Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2018. / Serpinas sao proteinas inibidoras de serino-proteases, responsaveis pelo controle dos mais diversos processos fisiologicos e que cujo mecanismo de inibicao consite em formar um complexo covalente com a enzima alvo, em um processo de inibicao irreversivel. A alca de centro reativo (RCL) e responsavel por interagir com a protease, mimetizando um substrato, e quando clivada se insere como uma ¿À-fita no interior da serpina, trazendo a protease e causando uma distorcao no seu sitio ativo. Como as serpinas forma ligacoes covalentes com seus alvos durante a inibicao, essas proteinas tem sido utilizadas para o estudo do mecanismo de hidrolise das serino-proteases. No entanto, elas tambem oferecem a possibilidade do desenvolvimento de novas drogas contra enzimas relacionadas com patologias, como pode ser o caso da Vioserpina, uma serpina bacteriana capaz de inibir serino-proteases do tipo tripsina-like como a calicreina tecidual humana 5. Encontrar uma maneira de produzir uma Vioserpina fluorescente pode resultar no desenvolvimento de uma poderosa ferramenta para moniotramento e controle dessa e outras enzimas envolvidas com processos patologicos, como o antigeno prostatico especifico (PSA). Dessa maneira, realizamos mutacoes pontuais no gene da Vioserpina para a incorporacao do aminoacido cumarinico via par ortogonal tRNA/aaRS por supressao do codon ambar de parada. O aminoacido cumarinico e um aminoacido nao-canonico capaz de emitir fluorescencia na comprimento de onda de 450 nm quando excitado a 363 nm, permitindo o facil monitoramento e deteccao de uma proteina. Tres residuo distintos da Vioserpina foram escolhidos para a incorporacao do aminoacido cumarinico: Trp 208, Ile 342 (P4 da RCL) e Val 343 (P3 da RCL). A incorporacao nas posicoes Trp 208 e Ile 342 resultou em proteina fluorescentes, mas truncadas apos a insercao do aminoacido. Foi possivel obter uma Vioserpina completa com o aminoacido cumarinico na posicao Ile 342, embora com rendimento muito baixo. Tal mutante apresentou capacidade de inibicao e especificidade diferentes da Vioserpina wild type, em ensaios de inibicao enzimatica contra Tripsina e Quimotripsina, indicando que o aminoacido cumarinico em P4 parece causar diferentes interacoes no momento de inibicao da serpina. Para averiguar as melhores sequencias resultantes da incorporacao do aminoacido cumarinico, foi gerada uma biblioteca de genes da Vioserpina variando aleatoriamente as posicoes P4, P2, P1 e P1f da RCL, com incosporacao do aminoacido cumarinico na posicao P3 (Val 343). A biblioteca de Vioserpina foi apresentada por Phage Display no capsideo do fago M13 fusionada a proteina PIII, utilizando Biopanning para selecao das melhores sequencias com incorporacao do aminoacido nao-canonico, contra a serino-protease quimotripsina. A biblioteca de fagos gerou cinco sequencias com melhor inibicao que da Vioserpina, e mostrou que a insercao do aminoacido cumarinico parece acontecer com maior frequencia quando flanqueado por aminoacidos hidrofobicos ou sem cargas. A incorporacao do aminoacido cumarinico em sequencias da Vioserpina foi bem sucedida, sendo possivel avaliar a insercao de tal aminoacido na capacidade inibitoria dessa serpina. A investigacao da insercao de aminoacido nao-canonicos por Phage Display e Biopanning representa um grande passo para entender melhor como ocorre a incorporacao de tais aminoacidos, e quais residuos podem ocupar com maior naturalidade suas posicoes laterais. / Serpins are serine protease inhibitor proteins, responsible for the control of the most diverse physiological processes and whose mechanism of inhibition consists in forming a covalent complex with the target enzyme, in an irreversible inhibition process. The reactive center loop (RCL) acts as a bait for the protease, and when cleaved it inserts as a â-strand inside the molecule, distorting the protease active site. As serpins form covalent bonds with their targets, these proteins have been used to study the hydrolysis mechanism of serine proteases. However, they also offer the possibility of developing new drugs against disease-related enzymes, as is the case of Vioserpin, a bacterial serpin capable of inhibiting trypsin-like serine proteases such as human tissue kallikrein. Finding a way of producing fluorescent Vioserpin may result in the development of a powerful tool for monitoring and controlling this and other enzymes involved in pathological processes, such as prostate specific antigen (PSA). Thus, we performed point mutations in the Vioserpin gene for incorporation of the coumarin amino acid through tRNA/aaRS orthogonal pair by suppression of the amber stop codon. The coumarin amino acid is a non-canonical amino acid capable of emitting fluorescence at 450 nm when excited at 363 nm, allowing for easy detection of a protein. Three different residues of Vioserpin were chosen for incorporation of the coumarin amino acid: Trp 208, Ile 342 (P4 in RCL) and Val 343 (P3 in RCL). Incorporation at positions Trp 208 and Ile 342 resulted in fluorescent but truncated proteins following amino acid insertion. A complete Vioserpin bearing the coumarin amino acid at the Ile 342 position was possible, although at very low yield. Such a mutant exhibited different inhibition and specificity compared to Vioserpin wild type in enzymatic inhibition assays against trypsin and chymotrypsin, indicating that the coumarin amino acid at P4 appears to cause different interactions during serpin inhibition. To ascertain the best sequences resulting from coumarin amino acid incorporation, a Vioserpin gene library was generated by randomly varying the P4, P2, P1 and P1' positions in RCL, with coumarin amino acid incorporated at the P3 (Val 343) position. The Vioserpin library was exhibited by Phage Display in the M13 phage capsid fused to the PIII protein, using Biopanning against chymotrypsin to select the best sequences with incorporation of the non-canonical amino acid. The phage library generated five sequences with better inhibition than Vioserpin, and pointed to coumarin amino acid insertion appearing to occur more frequently when flanked by hydrophobic or uncharged amino acids. The incorporation of the coumarin amino acid into Vioserpin sequences was successful, and it is possible to evaluate the insertion of such amino acid in the inhibitory capacity of this serpin. The investigation of non-canonical amino acid insertion by Phage Display and Biopanning represents a great step to better understand how the incorporation of such amino acids occurs, and which residues may more naturally occupy their lateral positions

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2017. / Serpina é o nome dado à superfamília de proteínas com uma vasta diversidade de funções biológicas, que tem como principal característica a inibição irreversível de serino proteases. A característica estrutural mais marcante das serpinas é a presença de uma alça na sua porção C-terminal, composta por 20 aminoácidos denominados alça do centro reativo (RCL). A RCL é a região da serpina que se liga covalentemente ao sítio ativo da serino protease, promovendo a inibição irreversível da enzima pela desarticulação de estruturas funcionais essenciais para a catálise enzimática. As calicreínas teciduais humanas (KLKs) são um grupo de 15 serino proteases (KLK1-KLK15) expressas em uma gama de tecidos. A rKLK5, estudada neste trabalho, é expressa abundantemente na pele humana, e parece que exerce importante papel no processo de descamação epidermal, podendo estar relacionada à patologias, como a psoríase e dermatite atópica. Assim, nesse trabalho foi realizada subclonagem, expressão e caracterização bioquímica da atividade inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) da serpina oriunda da cianobactéria Gloeobacter violaceus, identificada pelo nosso grupo e nomeada vioserpina. Os genes codificadores da vioserpina foram previamente clonados no vetor de expressão pET-28a e por meio da técnica de mutação sítio-dirigida foram produzidos dois mutantes substituindo os resíduos de aminoácidos arginina e alanina nas posições P1 e P2 da alça do centro reativo (RCL) da vioserpina, respectivamente, por um resíduo de aminoácido glicina (VSR344G e VSA345G). O sucesso das mutações foi avaliado através de sequenciamento de DNA. As vioserpinas mutantes foram expressas na cepa bacteriana E. coli BL21(D3), purificadas pela técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel (Ni-NTA) e obtidas na forma solúvel. Foi possível visualizar a formação do complexo covalente entre a vioserpina e a KLK5 por análise em SDS-PAGE 10% confirmados pela espectrometria de massas. Também foi analisada a ação inibitória dos mutantes (VSR344G e VSA345G) frente a KLK5. Os valores de SI (estequiometria de inibição) apresentaram valores altos o que indica que é preciso uma concentração grande de inibidor, no caso os mutantes da vioserpina, para que a enzima tenha sua atividade inibida, apresentando-se desta forma uma inibição ineficiente frente a rKLK5. Nesse estudo foi possível obter um inibidor específico (vioserpina) para a rKLK5, podendo assim contribuir para o desenvolvimento de novos procedimentos terapêuticos para patologias envolvidas com o processo de descamação epidermal. / Serpin is the name given to the superfamily of proteins with wide range of biological functions, and that has as main feature the irreversible inhibition of serine proteases. The most striking structural feature of serpins is the presence of a loop in the C-terminal portion of the protein, composed by 20 aminoacids called Reative Center Loop (RCL). The RCL is the region of the serpin that binds covalently to the serine protease active site, which causes the irreversible inhibition of the enzyme by the disarticulation of functional structures essencial for the enzymatic catalysis. Human tissue kalikreins (KLKs) are a group of 15 serine proteases (KLK1-KLK15) expressed in a plethora of tissues. The rKLK5, studied in this work, is abundantly expressed in human skin, and seems to play an important role in the epidermal desquamation process, and may be related to pathologies such as psoriasis and atopic dermatitis. Therefore, in this work the subcloning, expression and biochemical characterization of the inhibitory activity of serpin mutants (VSR344G e VSA345G) of the cyanobacteria Gloeobacter violaceus, recently described by our group and named vioserpin, was proposed. The genes coding for vioserpin were previously cloned into the pET-28a expression vector and through the site-directed mutation technique two mutants were produced by substituting the arginine and alanine amino acid residues at the P1 and P2 positions of the serine reactive center loop (RCL), respectively, by a glycine amino acid residue (VSR344G e VSA345G). The success of the mutations was assessed by DNA sequencing. The mutant vioserpin was expressed in the bacterial strain E. coli BL21 (D3), purified by the nickel resin affinity chromatography technique (Ni-NTA) and obtained in the soluble form. Covalent complex formation between vioserpin and rKLK5 could be visualized by 10% SDS-PAGE analysis confirmed by mass spectrometry. We also analyzed the inhibitory action of mutants (VSR344G and VSA345G) against rKLK5. The SI values (inhibition stoichiometry) presented high values indicating that a large inhibitor concentration is required in the case of the vioserpin mutants, so that the enzyme has its inhibited activity, thus presenting an inefficient inhibition in front To rKLK5. In this study it was possible to obtain a specific inhibitor (vioserpin) for rKLK5, thus contributing to the development of new therapeutic procedures for pathologies involved with the epidermal desquamation process.