A Nattectina é uma toxina isolada do veneno de Thalassophryne nattereri que possui homologia com lectinas tipo C. Este estudo consistiu em avaliar a ação da Nattectina sobre as funções de macrófagos e a influência de citocinas Th1/Th2 nessa ativação. Nossos resultados mostram que a Nattectina induziu o aumento da expressão de moléculas coestimuladoras dependente da sinalização MAPK p38 e PI3K em macrófagos derivados da medula óssea, e também um aumento na capacidade endocítica e expressão de MHC de classe II dependentes da sinalização ERK1/2 e da ligação da Nattectina ao carboidrato. Verificamos ainda que alterações induzida pela Nattectina nos macrófagos são consistentes com a ativação clássica M1 dependente de IL-12 e IFN-<font face=\"Symbol\">g, e regulada negativamente por IL-4, IL-10 e IL-13. Por fim, verificamos uma ação coadjuvante da IL-4 com IFN-<font face=\"Symbol\">g na mobilização de SPMs (Small Peritoneal Macrophages) para cavidade peritoneal e na ativação de macrófagos. Dessa forma, a Nattectina pode ser considerada um importante agente imunomodulador capaz de modular as funções de macrófagos. / Nattectin is a toxin isolated from Thalassophryne nattereri fish venom that has homology with C-type lectin. This study was carried out to evaluate the action of Nattectin on macrophage functions and the influence of Th1/Th2 cytokines in this activation. Our results show that Nattectin induced the increased expression of costimulatory molecules dependent on MAPK p38 and PI3K signaling in bone marrow-derived macrophages, and also an increase in endocytic capacity and MHC class II expression dependent on ERK1/2 signaling and binding of Nattectin to carbohydrate. We also found that modifications induced by Nattectin in macrophages are consistent with classical (M1) activation of macrophages dependent on IL-12 and IFN-<font face=\"Symbol\">g cytokines, and negatively regulated by IL-4, IL-10 and IL-13. Finally, it was demonstrated an adjuvant role of IL-4 with IFN-<font face=\"Symbol\">g in mobilization of SPMs (Small Peritoneal Macrophages) to peritoneal cavity and also in macrophage activation. Thus, Nattectin can be considered an important immunomodulatory agent able to modulate macrophage functions.

Considerando que os dados epidemiológicos apontam uma elevação alarmante na incidência de diabetes na população mundial, muitos estudos vêm sendo realizados buscando estabelecer propostas preventivas e terapêuticas para esta patologia e suas complicações, principalmente em relação a cicatrização de feridas. A maneira convencional de unir os tecidos e as margens de feridas, utilizando suturas pode causar problemas como fístula e formação de granulomas, devido a uma incompatibilidade do tecido com os materiais de sutura, deiscência quando os materiais de sutura absorvível mostram desintegração precoce e isquemia tecidual com conseqüente necrose de borda da ferida quando uma sutura é muito apertada. Dentre os novos meios de adesão tecidual que têm sido idealizados, um deles é o adesivo biológico, tendo como objetivo selar tecidos e feridas sem produzir qualquer tipo de trauma O adesivo cirúrgico derivado do veneno de serpente é um produto biológico e biodegradável que não produz reações adversas, não contém produtos derivados do sangue humano, portanto não favorece transmissão de doenças infecciosas, tem uma capacidade de bom adesivo, e pode ser usado como coadjuvante nos procedimentos de sutura convencional. Este trabalho analisou, portanto, em feridas cirúrgicas feitas no dorso de ratos Wistar machos de três meses de idade diabéticos e não diabéticos três materiais utilizados como coadjuvantes na cicatrização de feridas cirúrgicas: sutura de nylon 5.0, a cola de fibrina comercial Tissucol® e o adesivo cirúrgico do veneno de serpente. Os animais foram eutanasiados nos períodos de três e sete dias do pós-operatório e as áreas das feridas foram analisadas microscopicamente através das colorações de Hematoxilina & Eosina e Tricrômio de Mallory. No experimento realizado constatamos que a reepitelização no grupo controle foi favorecida pelo material Tissucol®. A presença de infiltrado inflamatório mononuclear foi significativamente proeminente pelo uso do adesivo cirúrgico derivado do veneno de cobra. Adicionalmente, a proliferação vascular foi significativamente favorecida pelo uso do adesivo cirúrgico derivado do veneno de cobra no grupo controle aos sete dias de proservação. As técnicas de sutura realizadas até hoje somente para manter a coaptação entre as margens das feridas podem e devem ser melhoradas com o uso de outros materiais disponíveis a fim de acelerar as fases da cicatrização e viabilizar o conforto e bem estar do paciente. / Whereas epidemiological data point to an alarming increase in the incidence of diabetes in the world population, many studies have been conducted to establish preventive and therapeutic proposals for this disease and its complications, especially in relation to wound healing. The conventional way of joining tissue and wound edges, using sutures may cause problems such as fistulas and granulomas due to incompatibility with the materials of the fabric of suture dehiscence when the absorbable suture materials show premature disintegration and tissue ischemia with subsequent necrosis of the wound edge when a suture is too tight. Among the new means of tissue adhesion that have been devised, one of them is the biological adhesive, aiming to \"paste\" and injured tissues without producing any kind of trauma. The surgical adhesive derived from snake venom is a biological product that is not biodegradable and produce adverse reactions, it does not contain human blood therefore does not favor the transmission of infectious diseases, have a good adhesive ability , and can be used as an adjunct to conventional suturing procedures. This study therefore considered in surgical wounds made in the back of male Wistar rats three months old diabetic and non-diabetic three materials used as adjuvants in the healing of surgical wounds: 5.0 nylon suture, the commercial fibrin seletante Tissucol® and surgical adhesive snake venom. The animals were sacrificed at three and seven days after surgery and wound areas were analyzed microscopically by staining with hematoxylin & eosin and Mallory trichrome . In the experiment we found that re-epithelialization in the control group was favored by the material Tissucol®. The presence of mononuclear cell infiltration was prominent significantly by the use of surgical adhesive derived from snake venom. Additionally, vascular proliferation was significantly enhanced by the use of surgical adhesive derived from snake venom in the control group at seven days of follow up. The suture techniques performed today only to maintain coaptation between the margins of the wounds can and should be improved with the use of other materials available to accelerate the stages of healing and facilitate the comfort and wellbeing of the patient.

Crotamina é um peptídeo de baixo peso molecular composto de 42 resíduos de aminoácidos. A presença de nove resíduos de lisina e três pontes dissulfeto confere a crotamina compactibilidade elevada, estabilidade, carga positiva líquida, apresentando similaridade estrutural com defensina, um peptídeo antimicrobiano do epitélio humano. Crotamina até 10,0 mM é inócua para células normais (e.g., fibroblastos humanos e células-tronco embrionárias de murinos), mas letal para células tumorigênicas CHO-K1. Aqui, nós demonstramos que 1 mg crotamina (0,2 mM) foi citotóxica para céluas B16-F10, Mia Paca-2 e SK-Mel-28 células in vitro, como se provou pelos ensaios de MTT, coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio. Adicionalmente, nós avaliamos o efeito citotóxico da crotamina sobre a invasão do melanoma cutâneo primário produzido pela implantação de células B16-F10 em camundongos C57BL/6J. O efeito da crotamina em melanoma cutâneo foi estudado em dois grupos de camundongos (tratados com crotamina e não tratados), sendo cada grupo composto por 35 camundongos. Cada animal do grupo, tratado com crotamina, recebeu diariamente 1,0 mg/100 mL de crotamina (2 mM) , enquanto aqueles não tratados receberam apenas placebo. O tratamento com crotamina durou 21 dias. O atraso da implantação do tumor e redução da mortalidade foi observado para o grupo tratado com crotamina quando comparados ao grupo controle não-tratados. O peso médio d o tumor no grupo não tratado foi 4,60 g, enquanto nos tratados com crotamina foi de apenas de 0,27 g, quando detectados. O cálculo de sobrevida estimado de Kaplan Meier indicou que o grupo tratado com crotamina apresentou diferenças significativas, número de sobreviventes (n = 28/35), em comparação ao grupo não tratado (n = 7/35). Os dados de nossa pesquisa demonstram que a crotamina possui in vitro e in vivo uma atividade citotóxica específica e seletiva contra tipos de tumores de crescimento rápido e agressivo. / Crotamine is a low molecular weight peptide composed of 42 amino acid residues. The presence of nine lysine residues and three disulfide bonds confers to crotamine high compactness, stability, net positive charge, and overall structural similarity to b-defensin 2, an antimicrobial peptide from the human epithelia. Crotamine, up to 10.0 mM, is innocuous to normal cells (e.g., human fibroblasts and murine embryonic stem cells), but lethal for tumorigenic CHO-K1 cells. Herein, we demonstrated that 1 mg of crotamine (0,2 mM) was cytotoxic for B16-F10, Mic PaCa-2 and SK-Mel-28 cells in vitro, as proved by MTT assay, Hoechst 33342 and Propidium iodide staining. Additionally, we evaluate the cytotoxic effect of crotamine on primary invasion of cutaneous melanoma produced by injection of B16-F10 cells into C57Bl/6J mice. The effect of crotamine on cutaneous melanoma was studied on two groups of mice (crotamine-treated and non-treated), each composed by 35 mice. Each animal in crotamine-treated group received daily 1 mg/100 mL of crotamine (2 mM), while those non-treated received placebo. Crotamine treatment lasted for 21 days. The delay of tumor implantation and reduction of death was observed for crotamine-treated group when compared to control non-treated group. Average weight of tumor in non-treated group was 4.60 g, while in crotamine-treated, was only about 0.27 g, if detectable. The Kaplan Meier estimator indicated that crotamine-treated group present significant survival number (n=28/35) in comparison with non-treated group (n=7/35). Data from our research demonstrate that crotamine possesses in vitro and in vivo specific and selective cytotoxic activity against aggressive and fast growing types of tumor.

O vírus da dengue (DENV) e o vírus da febre amarela (YFV) (gênero Flavivirus, família Flaviviridae) representam importantes arbovírus causadores de doenças em humanos que afetam as regiões tropicais e sub-tropicais do planeta, somando milhões de infectados anualmente. Embora exista uma vacina contra o YFV, ainda são notificados muitos casos de febre amarela nas regiões endêmicas das Américas e, principalmente, da África. Recentemente, foi licenciada uma vacina contra o DENV, mas seu uso ainda é bastante restrito. Não existem agentes terapêuticos para tratamento da infecção contra nenhum desses vírus. Portanto, estudos para identificação de fármacos para combaterem a infecção pelos DENV e YFV são de suma importância. Nosso grupo descreveu a ação antiviral da fosfolipase A2 crotoxina B (PLA2-CB) da serpente Crotalus durissus terrificus, a qual tem ação diretamente sobre o envelope de DENV e YFV. A meta principal deste trabalho foi a produção das duas isoformas da PLA2-CB (CB1 e CB2) recombinantes e avaliação de suas atividades antivirais, a fim de contribuir com a prospecção de novas drogas antivirais. Para alcançar tais propósitos, as sequências codificadoras das isoformas foram otimizadas para expressão em sistema procarioto, quimicamente sintetizadas e enzimaticamente inseridas no vetor de expressão pGS-21a. Os plasmídeos gerados foram utilizados para transformar células E. coli das cepas BL21(DE3), Origami B(DE3) e ArcticExpress (DE3). As proteínas recombinantes foram expressas juntamente com uma cauda de polihistidina (6xHis) no extremo C-terminal (CB1+6xHis_opt e CB2+6xHis_opt). Ambas as proteínas foram reconhecidas por anticorpos produzidos contra a PLA2-CB in natura em ensaio de Western Blot. Considerando que as proteínas foram expressas de forma insolúvel, a purificação foi realizada em sistema de cromatografia líquida (FPLC), utilizando coluna com resina de afinidade por níquel sob condições desnaturantes, utilizando ureia como agente solubilizador. As proteínas foram renaturadas na própria coluna de níquel (on-column) durante a purificação, utilizando um gradiente decrescente de ureia (6-0M - 120ml - 0,1ml/min) e o detergente CHAPS como agente estabilizador. As proteínas CB1+6xHis_opt e CB2+6xHis_opt em ensaio colorimétrico de hidrólise de fosfatidilcolina apresentaram atividade fosfolipásica, indicando preservação do sítio catalítico. Em ensaio virucida contra o DENV-2, YFV e outros dois vírus envelopados: Vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus Zika (ZIKV), as proteínas recombinantes reduziram a formação de placas de lise exibindo índices de seletividade na média de 0,6. As proteínas CB1+6xHis_opt e CB2+6xHis_opt podem vir a ser um importante modelo na prospecção de novas drogas antivirais e como ferramenta no estudo do mecanismo de replicação viral. / Dengue virus (DENV) and yellow fever virus (YFV) (genus Flavivirus, family Flaviviridae) are important arboviruses that cause diseases in humans affecting the tropical and subtropical regions of the planet with millions of infected annually. Although there is a vaccine against YFV, many cases of yellow fever are still reported in the endemic regions of the Americas, and especially in Africa. A vaccine against DENV has recently been licensed, but its use is still quite restricted. There are no therapeutic agents to treat the infection against any of these viruses. Therefore, studies to identify drugs to combat DENV and YFV infection are of extreme importance. Our group described the antiviral action of the phospholipase A2 crotoxin B (PLA2-CB) isolated from Crotalus durissus terrificus, which acts directly on the envelope of DENV and YFV. The aim of this study was to produce the two recombinant PLA2-CB (CB1 and CB2) isoforms and evaluate their antiviral activities in order to contribute to the prospection of new antiviral drugs. To achieve such purposes, the coding sequences of the isoforms were optimized for prokaryotic expression system, chemically synthesized and enzymatically inserted into the pGS-21a vector. The plasmids generated were used to transform E. coli cells from BL21 (DE3), Origami B (DE3) and ArcticExpress (DE3) strains. Recombinant proteins were expressed tagged with a polyhistidine (6xHis) tail at the C-terminus (CB1+6xHis_opt and CB2+6xHis_opt). Both proteins were recognized by antibodies raised against native PLA2-CB in Western blot assay. Considering that the proteins were expressed in insoluble form, purification was performed in liquid chromatography system (FPLC) using nickel resin column under denaturing conditions, using urea as the solubilizing agent. The proteins were renatured on-column during purification procedure using a decreasing gradient of urea (6-0M - 120ml - 0,1ml/min) and CHAPS as a stabilizing agent. CB1+6xHis_opt and CB2+6xHis_opt proteins showed phospholipase activity in a colorimetric assay based on phosphatidylcholine hydrolysis, indicating preservation of the catalytic site. In a virucidal assay against DENV-2, YFV and two other enveloped viruses: Chikungunya virus (CHIKV) and Zika virus (ZIKV), the recombinant proteins reduced the plaques of lysis formation exhibiting selectivity indices at the mean of 0.6. The CB1+6xHis_opt and CB2+6xHis_opt proteins could be important models for the prospection of new antiviral drugs and as tools for the study of the mechanism of viral replication.

As fosfolipases A2 secretadas, particularmente do grupo II são abundantes nos venenos de serpentes, incluindo o gênero Bothrops e estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos, como inflamação e dor, incluindo artrite. Contudo, não está totalmente caracterizado o papel da FLA2 para a gênese e manutenção dos quadros de inflamação articular. Nosso objetivo foi padronizar um novo modelo de artrite, utilizando sFLA2 do grupo IIA (miotoxina II) isolada do veneno da serpente Bothrops asper e avaliar a mediação química envolvida no processo nociceptivo deste quadro. Os resultados indicaram aumento de permeabilidade vascular, infiltrado celular e hiperalgesia. A hiperalgesia é um processo multimediado com a participação de prostanóides, sendo sua produção decorrente da ativação de FLA2 endógenas. Estes dados sugerem que esta FLA2 pode se tornar uma ferramenta científica importante para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos processos de inflamação articular. / Secretory phospholipases A2 are abundant in different animal tissues and particularly group II are found in venom snakes and are proteins involved in many physiological and pathophysiological processes, like inflammation and pain, components of arthritis. However, the involvement of PLA2 in the genesis and maintenance of articular inflammation is not well characterized. Our aim is to characterize the articular inflammatory response induced by Lys 49-PLA2 (IIA group) isolated from B. asper snake venom. It was analyzed the nociceptive process involved, developing a new experimental model of articular inflammation. Our results indicated that sPLA2 induces increase in the vascular permeability, cell migration and hyperalgesia. Hyperalgesia is a multimediated process and prostanoids are involved in the nociceptive process, being its production dependent of the endogenous PLA2 activation. These data indicate that this PLA2 could be an important scientific tool for the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in articular inflammation processes.

Análise proteômica das glândulas de veneno e acessória durante o ciclo de produção de veneno e a influência da inervação noradrenérgica na síntese de proteínas foi verificada. Nossos dados mostram que a síntese de proteínas envolvidas no processo de síntese e secreção de proteínas está aumentada nos estágios ativados da glândula de veneno e que a estimulação da inervação noradrenérgica regula a síntese de algumas proteínas importantes para estes processos. Mostramos pela primeira vez, a presença de várias toxinas no estágio quiescente da glândula e que a produção e secreção de toxinas ocorrem de maneira não sincronizada. Na glândula acessória verificamos uma modulação na síntese de algumas proteínas da glândula após a extração de veneno. Mostramos também a presença de várias toxinas e de inibidores de enzimas do veneno nesta glândula. A composição proteômica das glândulas do aparelho glandular de veneno de serpente contribuirá para um melhor conhecimento dos mecanismos de produção e secreção de veneno e para os estudos das toxinas e suas diversidades. / Proteomic analysis of venom gland and accessory gland during venom production cycle and the influence of noradrenergic innervation on protein synthesis of venom gland were verified. Our data show that the synthesis of proteins involved in the process of synthesis and secretion of proteins is increased in activated stages of venom gland and the sympathetic outflow regulates the synthesis of some proteins that is important to this process. For the first time we showed that many toxins are present in quiescent stage of venom gland and the production and secretion of toxins is not synchronized. Regarding the accessory gland, we verify that the syntheses of some protein of gland were regulated after venom extraction. We also showed the presence of some toxins of the venom and enzyme inhibitors in this gland. The proteomic composition of snake venom gland apparatus will contribute to better understand the mechanisms involved in venom gland activation and consequently, venom production. These data will also contribute to the studies on snake toxins and their diversities.

A glândula acessória (GA) e o ducto primário (DP) fazem parte do aparelho glandular de veneno da serpente Bothrops jararaca. Existem poucos estudos envolvendo a GA e o DP e ainda há controvérsias se as secreções liberadas por estas regiões podem modificar o veneno formado. Nossos resultados mostraram que a GA apresenta um epitélio secretor simples com células secretoras mucosas, células seromucosas, células ricas em mitocôndrias sem secreção, células horizontais, células basais e células dark. E o DP apresenta um epitélio pseudo-estratificado com células secretoras colunares com vesículas com diferentes eletrodensidades, células ricas em mitocôndrias, células dark, células basais e células horizontais. Observamos que a GA e o DP possuem um ciclo de produção e secreção longo semelhante à glândula principal de veneno. Além disso, mostramos pela primeira vez que a secreção da GA não participa na formação do veneno total e sugerimos que a secreção liberada pelo DP possa participar do veneno total e seja esta secreção o motivo das controvérsias existentes na literatura. / The accessory gland (AG) and the primary duct (PD) are components of the venom gland apparatus of Bothrops jararaca snake. There are few studies about AG and PD and there is still controversy on whether the secretions released by these regions can modify the total venom. Our results show that AG presents simple secretory epithelium with mucous secretory cells, seromucous cells, mitochondria-rich cells without secretion, horizontal cells, basal cells and dark cells. The PD duct presents pseudo-stratified epithelium with secretory columnar cells with different electrodensity vesicles, mitochondria-rich cells, dark cells, basal cells and horizontal cells. We also observed that the AG and the PD have a long cycle of synthesis and secretion as the main venom gland. Furthermore, we show for the first time that the secretion of AG does not participate in the formation of the whole venom and suggest that the secretion released by PD could contribute to the total venom and this secretion could be the subject of controversy in the literature.

A jararagina, isolada do veneno de Bothrops jararaca, possui efeito pró-inflamatório caracterizado por edema, liberação de citocinas e migração celular. Neste estudo, demonstramos o aumento na expressão gênica da quimiocina IL-8, moléculas de adesão (E-Selectina, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, Angiopoetina-2 e MMP-10 em HUVECs estimuladas com jararagina. Também investigamos o efeito da jararagina na expressão protéica de moléculas de adesão e da quimiocina IL-8. A molécula de adesão PECAM-1 foi expressa na superfície das HUVECs em todos os tratamentos e intervalos de tempo analisados. Entretanto não observamos aumento da expressão de E-selectina e VCAM-1 após estímulo com a jararagina. A jararagina também não induziu a liberação de IL-8. Nossos resultados sugerem que a jararagina se liga nas células endoteliais, mas o receptor celular envolvido neste efeito ainda não está claro. Este trabalho contribui com a literatura na medida em que elucida a participação de importantes genes dentro do contexto inflamatório desencadeado pela jararagina em células endoteliais. / Jararhagin, from Bothrops jararaca venom, causes a local reaction manifested by edema, cytokine release and inflammatory cells recruitment. In this study we evaluated by real time PCR the expression of 9 genes involved in inflammatory response, triggered by jararhagin in HUVECs. Our results showed a significant increase in the gene expression of chemokine IL-8, adhesion molecules (E-selectin, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, angiopoietin-2 and MMP-10. We also investigated the effect of jararhagin on expression of adhesion molecules in the surface of HUVECs by flow cytometry. We did not observe increased expression of E-selectin and VCAM-1 molecules on the surface of HUVECs compared with control. Jararhagin did not increase the release of soluble chemokine IL-8 in HUVECs supernatant. Our results suggest that jararhagin binds to endothelial cells, but the cellular receptor involved in this effect remains unclear. This work contributes to the literature highlighting the participation of important genes within the inflammatory context triggered by jararhagin on endothelial cells.

O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus e seus componentes desencadeiam importantes efeitos biológicos que envolvem direta e/ou indiretamente, componentes do sistema circulatório. Contudo, não há estudos específicos na literatura sobre os efeitos do veneno crotálico ou de suas toxinas, em células endoteliais. As células endoteliais constituem a camada de revestimento interna dos vasos sanguíneos, denominada endotélio. Este tecido é metabolicamente ativo, com função protetora do sistema cardiovascular e desempenha papel central na regulação da função circulatória, através do controle da coagulação, permeabilidade e do tônus vascular. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt), do seu componente majoritário, a crotoxina (CTX) e de suas subunidades, fosfolipase A2 (CB) e crotapotina (CA), sobre células endoteliais, em cultura, quanto à: i) viabilidade e proliferação celular; ii) integridade das monocamadas; iii) produção de óxido nítrico, de prostaciclina e mecanismos envolvidos neste efeito. Os resultados obtidos demonstram que o veneno de Crotalus durissus terrificus afetou a viabilidade e a integridade de células endoteliais em cultura, de modo tempo-dependente e apenas na maior concentração, sugerindo sua baixa toxicidade sobre as células endoteliais. A subunidade CB, mas não a CTX nem a crotapotina, reproduziu os efeitos causados pelo VCdt. Em concentrações não citotóxicas, tanto o veneno quanto as toxinas não alteraram a proliferação celular nem a produção basal de óxido nítrico pelas células endoteliais. Por outro lado, o veneno e a subunidade CB, mas não a CTX nem a CA causaram aumento significativo da produção de prostaciclina, via COX-1 e COX-2, sendo que a expressão protéica da isoforma COX-2 foi induzida por estes agentes. Além disso, foi demonstrado que a fosfolipase citosólica é relevante para o aumento da produção de prostaciclina, induzido pela CB. Adicionalmente, foi demonstrado que a atividade catalítica da subunidade CB é essencial para os efeitos descritos. Isto reforça a sugestão de que a subunidade fosfolipásica, isoladamente, possa contribuir para os efeitos do veneno total no endotélio. Nesse sentido, se houver alguma fração desta enzima na sua forma livre, no veneno total, sugere-se que ela contribua, de modo significativo, para os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus no endotélio. / Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) and their components induces systemic effects, which interfere with blood vessel system. Endothelial cells (EC) are central elements for haemostasis, regulating blood vessel-wall permeability, blood fluidity and adhesion properties of circulating leukocytes. However, there is no available data on the effects of this venom and its components on endothelial cells. In this study, the effects of CdtV, crotoxin (CTX) which is formed by two distinct subunits named crotapotin (CA) and phospholipase A2 (CB), on endothelial cells in vitro were investigated, analyzing EC viability and proliferation, EC monolayers integrity, release of both nitric oxide and prostacyclin (PGI2). CdtV, at the highest concentration, time-dependently decreased the viability of EC and the integrity of cell monolayers. The CB subunit, but not CTX nor CA, reproduced the effects caused by crude venom. In contrast, neither EC proliferation nor release of oxide nitric were affected by non-cytotoxic concentrations of CdtV or isolated toxins. However, at the same experimental condition, both CdtV and CB increased the prostacyclin release by endothelium through activation of COX-1 and -2 enzyme systems. Moreover, these toxins upregulated protein expression of COX-2 isoform, but did not alter constitutive expression of COX-1. On the other hand, neither CTX nor CA affected basal production of PGI2. Inhibition of cytosolic PLA2 (cPLA2) by AACOCF3 significantly reduced PGI2 increments caused by both CdtV and CB implying that cPLA2 cooperates for the synthesis of PGI2 induced by them. Inhibition of the catalytic activity of CB abrogated its ability to induce the release of PGI2, thus suggesting the importance of the phospholipase A2 enzyme activity for this effect. These findings provide evidence that CdtV and CB can directly activate EC and up-regulate cyclooxygenase pathways for production of prostacyclin, an important mediator of vasodilation and inflammation. Moreover, CB through its catalytic activity may significantly contribute for the stimulatory effect of CdtV in EC. Therefore, these findings indicate novel regulatory mechanisms for both CdtV and venom secretory PLA2 in endothelial cells.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LEANDRO DOBRACHINSKI.pdf: 1309361 bytes, checksum: 9ed7a6a6c3ff40cb207d958b59532e76 (MD5) Previous issue date: 2012-03-13 / Venomous snakes have a real cocktail of pharmacological active substances and drugs that act powerfully against microorganisms. The objective of the present study was to evaluate in vitro the potential cytotoxic activity of Caudisona durissa terrificus venom in mononuclear cells (MNC) of peripheral human blood. After obtaining MNC for cell culture, the cytotoxic effect of different concentrations of crude venom was evaluated. The peripheral blood MNC were separated using a density gradient and were incubated (2x105 cells/well) with different venom concentrations (50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 e 0,0005 µg/mL) for different times (1, 3, 6, 24, 48 e 72h) and in different substrates (PHA, IL lly examining the plates after 24, 48 and 72 hours. Was also observed with different concentrations of crude venom induced ADN fragmentation in MNC. We observed that the toxicity of crude C. d. terrificus venom varies proportionally with concentration, i.e., the higher the concentration, the higher its cytotoxicity. For this reason the 0.0005µg/mL concentration of crude Caudisona durissa terrificus venom presented the lowest cytotoxic activity in peripheral human blood MNC and that the fragmentation of cellular ADN was not seen in this study. Thus, it is suggested to employ two or more different assays to confirm the induction of cell death is occurring through apoptosis. / Serpentes peçonhentas produzem uma variedade de toxinas altamente citotóxicas. Possuem um verdadeiro coquetel de substâncias farmacológicas, tornando-se uma , que atualmente vem sendo utilizados por inúmeros pesquisadores, para o desenvolvimento de novos fármacos com potente ação contra microorganismos. O presente estudo visou avaliar a potencial atividade citotóxica da peçonha de Caudisona durissa terrificus em células mononucleares (CMN) do sangue periférico humano, in vitro. Após a padronização da obtenção de CMN para cultivo celular, foi realizada a avaliação do efeito citotóxico de diferentes concentrações do veneno bruto. As CMN do sangue periférico foram separadas por meio gradiente de densidade e incubadas (2x105 células/poço) com diferentes concentrações do veneno (50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 e 0,0005 µg/mL), em diferentes tempos (1, 3, 6, 24, 48 e 72h) e substratos (PHA, IL 2). A avaliação da atividade citotóxica do veneno foi realizada, por meio da leitura das células em câmara de neubauer, após 24, 48 e 72 horas. Em conclusão, foi possível identificar que a citotoxicidade do veneno bruto de C. d. terrificus varia de forma proporcional à concentração, ou seja, quanto maior a concentração do veneno, maior a sua citotoxicidade. Com isso, a concentração de 0,0005µg/mL do veneno bruto de Caudisona durissa terrificus, neste experimento, apresentou uma baixa atividade citotóxica em CMN de sangue periférico humano e que a fragmentação do DNA celular não foi visualizada neste estudo. Desta forma, sugere-se empregar dois ou mais ensaios distintos para confirmar se a indução da morte celular está ocorrendo por meio de apoptose.