As proteínas que contem domínios ricos em leucina (LRR) mediam interações macromoleculares que estão envolvidas em muitos processos biológicos como infecção bacteriana em células hospedeiras e respostas imunológicas de plantas. Estudos anteriores em nosso laboratório identificaram um gene que codifica uma proteína contendo 6 LRRs (LaLRR17) em L. (L.) amazonensis. O LaLRR17 é um gene com expressão estágio regulada sendo abundantemente expresso na fase amastigota. Seqüências homólogas ao gene LaLRR17 foram encontradas em todas as espécies de Leishmania analisadas. Esse trabalho tem como objetivo a caracterização da proteína homóloga em L. (L.) major (LmLRR17). Anticorpos obtidos contra seqüências conservadas das proteínas LaLRR17 e LmLRR17 permitiram o estudo da abundância protéica em diferentes estágios do parasita. Curiosamente, a proteína LmLRR17 foi encontrada em maior abundância em promastigotas procíclicos em vez de amastigotas. Linhagens hiperexpressoras da proteína LmLRR17 ou expressoras da proteína LaLRR17 em fusão com o epitopo viral myc foram obtidas. As proteínas quiméricas foram expressas seguindo o mesmo padrão observado na cepa selvagem. O fenótipo desses mutantes foi avaliado mediante infecções de macrófagos in vitro. A hiperexpressão da proteína LmLRR17 em L. (L.) major não alterou o fenótipo da infecção in vitro. Por outro lado, a expressão da proteína heteróloga, LaLRR17, em promastigotas de L. (L.) major levou a incremento na virulência com maior número de células infectadas e de parasitas por célula. Esses resultados indicam que a expressão da proteína LmLRR17 em L. (L.) major é fortemente regulada. Esse trabalho também mostra que a expressão da proteína LaLRR17 em L. (L.) major leva a um aumento na infectividade. / Proteins containing leucine rich repeats (LRR) are known to be involved in macromolecular interactions in many processes such as signal transduction, cell-adhesion, RNA processing, apoptosis, disease resistance and immune response. A previous study in our laboratory identified a L. (L.) amazonensis gene encoding a protein containing 6 LRRs (LaLRR17). LaLRR17 is a stage-regulated gene expressed with increased abundance in the amastigote stage. Highly conserved homologues of LaLRR17 were found in all Leishmania species analyzed. Therefore, the aim of this study was to characterize the homologous protein of L. major (LmLRR17). Antibodies raised against peptide sequences common to LaLRR17 and LmLRR17 allowed the study of the steady-state protein abundance. Interestingly, LmLRR17 protein was found to be up-regulated in procyclic promastigotes, instead of amastigotes. Mutants of L. (L.) major overexpressing a myc-tagged version of LmLRR17 or of LaLRR17 protein were obtained. In these parasites, the chimeric proteins were expressed following the same pattern of expression observed in the wild type parasites. The phenotype of these mutants was assessed in vitro through macrophage infections. Overexpression of LmLRR17 protein in L. (L.) major resulted in an unaltered phenotype. On the other hand, overexpression of LaLRR17 in L. (L.) major induced an increase in virulence with a higher number of infected cells and intracellular parasites. These results indicate that the expression of LmLRR17 protein in L. major is tightly regulated and the expression of the heterologous LaLRR17 protein increased infectivity in vitro.

Orientador: Rodrigo Tavanelli Hernandes / Resumo: A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um importante agente causador de diarreia aguda e persistente em crianças e adultos em todo o mundo. EAEC é definida como isolados de E. coli que produzem o padrão de aderência agregativa (AA) em células epiteliais (HeLa e/ou HEp-2) cultivadas in vitro. O patotipo EAEC pode ser dividido em típico e atípico com base na presença do gene aggR, que codifica um ativador transcricional, presente apenas no primeiro grupo. O objetivo deste estudo foi caracterizar uma coleção de isolados de EAEC obtidos de pacientes com diarreia durante um período de 7 anos de vigilância epidemiológica (2010-2016). Um total de 220 isolados de EAEC (194 típicas e 26 atípicas) foi classificado nos distintos grupos filogenéticos de E. coli, e caracterizados quanto aos sorotipos (O:H), padrão de aderência produzidos em células HeLa, sensibilidade aos antimicrobianos, e a presença de 25 genes responsáveis por codificarem fatores de virulência no patotipo EAEC. A maioria dos isolados de EAEC foi classificada nos grupos filogenéticos A (44,1%; 97/220) e B1 (21,4%; 47/220). Em relação ao padrão de aderência, observamos que 92,7% (204/220) produziram o padrão AA. Além disso, foram identificados nove isolados (4,1%; 9/220) que produziram a aderência em cadeia (CLA), dos quais seis produziram concomitantemente o padrão AA, além de isolados de EAEC que produzem um padrão de aderência indefinido (1,4%; 3/220) e isolados não aderentes (3,6%; 8/220). Foi identificado some... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is an important agent that causes acute and persistent diarrhea in children and adults worldwide. EAEC is defined as E. coli isolates that produce the aggregative adherence pattern (AA) on epithelial cells (HeLa and/or HEp-2) cultured in vitro. The EAEC pathotype can be divided in typical and atypical based on the presence of the aggR gene, which encodes a transcriptional activator, in the former group. The aim of this study was to characterize a collection of EAEC isolates obtained from diarrheal patients over a 7-year period of surveillance (2010-2016). A total of 220 EAEC isolates (194 typical and 26 atypical) were evaluated regarding the phylogenetic classification, serotypes, adherence pattern produced on HeLa cells, susceptibility to antimicrobial drugs and the presence of 25 virulence factor-encoding genes. The majority of the EAEC isolates were assigned to phylogroups A (44.1%; 97/220) and B1 (21.4%; 47/220). Regarding the adherence pattern, was observed that 92.7% (204/220) produced AA. Moreover, we identified nine isolates (4.1%; 9/220) that produced the chain-like adherence (CLA), with six of them producing concomitantly the AA pattern, besides EAEC isolates producing an undefined adherence (1.4%; 3/220) and isolates non-adherent (3.6%; 8/220). Only 0.9% (2/220) of the EAEC isolates studied presented the multidrug resistance phenotype. The genes encoding for the major pilin subunit of all five previously described aggregati... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Yersinia pestis, the gram-negative causative agent of plague, is a master of immune evasion. The bacterium possesses a type three secretion system which translocates Yop effector proteins into host immune cells to inhibit a number of immune and cell signaling cascades. Interestingly, this apparatus is not expressed at low temperatures such as those found within the flea vector and is therefore neither in place nor functional when the bacteria are first transmitted into a mammalian host. However, the bacterium is still able to avoid activating the immune system, even very early during infection. When grown at 37°C (human body temperature) Y. pestis produces a tetra-acyl lipid A molecule, which is antagonistic to the human Toll like receptor 4/MD2, the major lipopolysaccharide recognition receptor. Although tetra-acyl lipid A binds this receptor complex, it does not induce signaling, and in fact inhibits the receptors interaction with other stimulatory forms of lipid A. The work undertaken in this thesis seeks to determine if the production of tetra-acyl lipid A by Y. pestis is a key virulence determinant and was a critical factor in the evolution of Y. pestis from its ancestral parent Yersinia pseudotuberculosis. By examining the enzymes involved in the lipid A biosynthesis pathway, it has been determined that Y. pestis lacks LpxL, a key enzyme that adds a secondary acyl chain on to the tetra acyl lipid A molecule. In the absence of this enzyme, Y. pestis cannot produce a TLR4 stimulating form of lipid A, whereas Y. pseudotuberculosis does contain the gene for LpxL and produces a stimulatory hexa acyl lipid A. To determine if the absence of LpxL in Y. pestis is important for virulence, LpxL from E. coli and Y. pseudotuberculosis were introduced into Y. pestis. In both cases the addition of LpxL led to bacterium which produced a hexa-acylated lipid A molecule and TLR4/MD2 stimulatory LPS. To verify the LpxL phenotype, lpxL was deleted from Y. pseudotuberculosis, resulting in bacteria which produce tetra-acylated lipid A and nonstimulatory LPS. Mice challenged with LpxL expressing Y. pestis were found to be completely resistant to infection. This profound attenuation in virulence is TLR4 dependent, as mice deficient for this receptor rapidly succumb to disease. These altered strains of the bacterium also act as vaccines, as mice infected with Y. pestis expressing LpxL then challenged with wild type Y. pestis do not become ill. These data demonstrate that the production of tetra-acyl lipid A is a critical virulence determinant for Y. pestis, and that the loss of LpxL formed a major step in the evolution of Y. pestis from Y. pseudotuberculosis. These bacterial strains were also used as tools to determine the contributions of different innate immune receptors and adaptor molecules to the host response during Y. pestis infection. The use of LpxL expressing Y. pestis allowed identification of the innate immune pathways critical for protection during Y. pestis infection. This model also established that CD14 recognition of rough LPS is critical for protection from Y. pestisexpressing LpxL, and activation of the IL-1 receptor and the induction of IL-1β plays a major role in this infection as well. The lipid A acylation profile of gram negative bacteria can have a direct and profound effect on the pathogenesis of the organism. This work illustrates a previously unknown and critical aspect of Y. pestis pathogenesis, which can be extended to other gram-negative pathogens. The greater detail of the contributions which different host adaptor and receptor molecules make to the overall innate immune signaling pathway will allow a better insight into how gram negative infections progress and how they are counteracted by the immune system. Alterations of the lipid A profile of Y. pestis have important implications for the production of vaccines to Y. pestis and other gram negative pathogens. Taken together, this work describes a novel mechanism for immune evasion by gram negative bacteria with consequences for understanding the immune response and the creation of more effective vaccines, both of which will decrease the danger posed by this virulent pathogen.

Yersinia pestis, the causative agent of plague, specializes in causing dense bacteremia following intradermal deposition of a small number of bacteria by the bite of an infected flea. This robust invasiveness requires the ability to evade containment by the innate immune system. Of the various mechanisms employed by Y. pestis to subvert the innate immune response and to proliferate rapidly in mammalian tissue, only a few are well-characterized. Here, I present two complementary genetic analyses of Y. pestis adaptations to the mammalian environment. In the first, genome-wide fitness profiling for Y. pestis by Tn-seq demonstrates that the bacterium has adapted to overcome limitation of diverse nutrients during mammalian infection. In the second, a series of combinatorial targeted mutations disentangles apparent functional redundancy among the effectors of the Y. pestis type III secretion system, and we report that YpkA, YopT, and YopJ contribute to virulence in mice. We have also begun to investigate a novel relationship between Y. pestis and mammalian platelets, a highly abundant cell type in plasma. I present evidence that Y. pestis has evolved specific mechanisms to interfere with platelet activation, likely in order to evade immune responses and promote maintenance of bacteremia by undermining platelet thrombotic and innate immune functions. The principles guiding this work – systematic genetic analysis of complex systems, coupled with rational modification of in vitro assays to more closely mimic the in vivo environment – are a generalizable approach for increasing the efficiency of discovering new virulence determinants in bacterial pathogens.

Skin infections by keratinophilic fungi are commonly referred to as dermatophytosis and represent a major health burden worldwide. Although patient numbers are on the rise, data on virulence factors, their function and kinetics are scarce. We employed an ex vivo infection model based on guinea pig skin explants (GPSE) for the zoonotic dermatophyte Trichophyton (T.) benhamiae to investigate kinetics of the virulence factors subtilisin (sub) 3, sub 6, metallocarboxypeptidase A (mcpA) and isocitrate lyase (isol) at gene level for ten days. Fluorescence in situ hybridization (FISH) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were used to detect and quantify the transcripts, respectively. Kingdom-spanning, species-specific and virulence factor-specific probes were successfully applied to isolated fungal elements showing inhomogeneous fluorescence signals along hyphae. Staining results for inoculated GPSE remained inconsistent despite thorough optimization. qPCR revealed a significant increase of sub 3- and mcpA-transcripts toward the end of culture, sub 6 and isol remained at a low level throughout the entire culture period. Sub 3 is tightly connected to the de novo formation of conidia during culture. Since sub 6 is considered an in vivo disease marker. However, the presented findings urgently call for further research on the role of certain virulence factors during infection and disease.

No description available.

<p>lmmunocompromised, burned, and cystic fibrosis patients are highly susceptible to severe and chronic <em>Pseudomonas</em> infections. Extracellular virulence factors, such as type IV pili (T4P), contribute to the establishment and maintenance of infection in these hosts. T4P are hairlike appendages involved in attachment to and colonization of biotic and abiotic surfaces, DNA uptake, biofilm formation, virulence and twitching motility. In<em> Pseudomonas aeruginosa</em>, the pilus fibre-primarily composed of PilA-is directed by the inner membrane subcomplex PilM/N/O/P to PilQ, the secretin pore. FimV is an inner membrane protein that contains a periplasmic region that binds peptidoglycan and a cytoplasmic region containing tetratricopeptide repeat (TPR) protein-protein interaction domains. FimV is essential for twitching motility in <em>P. aeruginosa</em>, but its exact function is not well understood. Here we investigate the role of the cytoplasmic region of FimV in the T4P system. Co-purification studies revealed that PilM and PilG, a protein proposed to be involved in T4P chemotaxis, interact with the cytoplasmic region of FimV. Fluoresence microscopy was used to test the role of FimV in the localization of a functional PilG-YFP fusion. In the wild type, PilG is polarly localized, while in a <em>fimV</em> mutant, PilG becomes diffuse. The interactions between FimV with PilG and PilM may play a pivotal role in twitching motility as <em>fimV</em> mutants lacking the cytoplasmic region are incapable of twitching. In this study, we have shown that FimV is interacting with components of the T4P chemotaxis system, which may be important for cAMP regulation.</p> / Master of Science (MSc)

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Swine postweaning diarrhea (PWD) is a disease of considerable economic importance and is commonly associated with Escherichia coli. However, the vimlence mechanisms of E. coli associated with PWD have not all been elucidated. In the present study, a collection of 32 porcine E. coli 045 strains isolated from PWD were examined genotypically for the presence of virulence detenninants and phenotypically for adherence to mammalian cells in vivo and in vitro and for the expression of virulence factors related to their pathogenicity. Our results indicated that these isolates did not possess the virulence determinants, LT, STap, STb, VT1, VT2, F4, F5, F6, and F41 of enterotoxigenic or verotoxigenic E. coll. However, the majority of the strains carry eae^-related nucleotide sequences and are able to induce attaching and effacing (A/E) lesions in experimentally inoculated gnotobiotic piglets in vivo and on pig ileal expiants in vitro. The A/E lésions induced by these strains were characterized by intimate adherence of bacteria to the intestinal epithelial cell membrane with effacement of the microvilli, identical to those observed in the natural infection of pigs and to those induced by human A/E E. coli (AEEC). We also observed that the severity and extent of A/E lésions appeared to be related to the time of onset and the severity of the diarrhea in the inoculated piglets indicating an implication of A/E lesions in the induction of diarrhea in the experimentally inoculated piglets. However, none of these 045 isolates exhibited localized adherence to HEp-2 cells. The A/E-positive 045 isolates expressed an antigenically related 97 kDa outer membrane protein. The amino-terminal sequence of this protein showed 100% identity in the stretch of all known thirteen amino acids to the EaeA protein derived from the eaeA genes of human enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli, indicating that it is the eaeA gene product of porcine A/E isolates. The EaeA protein of E. coli 045 is serologically related to the EaeA protein of rabbit and human AEEC strains. It has an apparent isoelectric point of 8.4, is located in the bacterial outer membrane and is exposed on the bacterial surface. Most notably, the capacity of 045 isolates to induce A/E lesions appears to be correlated to the production of the EaeA protein, suggesting that expression of the EaeA protein is important for bacterial attachment to and effacement of enterocytes. Thus, we demonstrated that the E. coli 045 isolates associated with PWD in pigs are AEEC and that expression of the EaeA protein plays an important role in the pathogenicity of these isolates. We suggest that E. coli isolates capable of inducing A/E lesions could be one of the causative agents of swine PWD. / Escherichia coli (E. colî) est une bactérie gram-négative appartenant à la famille des entérobactéries. Elle constitue une grande partie de la flore intestinale normale chez l'homme et les animaux. Toutefois, certaines souches peuvent entraîner des infections intestinales ou extra-intestinales (237). Actuellement, les souches de E. coli responsables d'infections intestinales peuvent être regroupées en sept différentes classes: E. coli entérotoxinogènes (ETEC); E. coli entéroinvasifs (EIEC); E. coli entéropathogènes (EPEC); E. coli entérohémorrhagiques (EHEC); E. coli vérotoxinogènes (VTEC); E. coli adhèrent de manière diffuse (DAEC); E. coli entéroaggregatifs (EAggEC) (214). E. coli est capable d'induire la diarrhée, via divers mécanismes. En effet, ce micro-organisme possède différents facteurs de virulence spécifiques interagissant avec la muqueuse intestinale. Les ETEC adhèrent à la muqueuse de l'intestin grêle, grâce à des adhésines fimbriaires, sécrètent des entérotoxines provocant ainsi une diarrhée aqueuse. Les EIEC envahissent les cellules épithéliales du côlon et entraînent une dysenterie (217). Les EPEC sont responsables d'un grand nombre de diarrhées infantiles. Ils sont définis comme des souches non-entéroinvasives qui ne produisent aucune entérotoxine classique (73). Les EPEC adhèrent intimement à la muqueuse intestinale causant la destruction des microvillosités. Ce type de phénomène est appelé communément des lésions attachantes et effaçantes (A/E). Le nom de AEEC a été attribué aux souches d’E. coli produisant ce type de lésions (73). Les EHEC sécrètent des vérotoxines (VT) et sont de plus en plus souvent incriminés dans des épidémies de colite hémorragique. Ces souches sont également des AEEC. Les VTEC produisent une vérotoxine. Quant aux infections induites par DAEC et par EAggEC, leur mécanisme pathogène demeure actuellement peu connu (214). Parmi les différentes catégories d'E. coli diarrhéiques, seuls les ETEC et les VTEC ont été formellement identifiés chez le porcelet (99). D'autres classes d'E. coli entéropathogènes existent probablement chez le porcelet; toutefois, leur rôle demeure méconnu. En période post-sevrage, la diarrhée constitue l'une des principales causes de morbidité et de mortalité (99). La pathogénicité de ce type de diarrhée apparaît beaucoup plus complexe que celle des diarrhées néonatales. Des agents infectieux tels que E. coli, le rotavirus et le coronavirus de la gastro-entérite transmissible sont régulièrement mis en évidence chez les porcelets diarrhéiques en période post-sevrage (99). Les E. coli sont impliqués dans 50% et plus de cas de diarrhée qui apparaissent généralement pendant la première semaine post-sevrage. La majorité des souches isolées chez ces porcelets appartiennent aux classes ETEC (155, 242), ou VTEC (122). Il existe toutefois d'autres souches d'E. coli impliquées dans les troubles de diarrhée post-sevrage. Au Québec, nous avons caractérisé des souches appartenant au sérogroupe 045 qui sont associées à la diarrhée post-sevrage du porcelet et à des lésions d'A/E. Cependant, le mécanisme impliqué dans le développement de ces diarrhées reste encore inconnu. Les objectifs de notre étude étaient multiples: (l) caractériser génotypiquement plusieurs souches 045 afin d'identifier la présence de facteurs de virulence spécifiques aux ETEC, VTEC et AEEC; (2) déterminer la capacité de ces souches à causer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2; (3) développer une technique in vitro permettant d'étudier la capacité des différentes souches d'E. coli 045 d'induire les lésions d'A/E; (4) identifier les principales structures membranaires d'E. coli responsables du développement des lésions d'A/E. Dans le but de caractériser génotypiquement des souches 045, nous avons démontré que les 32 souches d'E. coli 045 examinées étaient majoritairement négatives pour les sondes spécifiques aux entérotoxines LT, STap, STb, VT2 et pour les fimbriae F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) et F41 rencontrés chez ETEC et VTEC. Parmi ces souches, une seule était positive pour STb et trois l'étaient pour le fimbriae F4. De plus, les souches isolées ont été examinées aussi pour la présence de eaeA Ç"E. coli attaching and effacing") b^jA ("bundle-forming pili") et EAF ("E. coli adherence factor"). Ces gènes étant associés aux souches AEEC chez l'homme. Des 32 souches isolées, 25 hybridaient avec une sonde spécifique au gène eaeA et 11 avec une sonde spécifique à la protéine EAF. Cependant, aucune souche n'a réagit avec la sonde spécifique au gène bjpA. Ces résultats indiquent que les souches 045 n'appartiennent ni à la famille des ETEC ni à celle des VTEC, mais possèdent certains facteurs de virulence des AEEC. Dans le but de déterminer la capacité des souches 045 à provoquer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2, nous avons démontré que 10 des 12 souches eaeA-positives causent les lésions d'A/E chez les porcs nouveau-nés infectés expérimentalement, alors qu'aucune lésion d'A/E n'a été décelée avec les trois souches eaeA-négatives. De plus, nous avons observé un attachement intime des bactéries à la surface cellulaire et un effacement des microvillosités accompagnés d'une formation de structures en piédestal et en forme de coupe. Ces lésions semblent être identiques à celles décrites pour les souches d'EPEC chez l'homme. Cependant, contrairement aux souches AEEC humaines, aucune souche porcine n'a pu démontré une adhérence au niveau des cellules HEp-2. Chez le porc inoculé, nous avons pu observer une corrélation entre la sévérité des lésions et celle de la diarrhée. Cette observation indique que les lésions d'A/E pourraient être impliquées dans l'induction de la diarrhée. Nos résultats démontrent l'importance du gène eaeA dans les souches porcines. Nous avons également montré que les souches d'E. coli 045 font partie intégrante de la famille des AEEC. Nos résultats suggèrent aussi l'existence de différents mécanismes de pathogénicité chez les souches 045. Afin de déterminer la capacité des souches d'E. coli 045 à induire des lésions d'A/E, nous avons développé une nouvelle technique m vitro utilisant la culture de l'iléon de porcelet nouveau-né. Lors de l'inoculation des cultures avec des isolats 045, nous avons observé un attachement des bactéries et un effacement des microvillosités accompagnés de structures en piédestal et en forme de coupe. L'attachement initial des bactéries aux entérocytes a été observé deux à quatre heures après l'inoculation et les lésions de type A/E ont été observées huit heures après l'inoculation. Nous proposons ici un modèle in vitro permettant d'étudier la capacité des E. coli à causer des lésions de type A/E. Les résultats obtenus montrent que 22 des 24 isolais 045 eaeA-positifs induisent des lésions de type A/E dans les explants de l'iléon. De plus, in vitro, certaines souches sont plus pathogènes que d'autres. Cette différence de rapidité dans l'induction des lésions d'A/E est probablement due aux facteurs de virulence de la bactérie. Ces résultats indiquent que certains déterminants impliqués dans le développement des lésions d'A/E pourraient être présents dans certains isolats et absents dans d'autres. Utilisant des modèles in vitro et in vivo, nous avons aussi démontré que seuls les isolats eaeA-positïîs sont capables d'induire les lésions d'A/E typiques. Nos résultats suggèrent donc que le déterminant eaeA joue un rôle important dans l'induction des lésions d'A/E. Cependant, ti-ois isolats eaeA-positïîs n'ont pas induit ce type de lésions. Quatre hypothèses sont déjà suggérées: (l) une défectuosité du gène eaeA; (2) une régulation de l'expression du gène eaeA; (3) l'absence d'un déterminant dont la fonction est similaire au BFP; (4) ou alors l'intervention d'un facteur inconnu. Afin d'identifier les structures de surface d'E. coli du sérotype 045 impliquées dans le développement des lésions d'A/E, l'expression de la protéine EaeA ou intimine, produit du gène eaeA, a été déterminé sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunobuvardage. Les résultats obtenus montrent que la majorité (20/22) des souches attachantes et effaçantes d'E. coli expriment une protéine de 97 kDa, alors que cette protéine est absente dans les dix souches non attachantes et non effaçantes. D'autre part, la séquence d'acides aminés N-terminale de la protéine de 97 kDa démontre une homologie avec la protéine EaeA déduite par le gène eaeA des souches EPEC et EHEC humaines. Les résultats du séquençage protéique suggèrent également que la maturation de la protéine EaeA des AEEC ainsi que celle de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC s'effectue au niveau du 40e acide aminé. Le premier acide aminé inconnu de la protéine de 97 kDa de la souche 045 porcine correspond au 40 acide aminé (asparagine) de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC. Ces conclusions ont été obtenues par comparaison avec le gène eaeA. Une électrophorèse (isoelectric focusing) de la protéine EaeA purifiée par la technique d'immunoaffinité indique que le pl de la protéine EaeA est de 8.4 comparé au pl de 9.5 de la protéine EaeA des souches humaines (358). La protéine EaeA du sérotype 045 constitue une des protéines de la membrane externe des bactéries. Enfin, en utilisant le sémm polyclonal généré par une immunisation de lapin avec des E. coli porcins 045, ou RDEC-1 ou encore en utilisant des anticorps (E2348/69) d'origine humaine, nous avons observé des réactions sérologiques croisées chez différentes espèces animales. Nous avons produit des anticorps monoclonaux spécifiques à la protéine EaeA de souche porcine. L'hybridome Cil, dirigé spécifiquement contre la protéine EaeA, réagit avec une protéine EaeA des souches AEEC de lapin, mais ne reconnaît pas les souches d'origines humaine et canine. Cet anticorps monoclonal semble reconnaître la forme conformationnelle de l'épitope ainsi que sa forme dénaturée. Par immunobuvardage, cet anticorps réagit également avec la protéine EaeA de la souche de lapin (RDEC-1), mais ne réagit pas avec des souches d'origine humaine (E2348/69) ou canine (89-4221). Nous avons démontré, à l'aide d'anticorps polyclonaux, par immunobuvardage et ELISA, que les protéines EaeA sont spécifiques des sérogroupes 045, excepté pour la souche 81-4420. Dans la présente étude, nous avons observé par ELISA des variations dans la production des protéines EaeA parmi les isolats porcins A/E 045. Une ix n correlation significative (p < 0.05) a été observée entre la quantité de protéine EaeA exprimée et la sévérité des lésions d'A/E induites m vivo par les isolats du sérogroupe 045. Ces résultats montrent une corrélation entre la production de la protéine EaeA et la capacité d'induire les lésions d'A/E. D'autre part, la quantité de protéine EaeA produite in vitro, pourrait aussi déterminer la sévérité des lésions d'A/E in vivo. Utilisant une technique d'immunofluorescence (IF) et un test de sensibilité de la protéine EaeA à certaines protéases, nous avons démontré que la protéine EaeA est localisée A la surface de la bactérie. D'une part, l'anticorps Cil réagit avec la bactérie entière indiquant ainsi la présence de la protéine native EaeA à la surface bactérienne. D'autre part, la dégradation de la protéine EaeA de la souche 045 AEEC par la papaïne a été observée lorsque (a) la cellule bactérienne est intacte; (b) les OMPs et la protéine EaeA purifiée sont soumis à des concentrations croissantes de papaïne, indiquant que la protéine EaeA est exposée A la surface externe de la bactérie. La localisation sur la surface externe de la bactérie est probablement nécessaire pour que la protéine EaeA puisse se lier à un ligand présent sur les cellules de mammifères. En conclusion, nous avons démontré qu'E. coli du sérogroupe 045, associé à la diarrhée post-sevrage du porc, induit des lésions attachantes et effaçantes m vivo et in vitro. Ces souches sont donc des AEEC. Leur capacité d'induire des lésions d'A/E semble être liée à la présence du gène eaeA et non au gène bjpA ou au facteur EAF. Nos résultats suggèrent que la protéine EaeA du sérotype 045 joue um rôle important dans la pathogénicité de la bactérie. En tenant compte des différents sérogroupes et de la presence ou absence du gène bjpA, les isolats d’E. coli du sérogroupe 045 différent des EPEC humains. Cependant, ces isolats ressemblent beaucoup plus aux EPEC humains qu'à toute autre catégorie d'E. coli diarrhéique. Nous considérons donc que les isolats d'E. coli caractérisés dans cette étude sont des EPEC-porcins (EPEC-P).

Extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) reside in the enteric tract as a commensal reservoir, but can transition to a pathogenic state by invading normally sterile niches, establishing infection and disseminating to invasive sites like the bloodstream. Macrophages are required for ExPEC dissemination, suggesting the pathogen has developed mechanisms to persist within professional phagocytes. Here, we report that FimX, an ExPEC-associated DNA invertase that regulates the major virulence factor type 1 pili (T1P), is also an epigenetic regulator of a LuxR-like response regulator HyxR. FimX regulated hyxR expression through bidirectional phase inversion of its promoter region at sites different from the type 1 pili promoter and independent of integration host factor (IHF). In vitro, transition from high to low HyxR expression produced enhanced tolerance of reactive nitrogen intermediates (RNIs), primarily through de-repression of hmpA, encoding a nitric oxide-detoxifying flavohaemoglobin. However, in the macrophage, HyxR produced large effects on intracellular survival in the presence and absence of RNI and independent of Hmp. Collectively, we have shown that the ability of ExPEC to survive in macrophages is contingent upon the proper transition from high to low HyxR expression through epigenetic regulatory control by FimX. / Dissertation

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.