discreta facilitação muscular. Estes resultados indicam que o veneno de B. b. smaragdina causa bloqueio neuromuscular in vitro por um mecanismo pré-sináptico envolvendo PLA2. Também foi investigada a atividade neuromuscular de Bbil-TX, uma PLA2 com atividade catalítica isolada do veneno de B. b. smaragdina, em preparações BC e NFD. Em preparações BC, Bbil-TX (35-702 nM) causou bloqueio tempo- e concentração-dependente que não foi reversível por lavagem; os tempos para causar 50% de bloqueio foram 87 ± 7, 41 ± 7 e 19 ± 2 min (média ± EPM; n = 4-6) para 70, 351 and 702 nM, respectivamente. Contraturas musculares à ACh exógena e KCl não foram alteradas. A toxina (702 nM) também não alterou as respostas contráteis de preparações BC curarizadas (d-Tc; 14,8 ?M) e diretamente estimuladas. No entanto, Bbil-TX (702 nM) produziu moderada alteração morfológica (fibras edemaciadas e/ou hipercrômicas) em BC; houve também uma progressiva liberação de CK [UI/mL: de 116 ± 17 (basal) para 961 ± 48 após 60 min; n = 6; p < 0,05]. O bloqueio neuromuscular induzido por Bbil-TX (351 nM) foi significativamente inibido a 22-24 °C e o pré-tratamento com p-BPB aboliu seu bloqueio. Bbil-TX (210 nM, 702 nM e 2 ?M; n = 4-6) causou bloqueio parcial tempo- e concentração-dependente em preparações NFD (52 ± 2% com a maior concentração). Bbil-TX (2 ?M) também reduziu significativamente a frequência de PsPTM/min [de 26 ± 2,5 (basal) para 10 ± 1 após 60 min; n = 5; p < 0,05] e o conteúdo quântico [de 94 ± 14 (basal) para 24 ± 3 após 60 min; n = 5; p < 0,05] de preparações NFD, mas causou apenas uma discreta alteração do potencial de membrana em repouso [de -80 ± 1 mV (basal) para -66 ± 2 mV após 120 min; n = 5; p < 0,05], com nenhuma alteração significativa na resposta despolarizante ao carbacol. Estes resultados mostram que Bbil-TX é uma PLA2 pré-sináptica que contribui para o bloqueio neuromuscular causado pelo veneno de B. b. smaragdina. A atividade neuromuscular do veneno de B. b. smaragdina e o mecanismo de ação de Bbil-TX no sistema nervoso periférico foi examinado também em outras preparações neuromusculares isoladas de camundongo. Em preparações NFD mantidas em solução fisiológica com baixo Ca2+, o veneno de B. b. smaragdina (3 ?g/mL) produziu uma alteração trifásica nas respostas contráteis enquanto que a maior concentração (10 ?g/mL) produziu uma abrupta e marcante contratura inicial a qual foi seguida por facilitação neuromuscular, oscilações rítmicas das contrações evocadas, alterações na linha de base e progressivo bloqueio neuromuscular. O veneno também atrasou a fase de relaxamento da resposta contrátil aumentando o tempo de decaimento constante. Em condições de baixo Ca2+, Bbil-TX (210 nM) causou um progressivo aumento na amplitude das respostas contráteis (83 ± 19 % acima dos valores basais após 120 min) em preparações NFD; não houve alteração no tempo de decaimento constante após tratamento com a toxina. O veneno de B. b. smaragdina (10 ?g/mL) e Bbil-TX (210 nM) causaram discreta alteração na amplitude do potencial de ação composto registrado em preparações NC de camundongo (veneno: 20 ± 2,1% e toxina: 17 ± 2,4% de redução abaixo dos valores basais; n = 3; p < 0,05) e nenhum efeito significativo sobre o tempo de subida e a latência; Tetrodotoxina (3,1 nM) bloqueou os potenciais no final dos experimentos. Em preparações TSn-m, veneno (10 ?g/mL) e Bbil-TX (210 nM) causaram significativa redução na forma de onda perineural associada à corrente K+ (veneno: 35 ± 7,2% e toxina: 26 ± 1,4% de redução abaixo dos valores basais; p < 0,05; n = 3-5) enquanto que a amplitude da corrente de Na+ não foi significativamente afetada (veneno: 18 ± 3,3% e toxina: 15 ± 2,4% de redução abaixo dos valores basais; p > 0,05; n = 3-5). Bbil-TX (210 nM) causou aumento nos valores de conteúdo quântico de preparações TSn-m mantidas em baixo Ca2+ [de 9,6 ± 1,1 (t0) para 31,4 ± 7,7 (t60), p < 0,05; n = 4]. O veneno (3 ?g/mL) e toxina (210 nM) induziram aumento na fluorescência ao cálcio em células SK-N-SH marcadas com indicador sensível ao Ca2+ Fluo3 AM (4 ?M) e mantidas em solução fisiológica com normais condições de Ca2+ ou com baixo Ca2+. Em células mantidas em Ca2+ normal, o aumento na amplitude de fluorescência foi acompanhado por irregular e frequente movimento de Ca2+. Em preparações TSn-m marcadas com Fluo4 AM (4 ?M), o veneno de B. b. smaragdina causou imediato aumento na concentração de Ca2+ intracelular de fibras musculares seguido por frequente oscilação na fluorescência e contratura muscular; Bbil-TX não induziu nenhuma alteração na fluorescência ao cálcio em fibras musculares de preparações TSn-m. Secções de preparações NFD pré-tratadas com Bbil-TX (210 nM) destinadas à imunohistoquímica foram marcadas positivamente para receptores juncionais de ACh mas houve perda de marcação para as proteínas pré-sináptica sinaptofisina e SNAP25. Juntos, estes dados indicam que Bbil-TX tem alta seletividade de ação sobre a região pré-sináptica semelhantemente a outras neurotoxinas PLA2 modulando a atividade neuromuscular do veneno de B. b. smaragdina / Abstract: In this work, we examined the neuromuscular activity of Bothriopsis bilineata smaragdina (forest viper) venom and its toxin Bbil-TX (Asp49 phospholipase A2) in vertebrate isolated nerve-muscle preparations. In chick biventer cervicis preparations (BC) the venom caused concentration-dependent (0.1-30 ?g/ml) neuromuscular blockade that was not reversed by washing, with 50% blockade occurring in 15-90 min. Muscle contractures to exogenous acetylcholine and KCl were unaffected by the venom, but there was a slight increase in creatine kinase release after 60 min [IU/ml: from 80 ± 15 (basal) to 113 ± 22; n = 6; p > 0.05]. In mouse phrenic nerve-diaphragm preparations (PND), the venom (1, 10 and 30 ?g/ml) produced marked facilitation (~120% increase above basal) at the highest concentration followed by neuromuscular blockade; the effects at lower concentrations were considerably less marked. The venom increased quantal content values after 15 and 30 min followed by significant inhibition at ?90 min. However, the venom did not alter the muscle membrane resting potential or the response to exogenous carbachol. In both preparations, incubation at 22 °C instead of 37 °C delayed the onset of blockade, as did inhibition of venom PLA2 activity. In curarized mouse preparations, the venom produced only muscle facilitation. These results indicate that B. b. smaragdina venom causes neuromuscular blockade in vitro by a presynaptic mechanism involving PLA2. It was also investigated the neuromuscular activity of Bbil-TX, a PLA2 with catalytic activity isolated from B. b. smaragdina venom, in BC and PND preparations. In BC preparations, Bbil-TX (35-702 nM) caused time- and concentration-dependent blockade that was not reversed by washing; the times for 50% blockade were 87 ± 7, 41 ± 7 and 19 ± 2 min (mean ± SEM; n = 4-6) for 70, 351 and 702 nM, respectively. Muscle contractures to exogenous ACh and KCl were unaffected. The toxin (702 nM) also did not affect the twitch-tension of directly stimulated, curarized (d-Tc, 14.8 ?M) BC preparations. However, Bbil-TX (702 nM) produced mild morphological alterations (edematous and/or hyperchromic fibers) in BC; there was also a progressive release of CK [IU/ml: from 116 ± 17 (basal) to 961 ± 48 after 60 min; n = 6; p < 0.05]. Bbil-TX (351 nM)-induced blockade was markedly inhibited at 22-24 °C and pretreatment with p-BPB abolished the neuromuscular blockade. Bbil-TX (210 nM, 702 nM and 2 ?M; n = 4-6) caused partial time- and concentration-dependent blockade in PND preparations (52 ± 2% at the highest concentration). Bbil-TX (2 ?M) markedly reduced the MEPPs frequency/min [from 26 ± 2.5 (basal) to 10 ± 1 after 60 min; n = 5; p < 0.05] and the quantal content [from 94 ± 14 (basal) to 24 ± 3 after 60 min; n = 5; p < 0.05] of PND preparations, but caused only minor depolarization of the membrane resting potential [from -80 ± 1 mV (basal) to -66 ± 2 mV after 120 min; n = 5; p < 0.05], with no significant change in the depolarizing response to exogenous carbachol. These results show that Bbil-TX is a presynaptic PLA2 that contributes to the neuromuscular blockade caused by B. b. smaragdina venom. The neuromuscular activity of B. b. smaragdina venom and the mechanism of action of Bbil-TX on peripheral nervous system have been further examined in mouse nerve-muscle preparations in vitro. In PND preparations maintained in low Ca2+ physiological salt solution (PSS), B. b. smaragdina venom (3 ?g/ml) caused a triphasic change in twitch height while the xv highest concentration (10 ?g/ml) produced an abrupt and marked initial contracture which was followed by neuromuscular facilitation, rhythmic oscillation of nerve evoked twitch, alteration in base line and progressive blockade. The venom also slowed the relaxation phase of the muscle twitch increasing the constant decay time. Under low Ca2+ conditions, Bbil-TX caused a progressive increase in twitch amplitude (83 ± 19 % above basal values after 120 min) in PND preparations; there was no change in the constant decay time after treatment with toxin. B. b. smaragdina venom (10 ?g/ml) and Bbil-TX (210 nM) caused minor changes in the amplitude of the compound action potential (CAP) recorded from SN preparations (venom: 20 ± 2.1 % and toxin: 17 ± 2.4 % of reduction below basal values; n = 3; p < 0.05) and no significant effect on rise time and latency; tetrodotoxin (3.1 M) blocked the CAP at the end of the experiments. In TSn-m preparations, both venom (10 ?g/ml) and Bbil-TX (210 nM) caused significant reduction in the perineural waveform associated with the outward K+ current (venom: 35 ± 7.2 % and toxin: 26 ± 1.4 % of reduction below basal values; p < 0.05; n = 3-5) while the amplitude of the inward Na+ current was not significantly affected (venom: 18 ± 3.3 % and toxin: 15 ± 2.4 % of reduction below basal values; p > 0.05; n = 3-5). Bbil-TX (210 nM) caused progressive increase in quantal content in TSn-m preparations maintained in low Ca2+ PSS [from 9.6 ± 1.1 (t0) to 31.4 ± 7.7 (t60), p < 0.05; n = 4]. Venom (3 ?g/ml) and toxin (210 nM) induced increase in calcium fluorescence in neuroblastoma cell line SK-N-SH loaded with calcium sensitive indicator Fluo3 AM (4 ?M) and maintained in low Ca2+ or normal Ca2+ PSS. In those cells maintained in normal Ca2+ PSS, the increase in fluorescence amplitude was accompanied by irregular and frequent calcium transients. In TSn-m preparations loaded with Fluo4 AM (4 ?M), B. b. smaragdina venom (10 ?g/ml) caused immediate increase in Ca2+ intracellular of muscle fibres followed by frequent oscillation in fluorescence and muscle contracture; Bbil-TX did not induce any change in calcium fluorescence in TSn-m preparations. Immunohistochemical sections of PND preparations pretreated with Bbil-TX (210 nM) were labeled positively for junctional ACh receptors but there was loss of labeling for presynaptic proteins synaptophysin and SNAP25. Together, these data indicate that Bbil-TX has high selectivity of action under the presynaptic region similarly as other PLA2 neurotoxins modulating the neuromuscular activity of B. b. smaragdina venom / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia