Orientadores: Renata de Oliveira Mattos-Graner, Jose Francisco Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T12:50:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stipp_RafaelNobrega_D.pdf: 11660668 bytes, checksum: b140f6b3e8ab94a99f86a4eee7101635 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: S. mutans são os principais patógenos da cárie, pois expressam diversas proteínas importantes para a colonização e aumento em proporção nos biofilmes dentais na presença de sacarose. Estas incluem as glicosiltransferases (Gtf), que sintetizam uma matriz extracelular de glucano a partir da sacarose, e proteínas ligadoras de glucano (Gbps), as quais participam da interação entre S. mutans e matriz de glucanos. Há evidências de que diversos genes de virulência são regulados por sistemas reguladores de transcrição de dois componentes, dentre os quais CovR (de Control of Virulence) e VicRK (de Virulence Control). Propomos neste estudo descobrir novos alvos e/ou funções dos sistemas CovR e VicKR e avaliar características celulares e fenotípicas decorrentes da ausência desses sistemas. Para isso construímos cepas S. mutans mutantes knockout dos genes covR (SMU.1924) ou vicK (SMU.1517) e realizamos comparações com as respectivas cepas selvagens (WT). A caracterização dos transcriptomas foi triada por microarray e quantificada por qPCR, demonstrando que vinte e três genes foram super expressos na ausência de CovR, enquanto trinta genes foram reprimidos na ausência de VicK. Para demonstrar a regulação direta, as regiões promotoras destes genes foram submetidas a ensaios de retardamento da mobilidade eletroforética com as proteínas recombinantes CovR ou VicR. Além dos genes já conhecidos, os ensaios mostraram CovR como regulador negativo de quatro novos genes e VicR como regulador de cinco novos genes, dentre os quais há, em ambos os casos, genes com provável função na biogênese da parede celular. Nos ensaios fenotípicos, os mutantes covR- demonstraram diminuição no crescimento total em cultura, enquanto que os mutantes vicK observados por microscopia eletrônica de varredura apresentaram formação de cadeias extremamente longas com células atípicas. A formação de biofilme in vitro por mutantes covR- foi de 3 a 17 vezes maior comparado ao WT, enquanto mutantes vicK- demonstraram uma redução de 3,5 a 6,5 vezes. Foi observado aumento de 40% na hidrofobicidade celular nos mutantes covR- quando comparados a cepa WT, enquanto os mutantes vicK- tiveram aumento de 10 vezes, tornando-se altamente hidrofóbicos, provavelmente em decorrência das alterações na superfície da parede celular. Os mutantes covR- foram 30% mais resistente a autólise que as cepas WT, enquanto que os mutantes vicK- possuem o dobro de resistência. Em conclusão, os regulons controlados por CovR e VicKR incluem diversos genes com provável função na biogênese de parede celular, além de genes importantes para a formação de biofilmes. A inativação destes sistemas promoveu alterações fenotípicas notáveis, que realçam os achados daparticipação destes sistemas na biogênese das estruturas celulares. Palavras-chave: Análise em Microsséries, Parede Celular, Cárie Dental, Regulação Bacteriana da Expressão Gênica, Virulência. / Abstract: Streptococcus mutans, a major dental caries pathogen, expresses several virulence genes that mediate its growth and accumulation on tooth surfaces. In this process, GtfB and GtfC catalyze the extracellular synthesis of water-insoluble glucan matrix from sucrose, and are essential for accumulation of S. mutans in the dental biofilm. Glucan binding protein B might also mediate cell surface interaction with glucan. Two component transduction systems, such as CovR (Control of Virulence) and VicRK (Virulence Control), regulate, at least, part of S. mutans virulence genes. In this study we characterized CovR and VicRK functions and some phenotypic traits related to their absences. Knockouts strains covR- (SMU.1924) and vicK- (SMU.1517) strains were constructed and compared by differential microarray against wild type. Quantitative RT-PCR confirmed twenty-three up-regulated genes in covR-, while thirty down-regulated genes in vicKmutant. Recombinant CovR and VicR proteins were used in protein:DNA-promoter electrophoretic mobility shift assay (EMSA) to confirm direct regulator-promoter interaction and transcription. In addition to already-know CovR and VicR targets, qPCR and EMSA revealed that CovR acts as a negative regulator of four additional genes, and VicR controls five undescribed promoters. In both cases, genes controlled are mainly involved in biofilm growth and in cell wall biogenesis. Phenotypically, covR- mutants showed lower yield in culture, while vicK- mutants had altered cell morphology and long chains formation. Inactivation of covR significantly increased in vitro biofilm formation in all strains (3 to 17-fold increase, p<0.01), while vicK mutants showed poor biofilm growth (3.5 to 6.5-fold reduction; p<0.01). Cell hydrophobicity was increased by 40% in covR- mutants and by 10- fold in vicK- mutants, possibly due cell surface changes. Both knockoutsalso increased the autolysis resistance, in about 30% for the covR- mutants and in 2- fold for the vicK- mutant. It is concluded that CovR and VicR systems have important participation on S. mutans physiology, regulating genes that not only are involved in biofilm formation but that have functions in cell wall biogenesis. / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental