Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2007. / Submitted by Luanna Maia (luanna@bce.unb.br) on 2009-03-09T12:48:41Z No. of bitstreams: 1 Tese_Loiselene Carvalho da Trindade.pdf: 3690145 bytes, checksum: 0c6bb1644820c1ea99648a03adf90c94 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-03-09T16:04:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Loiselene Carvalho da Trindade.pdf: 3690145 bytes, checksum: 0c6bb1644820c1ea99648a03adf90c94 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-03-09T16:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Loiselene Carvalho da Trindade.pdf: 3690145 bytes, checksum: 0c6bb1644820c1ea99648a03adf90c94 (MD5) / A bactéria Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye, agente do cancro bacteriano da videira, foi relatada pela primeira vez nas áreas irrigadas do Submédio do Vale São Francisco em Petrolina, Pernambuco, em 1998. A doença também foi identificada em Juazeiro, Bahia, e posteriormente no Piauí, no Ceará, Roraima e Goiás. O uso de material propagativo livre do patógeno tornou-se uma preocupação, uma vez que a ocorrência da bacteriose ainda esta restrita a essas regiões no país e existe o risco de disseminação para outras regiões produtoras no sul e sudeste do Brasil. Com o objetivo de desenvolver um método molecular para detecção e identificação dessa bactéria, três oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com base no seqüenciamento parcial do gene hrpB. As combinações de iniciadores Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foram testados quanto à especificidade e sensibilidade para detecção do DNA de X. campestris pv. viticola. Com os dois pares de iniciadores, a amplificação foi positiva com o DNA das 44 estirpes de X. campestris pv. viticola testados, com quatro estirpes da patovar mangiferaeindicae, e cinco estirpes de X. axonopodis pv. passiflorae. Contudo, a digestão dos produtos de PCR com HaeIII permitiu diferenciar as estirpes das três patovares. Nenhum dos dois pares de iniciadores amplificou o DNA de videira, de 20 bactérias não patogênicas da flora da videira, e de nove estirpes de outros sete gêneros de bactérias fitopatogênicas. A sensibilidade dos iniciadores Xcv1F/Xcv3R e RST2/Xcv3R foi de 10 pg e 1 pg de DNA purificado de X. campestris pv. viticola, respectivamente. O limiar de detecção de RST2/Xcv3R foi de 104 UFC/ml, mas empregando-se um segundo ciclo de amplificação com o iniciador interno Xcv1F, esse limiar foi reduzido para 102 UFC/ml. Os iniciadores foram testados na detecção da bactéria em pecíolos inoculados com a estirpe UnB 1186 e embora não se tenha tido sucesso na PCR com o extrato do macerado do tecido sintomático, foi possível detectar o patógeno usando-se lavado de placas após o crescimento por 72 h ou a partir de uma única colônia diluída em 200 l de água. A identidade da bactéria foi confirmada pela análise de RFLP, que gerou o padrão típico de X. campestris pv. viticola. Com o uso de nested-BIO-PCR utilizando dois ciclos de amplificação com os iniciadores RST2/Xcv3R e Xcv1F/Xcv3R foi possível detectar X. campestris pv. viticola em plantas assintomáticas e sintomáticas, coletadas em março de 2007, em Petrolina, PE. xiii Este método mostrou-se mais eficiente que a detecção direta, ou seja, sem uma etapa de enriquecimento em meio de cultura. Além disso, foi possível reduzir para 72 horas o tempo para detecção e identificação de X. campestris pv. viticola, tempo reduzido se comparado aos métodos convencionais. A alta similaridade observada entre as duas patovares, viticola e mangiferaeindicae de X. campestris foi comprovada através da análise de seqüências de nucleotídeos de diferentes regiões genômicas, ITS, 16S rRNA, hrpB6 e o gene do citocromo “b561-like”. Os resultados também sugeriram que as duas patovares estariam mais próximas filogeneticamente a X. campestris e X. axonopodis. Testes de inoculação cruzada em videira e mangueira mostraram a capacidade de X. campestris pv. mangiferaeindicae de infectar plantas de videira e confirmaram a patogenicidade de X. campestris pv. viticola à mangueira, quando a inoculação é feita por infiltração foliar. O estudo dos perfis plasmideais mostrou variabilidade entre as estirpes em relação ao número e tamanho dos plasmídeos, sendo o primeiro relato da presença de plasmídeos em X. campestris pv. viticola. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The bacterium Xanthomonas campestris pv. viticola (Nayudu) Dye, causal agent of grapevine bacterial canker, was first detected in Brazil in the irrigated areas of the São Francisco river basin, in Petrolina, State of Pernambuco, in 1998. The disease was also reported in Juazeiro, Bahia and later in the states of Piauí, Ceará, Roraima and Goiás. The use of pathogen-free propagative material has become an important concern, considering the restricted occurrence of this pathogen in the country and the risk of dissemination to other grapevine production regions in the south and southeast of the country. In order to develop a molecular method for detection and identification of this pathogen, three primers were designed based on the partial sequences of the hrpB gene. The primers combinations Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R were tested for specificity and sensitivity in detecting X. campestris pv. viticola DNA. With the two sets of primers, amplification was positive with all 44 X. campestris pv. viticola isolates tested, 4 isolates of pathovar mangiferaeindicae and 5 of X. axonopodis pv. passiflorae. Digestion of PCR products with HaeIII allowed differentiation of these 3 pathovars. None of the primer pairs were able to amplify grapevine DNA, DNA from 20 non pathogenic bacterium from the grapevine microflora, or DNA from 9 isolates from 7 genera of plant pathogenic bacteria. Sensitivity of the primers Xcv1F/Xcv3R and RST2/Xcv3R was 10 pg and 1 pg of purified X. campestris pv. viticola DNA, respectively. The detection limit for RST2/Xcv3R was 104 UFC/ml, but this limit could be lowered to 102 CFU/ml with a second round of amplification using the internal primer Xcv1F. The primers were tested for detecting of X. campestris pv. viticola in grapevine petioles previously inoculated with strain UnB 1186, and although amplification was not possible using extracts of macerated plant tissue, detection was possible using agar plate washes after 72 h of growth, or from a single colony diluted in 200 l of water. Using Nested-BIO-PCR with two amplification rounds with RST2/Xcv3R and Xcv1F/Xcv3R primers, it was possible to detect X. campestris pv. viticola in both symptomatic and asymptomatic plants. This method was more effective than a method that employed direct detection from boiled macerated extracts with no previous enrichment on culture medium. The use of BIO-PCR reduced the time needed for detecting and identifying X. campestris pv. viticola to 72 hours, when compared to more traditional diagnostic methods. xv The high similarity observed between the two pathovars of X. campestris, viticola and mangiferaeindicae was cnfirmed by the analysis of nucleotide sequences from different genomic regions, ITS, 16S rRNA, hrpB6 and the cytochrome b561-like gene. The results also suggested that these two pathovars are phylogenetically related to X. campestris and X. axonopodis. Cross inoculation tests on grapevine and mango plants inoculation, showed the ability of X. campestris pv. mangiferaeindicae to infect grapevine and confirmed the pathogenicity of X. campestris pv. viticola to mango plants, when using the infiltration technique. Plasmid DNA extractions showed variability among strains of the two pathovars in plasmid number and size. This is the first report of plasmid occurrence in X. campestris pv. viticola.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2013. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-02T18:39:34Z No. of bitstreams: 1 2013_LiamarMariadosAnjos_Parcial.pdf: 4370253 bytes, checksum: 1e942fbfab25e231f1108052036de9bc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-06-02T20:43:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LiamarMariadosAnjos_Parcial.pdf: 4370253 bytes, checksum: 1e942fbfab25e231f1108052036de9bc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-02T20:43:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LiamarMariadosAnjos_Parcial.pdf: 4370253 bytes, checksum: 1e942fbfab25e231f1108052036de9bc (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e Embrapa Uva e Vinho. / A videira (Vitis vinifera L.) destaca-se entre as mais importantes espécies frutíferas cultivadas mundialmente. O míldio, causado pelo oomyceto Plasmopara viticola (Berk & Curtis.) Berl. & de Toni é uma das principais doenças da videira no mundo, causando sérios prejuízos à vitivinicultura. Este trabalho envolveu um conjunto de experimentos visando gerar informações para estudos genéticos do gênero Plasmopara, infectando videiras no Brasil. O Capítulo 1 teve como objetivo estudar a diversidade genética e a estrutura populacional de isolados de Plasmopara viticola que infectam vinhedos em diferentes regiões brasileiras. Para isto, 34 novos marcadores microssatélites de P. viticola foram desenvolvidos através de sequenciamento NGS (Next Generation Sequencing) seguido de montagem parcial de novo do genoma do fungo. Testes dos novos marcadores juntamente com dez controles possibilitaram a seleção de uma bateria mista de 15 marcadores que foram usados para genotipar 92 isolados de P. viticola coletados em regiões produtoras de uva no Brasil. A amostra de 92 isolados apresentou estruturação, tendo sido dividida em três subpopulações, denominadas PvG1(Fst=0,56), PvG2 (Fst=0,25) e PvG3 (Fst=0,24). Foi observado um grande efeito no uso de pequenas baterias de marcadores moleculares na análise genética de populações do patógeno, afetando a interpretação dos resultados de substruturação populacional. A classificação geográfica dos isolados apresenta associação com a classificação subpopulacional do patógeno. Os isolados oriundos dos Estados de São Paulo e Minas Gerais apresentam maior diversidade de subpopulações do que isolados de outras regiões tradicionais no cultivo de uva no Brasil, como o Rio Grande do Sul. O emprego de ferramentas moleculares como sequenciamento NGS e marcadores moleculares contribui para uma melhor compreensão das variáveis que afetam as populações de P. viticola. O Capítulo 2 teve por objetivo construir mapas genéticos para os genitores da progênie F1 do cruzamento CNPUV 733-34 x CNPUV 1103-88 e mapear regiões do genoma de videira que conferem resistência ao patógeno. O mapa do genitor feminino CNPUV 733-34 cobriu 1.104 cM do genoma de videira, com distância média entre marcadores de 6,69 cM. O mapa do genitor masculino CNPUV 1103-88 cobriu 958 cM do genoma de videira, com distância média entre marcadores de 7,48 cM. O fenótipo da interação patógeno-hospedeiro foi mensurado em bioensaios em ambiente controlado e infecção natural no campo. Três QTLs foram detectados por mapeamento de Intervalo Simples e Intervalo Composto no mapa genético do genitor feminino CNPUV 733-34. Um dos QTLs está localizado no GL 5, no intervalo entre os marcadores UDV041-UDV042 (LOD= 3,9) e explica 6% da variação fenotípica para resistência a P. viticola. Dois outros QTLs (C18-1 e C18-2), apresentam efeito moderado de resistência a P. viticola, foram detectados no GL 18, e explicam até 22,3% da variação fenotípica. O intervalo do QTL C18-1 (LOD= 7,6) é flanqueado pelos marcadores VMC7F2 e VVIN16, que estão separados por 5 cM. O intervalo do QTL C18-2 (LOD= 6,3) é flanqueado pelos marcadores VVIU04 e VVIN83, separados por 22 cM. O mapeamento genético de QTLs de resistência ao míldio utilizando diferentes fontes de resistência nos programas de melhoramento genético de videira é um passo importante para o aumento da eficiência de desenvolvimento de variedades resistentes ao patógeno. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Grapevine (Vitis vinifera L.) is among the most important fruit species cultivated worldwide. Downy mildew, caused by the oomycete Plasmopara viticola (Berk & Curtis.) Berl. & de Toni, is one of the main diseases of grapevine in different grape producing regions of the world, causing serious damage to grape production. This work is based on a group of experiments aimed at generating information useful to genetic studies of the genus Plasmopara, which infect grapevine in Brazil. The objective of Chapter 1 was to study the genetic diversity and population structure of Plasmopara viticola which infect grapevine fields in different regions of Brazil. 34 new P. viticola microsatellite markers were developed by NGS (Next Generation Sequencing) followed by partial de novo assembly of the fungus genome. A mixed battery of new and ten control microsatellites was used to genotype 92 P. viticola isolates, collected in grape producing regions of Brasil. A sample of 92 isolates showed a significant population structure, with isolates clustering into three subpopulations, called PvG1 (Fst=0,56), PvG2 (Fst=0,25) e PvG3 (Fst=0,24). The effect of small batteries of molecular markers used to evaluate the genetic structure of the pathogen populations was tested and found to affect the interpretation of the results. The geographic classification of the isolates is associated with the genetic groups detected in the pathogen sample. Isolates collected in São Paulo and Minas Gerais show greater diversity of genetic groups (subpopulations) than isolates from other traditional grape growing regions of Brazil, such as Rio Grande do Sul. The use of molecular tools, such as NGS and molecular markers, contribute for a better understanding of variables affecting the populations of P. viticola. The objective of Chapter 2 was to develop genetic maps for the parental varieties of an F1 progeny derived from the cross CNPUV 733-34 x CNPUV 1103-88 and map grapevine genomic regions associated with resistance to the pathogen. The map of the female genitor CNPUV 733-34 covered 1,104 cM, with an average recombination distance between markers of 6.69 cM. The map of the male genitor CNPUV 1103-88 covered 958 cM, with an average recombination distance between markers of 7.48 cM. Host-pathogen interaction phenotype was measured by controlled bioassays using artificial inoculation, and by natural infection in the field. Genetic mapping determined the location of P. viticola resistance QTLs in grapevine. Three QTLs mapped on the female genitor genome were detected by Interval Mapping and Composite Interval Mapping procedures. One of these QTLs was located in LG 5, in the UDV041-UDV042 marker interval (LOD= 3.9), explaining 6% of the phenotypic variation for P. viticola resistance. Two additional QTLs (C18-1 e C18-2), showing a moderate effect on P. viticola resistance, were detected in LG 18, explaining up to 22.3% of the phenotypic variation. The C18-1 QTL interval (LOD= 7.6) is flanked by markers VMC7F2 and VVIN16, which are 5 cM apart. The C18-2 QTL interval (LOD= 6.3) is flanked by markers VVIU04 and VVIN83, which are 22 cM apart. Mapping downy mildew resistance QTLs using germplasm accessions derived from different sources of resistance in breeding programs is an important step towards higher efficiency in the improvement of grapevine resistance to the pathogen.