A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

A vitrificação de ovócitos pode ser de grande auxílio na manutenção genética após a morte e na pesquisa científica preservando ovócitos em diferentes estágios de maturação. Esta técnica é uma biotecnologia pouco utilizada na espécie equina devido às baixas taxas de viabilidade celular após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar a expressão de genes ligados a viabilidade celular e apoptose em complexos cúmulus ovócitos (CCOs) antes e após à vitrificação. Com este propósito, folículos entre 5 a 30 mm foram aspirados e 240 CCOs imaturos foram recuperados em abatedouro localizado em São Gabriel, RS, durante a estação reprodutiva. Os CCOs foram divididos em dois grupos: não vitrificados (n=120) e vitrificados (n=120). O protocolo de vitrificação foi realizado de acordo com método comercial EquiPro-VitKit (Minitube-Alemanha). Após vitrificação, CCOs foram mantidos em meio de maturação in vitro durante 6 horas e avaliados imediatamente. Os genes utilizados para análise de viabilidade dos CCOs foram: “bone morphogenetic protein” 15 (BMP 15); bcl-2- “like protein” 4 (BAX); Caspase 3 (CASP 3) e GAPDH (controle). A análise gênica foi realizada através do método de real-time PCR quantitativo (qRT-PCR). Foi observada diferença na expressão de mRNA do gene BAX (0.85 ± 0.08) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.05 ± 0.47; P = 0.03). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do BMP15 (1.55 ± 0.73) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (2.84 ± 2.20; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Não foi observada diferença na expressão de mRNA do CASP3 (0.63 ± 0.20) em CCOs não vitrificados em comparação com vitrificados (0.64 ± 0.01; P > 0.05). Em conclusão, os resultados observados na expressão de BMP15 sugerem a permanência da viabilidade celular em CCOs equinos, porém, BAX sugere a ativação do processo de apoptose nas células expostas ao processo de vitrificação. / Oocyte vitrification is a modern technique that can be used to ensure genetic maintenance after animal death and to improve oocyte cryopreservation at different stages of maturation. Equine oocyte vitrification is a biotechnology rarely used in horses due to the low post-cryopreservation cell viability. The aim of this study was to determine the expression of genes linked to cell viability and apoptosis in equine cumulus-oocyte complexes (COCs) prior and after vitrification. With this purpose, 5 to 30 mm ovarian follicles were aspirated and 240 COCs were collected from a slaughterhouse in Southern Brazil during breeding season. The COCs were divided into two groups: non-vitrified control COCs (CON, n=120) and vitrified oocytes (VIT, n=120). Vitrification protocol was provided according to a commercially available method from EquiPro-VitKit. After vitrification, COCs were in vitro matured for 6 hours and immediately evaluated. Genes product abundance were: Bone morphogenetic protein 15 (Bmp 15); Bcl-2-associated X protein (Bax); Caspase 3 (Casp 3); and GAPDH (control). The gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Difference was observed in COCs mRNA abundance for Bax gene from non-vitrified (0.85 ± 0.08) compared to vitrified (2.05 ± 0.47; P = 0.03). No difference was observed in the COCs mRNA abundance for Bmp 15 from non-vitrified (1.55 ± 0.73) compared to vitrified (2.84 ± 2.20; P > 0.05). There was no difference in mRNA abundance for Casp 3 in non-vitrified (0.63 ± 0.20) compared to vitrified (0.64 ± 0.01; P > 0.05). In conclusion, results demonstrate that Bmp 15 expression in vitrified COCs indicate cell viability; however, Bax suggest the activation of apoptosis cascade in cells exposed to vitrification process.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:50:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:58:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 11106.pdf: 6970470 bytes, checksum: 75dd1652faa57785066487ced8605c9d (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:43:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:09:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 06528.pdf: 7080627 bytes, checksum: 21b5c941bd62d915113928c48d6e1209 (MD5) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA024.pdf: 1167481 bytes, checksum: 8d46ea0fb9ff81da5a38a6f48e0ef3e1 (MD5) Previous issue date: 2007-06-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aims of this work were to perform a breeding soundness evaluation in Devon bulls in the State of Santa Catarina, in Southern Brazil, and to propose alternatives to maximize beef cattle production capacity. The contents of this dissertation were divided in four chapters. Chapter one is a review on the breeding soundness evaluation of bulls, which includes clinical exam, semen collection and evaluation, and serving capacity. In Chapter two, the evaluation of the breeding soundness of 207 Devon bulls was used to determine approval rate, based on clinical and seminal evaluation and serving capacity, and potential causes for failure. The bulls approval mean rate was 71.6%. The mean scrotal circumference (CE), according to distinct age periods, was 35.2 ± 2.93 cm for bulls between 18 to 22 months of age; 37.3 ± 2.75 cm for 23 to 27 months, and 38.2 ± 3.6 cm for 30 months or above. In Chapter 3, the internal artificial vagina (IAV) methodology, designed by Dr. Albert Barth, was tested in Devon bulls, simultaneously evaluating their serving capacity and fertility. Out of 52 bulls tested, 60.0% were satisfactory. A semen sample was obtained with the aid of the IAV in 45 bulls (86.5%), from which, 69.0% were approved in the breeding soundness evaluation, and 31.0% were reproved. When the total umber of bulls (n=52) was considered, 60.0% were approved after semen collection and serving capacity using the IAV. The IAV was an effective alternative for semen collection, allowing the simultaneous evaluation of semen quality and serving capacity. The IAV procedures were proven very effective and important, as 11.1% of failed bulls would have been inadequately approved if only clinical and seminal exams were performed. Chapter 4 reports a study to evaluate OPU recovery and efficiency of vitrification in immature OPU or slaughterhouse oocytes, from Devon viii and Nelore cows. Devon OPU mean collection rate was of 4.6 oocytes/female, hich was significantly lower (p<0.05) than in Nelore cows (16.3 oocytes/female). After warming, in vitro maturation, fertilization and culture of vitrified oocytes, cleavage rates were 17.6% in the OPU/Devon group, 29.1% in OPU/Nelore, 22.8% in the slaughterhouse/Devon, and 14.5% in the slaughterhouse/Nelore group. No statistical difference was observed between groups (p>0.05). Only one embryo developed to the blastocyst stage in the OPU/Devon group. Nelore cows had a higher OPU recovery per session in comparison to Devon. We concluded that immature oocyte vitrification obtained by OPU, under field conditions, did not allow acceptable in vitro embryo developmental rates. In conclusion, this study demonstrated the feasibility oftechnical alternatives to improve bovine reproductive capacity, but such alternatives should be tested beforehand and properly adapted previously to the use under field conditions / O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade reprodutiva de touros da raça Devon, criados em Santa Catarina, bem como propor alternativas para maximizar a capacidade produtiva de bovinos de corte. Os conteúdos foram agrupados em quatro capítulos. No Capítulo 1, procedeu-se a revisão bibliográfica do exame andrológico do touro, incluindo o exame clínico, a coleta do ejaculado, a avaliação seminal e a avaliação da capacidade de serviço. No Capítulo 2, foram avaliados dados obtidos de exames andrológicos de 207 touros da raça Devon, sendo determinado o percentual de animais aptos à reprodução, com base no exame clinico, exame seminal e comportamento sexual, bem como as potenciais causas de reprovação. A média de touros aprovados foi de 71,6%. A média de circunferência escrotal (CE) nas diferentes faixas etárias foram 35,2 ± 2,93 cm para animais de 18 a 22 meses, 37,3 ± 2,75 cm para animais de 23 a 27 meses e 38,2 ± 3,6 cm para animais com mais de 30 meses. No Capítulo 3, foi avaliada a metodologia da vagina artificial interna (VAI) proposta pelo Dr. Albert Barth, como forma de coleta do ejaculado e simultânea avaliação do comportamento e a fertilidade de touros da raça Devon. Dos 52 animais examinados, 60,0% foram considerados aptos. A VAI possibilitou a coleta do ejaculado de 45 animais (86,5%). Dos touros coletados com a VAI (n=45) 69% foram considerados aptos à reprodução e 31% inaptos. Quando se considerou o total de touros examinados (n=52), 60,0% dos touros foram aprovados após coleta de sêmen e avaliação da capacidade de cópula com a VAI. Concluiu-se que a VAI foi efetiva na coleta dos ejaculados, permitindo a avaliação simultânea da capacidade de serviço. A técnica mostrou-se importante, já que vi 11,1% dos animais reprovados no teste seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas os exames clínico e de qualidade seminal fossem empregados. O Capítulo 4 reporta um estudo para avaliar a taxa de recuperação e a eficiência da vitrificação de oócitos imaturos obtidos por OPU, ou de ovários de abatedouro, de fêmeas bovinas das raças Devon e Nelore. O número médio de oócitos por sessão de OPU foi de 4,6 na raça Devon, sendo inferior (p<0,05) aos 16,3 obtidos na raça Nelore. Após o reaquecimento, maturação, fecundação e cultivo dos oócitos vitrificados, foram observadas taxas de clivagem de 17,6% no grupo OPU / Devon, 29,1% no grupo OPU / Nelore, 22,8% no grupo ovários abatedouro / Devon e 14,5% no grupo ovários abatedouro / Nelore, não havendodiferença (p>0,05) entre os grupos. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, apenas um embrião atingiu o estágio de blastocisto, no grupo OPU / Devon. As fêmeas da raça Nelore possibilitaram um número significativamente maior de oócitos recuperados por sessão quando comparadas com fêmeas da raça Devon. Concluise que a associação da técnica de OPU com vitrificação dos oócitos, em condições de campo, não produz taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário. O estudo demonstra que existem alternativas para melhorar a capacidade reprodutiva de bovinos que, todavia, devem ser previamente avaliadas e adequadas às condições existentes

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA024.pdf: 1167481 bytes, checksum: 8d46ea0fb9ff81da5a38a6f48e0ef3e1 (MD5) Previous issue date: 2007-06-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aims of this work were to perform a breeding soundness evaluation in Devon bulls in the State of Santa Catarina, in Southern Brazil, and to propose alternatives to maximize beef cattle production capacity. The contents of this dissertation were divided in four chapters. Chapter one is a review on the breeding soundness evaluation of bulls, which includes clinical exam, semen collection and evaluation, and serving capacity. In Chapter two, the evaluation of the breeding soundness of 207 Devon bulls was used to determine approval rate, based on clinical and seminal evaluation and serving capacity, and potential causes for failure. The bulls approval mean rate was 71.6%. The mean scrotal circumference (CE), according to distinct age periods, was 35.2 ± 2.93 cm for bulls between 18 to 22 months of age; 37.3 ± 2.75 cm for 23 to 27 months, and 38.2 ± 3.6 cm for 30 months or above. In Chapter 3, the internal artificial vagina (IAV) methodology, designed by Dr. Albert Barth, was tested in Devon bulls, simultaneously evaluating their serving capacity and fertility. Out of 52 bulls tested, 60.0% were satisfactory. A semen sample was obtained with the aid of the IAV in 45 bulls (86.5%), from which, 69.0% were approved in the breeding soundness evaluation, and 31.0% were reproved. When the total number of bulls (n=52) was considered, 60.0% were approved after semen collection and serving capacity using the IAV. The IAV was an effective alternative for semen collection, allowing the simultaneous evaluation of semen quality and serving capacity. The IAV procedures were proven very effective and important, as 11.1% of failed bulls would have been inadequately approved if only clinical and seminal exams were performed. Chapter 4 reports a study to evaluate OPU recovery and efficiency of vitrification in immature OPU or slaughterhouse oocytes, from Devon viii and Nelore cows. Devon OPU mean collection rate was of 4.6 oocytes/female, which was significantly lower (p<0.05) than in Nelore cows (16.3 oocytes/female). After warming, in vitro maturation, fertilization and culture of vitrified oocytes, cleavage rates were 17.6% in the OPU/Devon group, 29.1% in OPU/Nelore, 22.8% in the slaughterhouse/Devon, and 14.5% in the slaughterhouse/Nelore group. No statistical difference was observed between groups (p>0.05). Only one embryo developed to the blastocyst stage in the OPU/Devon group. Nelore cows had a higher OPU recovery per session in comparison to Devon. We concluded that immature oocyte vitrification obtained by OPU, under field conditions, did not allow acceptable in vitro embryo developmental rates. In conclusion, this study demonstrated the feasibility of technical alternatives to improve bovine reproductive capacity, but such alternatives should be tested beforehand and properly adapted previously to the use under field conditions / O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade reprodutiva de touros da raça Devon, criados em Santa Catarina, bem como propor alternativas para maximizar a capacidade produtiva de bovinos de corte. Os conteúdos foram agrupados em quatro capítulos. No Capítulo 1, procedeu-se a revisão bibliográfica do exame andrológico do touro, incluindo o exame clínico, a coleta do ejaculado, a avaliação seminal e a avaliação da capacidade de serviço. No Capítulo 2, foram avaliados dados obtidos de exames andrológicos de 207 touros da raça Devon, sendo determinado o percentual de animais aptos à reprodução, com base no exame clinico, exame seminal e comportamento sexual, bem como as potenciais causas de reprovação. A média de touros aprovados foi de 71,6%. A média de circunferência escrotal (CE) nas diferentes faixas etárias foram 35,2 ± 2,93 cm para animais de 18 a 22 meses, 37,3 ± 2,75 cm para animais de 23 a 27 meses e 38,2 ± 3,6 cm para animais com mais de 30 meses. No Capítulo 3, foi avaliada a metodologia da vagina artificial interna (VAI) proposta pelo Dr. Albert Barth, como forma de coleta do ejaculado e simultânea avaliação do comportamento e a fertilidade de touros da raça Devon. Dos 52 animais examinados, 60,0% foram considerados aptos. A VAI possibilitou a coleta do ejaculado de 45 animais (86,5%). Dos touros coletados com a VAI (n=45) 69% foram considerados aptos à reprodução e 31% inaptos. Quando se considerou o total de touros examinados (n=52), 60,0% dos touros foram aprovados após coleta de sêmen e avaliação da capacidade de cópula com a VAI. Concluiu-se que a VAI foi efetiva na coleta dos ejaculados, permitindo a avaliação simultânea da capacidade de serviço. A técnica mostrou-se importante, já que vi 11,1% dos animais reprovados no teste seriam inadequadamente considerados aptos à reprodução, se apenas os exames clínico e de qualidade seminal fossem empregados. O Capítulo 4 reporta um estudo para avaliar a taxa de recuperação e a eficiência da vitrificação de oócitos imaturos obtidos por OPU, ou de ovários de abatedouro, de fêmeas bovinas das raças Devon e Nelore. O número médio de oócitos por sessão de OPU foi de 4,6 na raça Devon, sendo inferior (p<0,05) aos 16,3 obtidos na raça Nelore. Após o reaquecimento, maturação, fecundação e cultivo dos oócitos vitrificados, foram observadas taxas de clivagem de 17,6% no grupo OPU / Devon, 29,1% no grupo OPU / Nelore, 22,8% no grupo ovários abatedouro / Devon e 14,5% no grupo ovários abatedouro / Nelore, não havendo diferença (p>0,05) entre os grupos. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, apenas um embrião atingiu o estágio de blastocisto, no grupo OPU / Devon. As fêmeas da raça Nelore possibilitaram um número significativamente maior de oócitos recuperados por sessão quando comparadas com fêmeas da raça Devon. Concluise que a associação da técnica de OPU com vitrificação dos oócitos, em condições de campo, não produz taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário. O estudo demonstra que existem alternativas para melhorar a capacidade reprodutiva de bovinos que, todavia, devem ser previamente avaliadas e adequadas às condições existentes

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV07MA018.pdf: 1132263 bytes, checksum: 6e10cf4471ceb93e5b44c3be1e5da2c8 (MD5) Previous issue date: 2007-02-17 / The main objective of Cryobiology is the optimization of an oocyte cryopreservation technique. It will permit to create germoplasm banks for maintenance of animal biodiversity, serving as an important instrument in transgenic, cloned or in vitro produced animals. It is consensus that the vitrification is the best method to cryopreserve oocytes and that high cooling rates improve the viability. To evaluate the use of carrier tools with different thermal conductivity in vitrification, 1.454 oocytes (Experiment 1) were 30 seconds exposed to 10% EG + 10% DMSO + 20% estrus mare serum (SEE) in TCM Hepes. Just after, groups of 5 or 6 oocytes were exposed (20 seconds) to vitrification solution (SV - 20% EG + 20% DMSO and 0.5M Sucrose). They were loaded in PM (stainless metallic straws, n=265), MV (glass micropipette, n=279), PB (straw bevel cuted, n=280), OPS (open pulled straw, n=272) or maintained without vitrification GC (control group n=358). Vitrification was obtained by plunging it in super cooled liquid nitrogen. In the experiment 2 (n=709) the aim was to evaluate bovine oocytes vitrification in reduced (25 and 50%) cryoprotectants concentration. Oocytes were 30 sec. exposed to the first cryoprotectant solution, and just after during 20 seconds to one of the allows vitrification solutions: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0.5M Suc; SV75 (n=187), 15% of EG + 15% of DMSO and 0.375M of Suc; or SV50 (n=146), 10% of EG, 10% of DMSO + 0.25M Suc. A non vitrified group (n=189) was used as control. The re-warming was performed by exposure (5 minutes each) to decreasing sucrose solutions (0.30 and 0.15M), heated up to 35ºC. The oocytes were then maturated, fertilized, and the presumptive zygotes cultured in SOFaaci medium, at 39ºC, in saturated humidity. Cleavage, blastocysts and hatching rates were used as viability criteria. In the experiment 1 there was not differences in cleavage rates (p>0.05) among treatments, that were lower (P <0.05) than control group. In the vitrified groups, higher blastocyst rates were obtained with PM treatment (10.2%), that was lower (P <0.05) than the OPS (6.1%) and PB (6.1%) treatments, not differing from the MV group (8.0%), although with tendency of be higher (P <0.1). The treated groups had identical hatching rates, which were lower than the control group. In the second experiment, there was not difference in the cleavage rate among SV100 and SV75 treatments, being both higher (p <0.05) than the SV50 treatment. In the blastocyst rates, there was difference among all groups (P <0.05). The higher rate was obtained in control group (38.0%), followed by the SV100 (10.1%), SV75 (7.6%) and SV50 (0.5%) treatments, respectively. The hatching rates of SV100 and SV75 groups were similar, being lower (P <0.05) than control group. In the SV50 group none blastocyst hatched. We conclude that increasing cooling speed rates improves the viability of immature vitrified bovine oocytes, and that the metallic straws are more effective than recipients of lower conductivity (plastic straws), with a tendency of superiority when compared to the glass micropipette. Still, the reduction of the cryoprotectors in 25% or up does not allow an appropriate cryoprotection to vitrify bovine oocytes, in the conditions of this study / A otimização da técnica de vitrificação de oócitos é um dos principais objetivos da criobiologia, pois possibilitará a formação de bancos de germoplasma para manutenção da biodiversidade animal, além de se constituir num importante instrumento na produção de animais transgênicos, clones ou programas de produção in vitro de animais. É consenso que a vitrificação é o método mais adequado para criopreservar oócitos e que elevadas taxas de resfriamento melhoram a viabilidade da técnica. Para avaliar o uso de materiais com diferentes condutividade térmica na vitrificação (Experimento 1), 1454 oócitos foram utilizados. Inicialmente os oócitos foram expostos a 10% EG + 10% DMSO + 20% soro de égua em estro (SEE), em TCM Hepes, por 30 segundos. Após, grupos de 5 ou 6 oócitos foram submetidos à solução de vitrificação (SV) composta de 20% EG + 20% DMSO e 0,5M Sacarose, durante 20 segundos, período em foram envasados e mergulhados em nitrogênio super-resfriado. O envase foi realizado em PM (palheta metálica inoxidável, n=265), MV (micropipeta de vidro, n=279), PB (palheta cortada em bisel, n=280), OPS (open pulled straw, n=272). Simultaneamente, um grupo não vitrificado serviu como controle, (GC n=358). No Experimento 2, 709 oócitos foram vitrificados com concentrações reduzidas (25 e 50%) de crioprotetores. Inicialmente os oócitos foram expostos, por 30 segundos, a uma solução de 10% EG + 10% DMSO + 20% SEE, em TCM Hepes. Logo após, foram expostos, por 20 segundos, a uma das soluções de vitrificação: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0,5M Sacarose; SV75 (n=187), 15% de EG + 15% de DMSO e 0,375M de sacarose; ou SV50 (n=146), 10% de EG, 10% de DMSO + 0,25M de sacarose, além de um grupo controle não vitrificado (n=189). O reaquecimento foi realizado pela exposição (5 minutos cada) às soluções decrescentes de sacarose (0,30 e 0,15M), aquecidas a 35ºC. Os oócitos foram então maturados e fecundados, e os prováveis zigotos cultivados em meio SOFaaci, à 39ºC. As taxas de clivagem, de blastocistos e eclosão foram utilizadas com critérios de viabilidade. No experimento 1 não foram verificadas diferenças (P>0,05) nas taxas de clivagem dos tratamentos, que foram inferiores (P<0,05) ao grupo controle. A maior taxa de blastocistos nos grupos vitrificados foi obtida com o tratamento PM (10,2%), que foi superior (p<0,05) aos tratamentos OPS (6,1%) e PB (6,1%), não diferindo do grupo MV (8,0%), embora com tendência de ser superior (p<0,1). Também as taxas de eclosão nos grupos tratados foram semelhantes, sendo inferiores as do grupo controle. No experimento 2, não houve diferença na clivagem entre os tratamentos SV100 e SV75, sendo ambos superiores (P<0,05) ao tratamento SV50. Na taxa de blastocistos, houve diferença entre todos os tratamentos (p<0,05). A maior taxa foi obtida com o grupo controle (38,0%), seguido do tratamento SV100 (10,1%), SV75 (7,6%) e SV50 (0,5%), respectivamente. As taxas de eclosão dos grupos SV100 e SV75 foram semelhantes, sendo inferiores (p<0,05) ao controle. No grupo SV50 não houve eclosão. Conclui-se que o aumento da velocidade de resfriamento melhora a viabilidade pós vitrificação de oócitos bovinos imaturos, sendo que as palhetas metálicas são mais efetivas que os recipientes de menor condutividade (palhetas plásticas), com uma tendência de superioridade quando comparada à micropipeta de vidro. Ainda, a redução dos crioprotetores em percentual igual ou superior a 25% não permite uma adequada crioproteção na vitrificação de oócitos bovinos, com a metodologia proposta neste estudo

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:44:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV15MA150.pdf: 821511 bytes, checksum: 342265f1c5a506595b83f7a903d958b0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / New plantings of vineyards bump in low productivity and poor quality of the grapes produced, due to the action of complex factors that are not well understood. Among these, the viruses are a major barrier to the development and highly profitable production in viticulture. By in vitro techniques it is possible to produce plants and multiply matrices of high quality vine plant. Cryotherapy, based cryopreservation methods, it is a promising tool for obtaining high frequency regenerating plants free of viruses in a short time. The paper proposes the development of a protocol for efficient recovery viruses vine plants through cryotherapy methods. The experiments were conducted in Biotechnology EPAGRI Laboratory, Experimental Station of Lages. The selection of genotypes was through the presence of different viral species (GLRaV-1, GLRaV-3, GFKV; GFLV and GVA) by serological ELISA test. The study is divided into two complementary chapters with information that follows the chronological order. The first aims to assess the establishment and multiplication in vitro and ex vitro acclimatization of grape genotypes through nodal segments cultivated in five formulations of culture media without added growth regulators. In Chapter I, in addition to selecting the best saline formulation that will be used in Chapter II for the grape varieties, is apreserntada an updated review of the topics covered at work, with information available to the present. In the second chapter, cryotherapy different methods investigated for vitis were applied, with the objective of defining a standard protocol for the eradication of viruses in potential genotypes. In vitro propagation of the rootstock IAC 571-6 and cultivars Poloskei Muskotaly and Bordô through nodal segments provide high rates of regeneration and rooting, suggesting no need to use growth regulators that promote rooting or specific phase for rooting. Percentage of high survival were obtained in the acclimatization of IAC 571-6 rootstock and cvs. Poloskei Muskotaly and Bordô. Considering all variables, the formulation that provided the best growth and development of root and shoot better and in vitro multiplication of IAC 571-6 vine rootstock and cv. Poloskei Muskotaly was Roubelakis composition and for the cv. Bordô were to Roubelakis and Zlenko formulations. The results of cryotherapy experiments to cultivars in question reaffirm the specificity of genotypic responses to cryogenic procedures. Rates between 6% and 10% were achieved for regenerating rootstock IAC 571-6 through encapsulation methodologies, dehydration and vitrification, respectively. Propagules regenerating after freezing in liquid nitrogen are anomalous and after small seedling growth from corrosion of tissues and lack of evolution cresmimento. Oxidative damage observed in the investigated protocols may be unfeasible cryopreserved tissues, even if part of the exposed tissues are viable in apparent liquid nitrogen is low or no regeneration of tissues. Understanding the degree of sensitivity of materials to vitrificantes solutions is the first step towards optimization of vitrification protocols in this study dehydration for 15 minutes in ½ PVS2 solution followed by 30 minutes PVS2 showed the best results for the rootstock IAC 571-6 / Novos plantios de vinhedos esbarram na baixa produtividade e na má qualidade das uvas produzidas, devido à ação de fatores complexos que ainda não estão bem esclarecidos. Dentre esses, as viroses constituem um importante obstáculo para o desenvolvimento e a produção altamente rentável na viticultura. Por meio de técnicas in vitro é possível produzir e multiplicar plantas matrizes de videira de alta qualidade fitossanitária. A crioterapia, baseada em métodos de criopreservação, torna-se uma ferramenta promissora para obtenção de alta frequência de plantas regenerantes livres de viroses, em curto espaço de tempo. O trabalho propõe o desenvolvimento de um protocolo eficaz para recuperação de plantas de videira virosadas através de métodos de crioterapia. Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Biotecnologia da EPAGRI, Estação Experimental de Lages. A seleção de genótipos foi por meio da presença de diferentes espécies virais (GLRAV-1; GLRAV-3; GFKV; GFLV e GVA), através do teste sorológico ELISA. O estudo foi dividido em dois capítulos complementares, com informações que seguem a ordem cronológica. O capítulo I tem por objetivo avaliar o estabelecimento e multiplicação in vitro e a aclimatização ex vitro de genótipos de videira, por meio de segmentos nodais cultivados em cinco formulações de meios de cultura sem adição de reguladores de crescimento. Esse capítulo, além da seleção da melhor formulação salina que será utilizada no capítulo II para as cultivares de videira, é apresentada uma revisão atualizada dos temas abordados no trabalho, com informações disponíveis até o presente. No segundo capítulo, diferentes métodos de crioterapia investigados para Vitis foram aplicados, com o objetivo de definir um protocolo padrão para a erradicação de viroses em genótipos potenciais. A propagação in vitro do porta-enxerto IAC 571-6 e das cultivares Poloskei Muskotaly e Bordô por meio de segmentos nodais proporcionam elevadas taxas de regeneração e enraizamento, sugerindo que não há necessidade de utilização de reguladores de crescimento que promovam o enraizamento ou de fase específica para o enraizamento. Elevados percentuais de sobrevivências foram obtidas na aclimatização do porta-enxerto IAC 571-6 e das cvs. Poloskei Muskotaly e Bordô. Considerando todas as variáveis analisadas, a formulação que proporcionou o melhor crescimento e desenvolvimento da parte aérea e radicular e melhor multiplicação in vitro do porta-enxerto de videira IAC 571-6 e da cv. copa Poloskei Muskotaly foi a composição Roubelakis e, para a cv. Bordô foram às formulações Roubelakis e Zlenko. Os resultados dos experimentos de crioterapia para as cultivares em questão reafirmam a especificidade das respostas dos genótipos aos procedimentos criogênicos. Taxas entre 6 % a 10 % de regenerantes foram atingidas para o porta-enxerto IAC 571-6 por meio das metodologias de encapsulamento-desidratação e vitrificação, respectivamente. Propágulos regenerantes após o congelamento em nitrogênio líquido são anômalos e após pequeno crescimento da plântula apresentam oxidação dos tecidos e não possuem evolução de crescimento. Os danos oxidativos observados nos protocolos investigados podem ter inviabilizado os tecidos criopreservados, mesmo que parte dos tecidos expostos em nitrogênio líquido aparente viabilidade, ocorre baixa ou nula regeneração de tecidos. A compreensão do grau de sensibilidade de materiais para soluções vitrificantes é o primeiro passo para otimização dos protocolos de vitrificação, no presente estudo a desidratação por 15 minutos em solução ½ PVS2 seguido de 30 minutos em PVS2 apresentou os melhores resultados para o porta-enxerto IAC 571-6