Der Transkriptionsfaktor CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα) kontrolliert Zellzyklusarrest und terminale Differenzierung von neutrophilen Granulozyten und Adipozyten. Mutationen von C/EBPα treten häufig im Zusammenhang mit akuter myeloischer Leukämie auf. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass C/EBPα an mehreren konservierten Argininen citrunilliert ist, einschließlich R297 in der C-terminalen basischen Region von C/EBPα. Mutationen von C/EBPα R297 wurden bereits beschrieben, weshalb der Schwerpunkt dieser Arbeit auf die Analyse der Modifikation dieses Aminosäurerestes gelegt wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass die Peptidyl-Arginin-Deaminase (PADI4) mit C/EBPα interagiert und an mehreren Aminosäureresten citrunilliert. Citrunillierung oder Mutation von R297 beeinflusst die Aktivität von C/EBPα, einschließlich DNA-Bindung und Interaktion mit Partnerproteinen. Mutationsanalysen legen nahe, dass die positive Ladung des Aminosäurerestes R297 für die Bindung an cis-regulatorische DNA-Elemente, Protein Interaktionen, Genaktivierung, Fettzelldifferenzierung und Zellzyklusarrest ausschlaggebend ist. Knock-down von PADI4 in der myeloischen Vorläufer-Zelllinie 32D oder in der leukämischen U937 Zelllinie induziert Granulozyten-Differenzierung, möglicherweise durch Blockierung der PADI4-vermittelten Citrunillierung und Inaktivierung von C/EBPα. Zusammengefasst ergibt sich aus den Daten, dass PADI4 die positiv-geladene Seitenkette von C/EBPα R297 in eine ungeladene, citrunillierte Form umwandelt, die die Assoziation mit DNA destabilisiert und die C/EBPα-E2F-Interaktion beeinflusst, was wiederum das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Differenzierung bestimmt. / The transcription factor CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα) coordinates cell cycle arrest and terminal differentiation of neutrophil granulocytes and adipocytes. Mutations in C/EBPα are frequently associated with acute myeloid leukemia. Mass spectrometric analysis revealed that citrullination occurred on multiple conserved C/EBPα arginine residues including R297 in the C/EBPα basic region. C/EBPα R297 was previously reported to be mutated in acute myeloid leukemia and we therefore focused on the modification this residue. Data presented here show that peptidylarginine deiminase 4 (PADI4) interacts with and citrullinates C/EBPα at several sites. Citrullination or mutation of R297 dramatically changed C/EBPα activities, including DNA binding and interaction with protein partners. Mutational analysis demonstrated that the positive charge of residue R297 was critical for binding to cis-regulatory sites on DNA, gene activation, adipocytic differentiation, and cell cycle arrest. Knock down of PADI4 in the myeloid precursor cell line 32D or U937 leukemia cells induced granulocyte differentiation, potentially through relieving PADI4 mediated citrullination and inactivation of C/EBPα. Taken together, the data suggest that PADI4 converts the positive C/EBPα R297 side chain to the non-charged citrulline side chain which destabilizes the association with DNA and affects C/EBPα - E2F interaction that determines the balance between proliferation and differentiation.

Das phylogenetisch weit verbreitete RNA-bindende Protein Hfq ist an einer Vielzahl von Prozessen innerhalb des bakteriellen RNA-Metabolismus, insbesondere im Rahmen der post-transkriptionellen Genregulation durch kleine RNAs (sRNAs) beteiligt. Hfq-Proteine zählen zu der Familie der Sm- und Lsm-Proteine und zeichnen sich strukturell durch die funktionelle Ausbildung ringförmiger Homohexamere aus. Cyanobakterielle Orthologe zeigen gegenüber den gut untersuchten Hfq-Proteinen aus E. coli und anderen Proteobakterien eine schwache Sequenzkonservierung und bieten auch daher einen interessanten Ansatzpunkt für die Untersuchung riboregulatorischer Prozesse in diesen Organismen. In der vorliegenden Arbeit werden einleitende Untersuchungen zu Funktion und Struktur des orthologen Hfq-Proteins aus dem einzelligen Modell-Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 vorgestellt. Die Inaktivierung des hfq-Gens (ssr3341) führte in diesem Organismus zum Verlust der phototaktischen Motilität. Mithilfe elektronenmikroskopischer Analysen konnte dieser Phänotyp auf das Fehlen von Typ IV Pili zurückgeführt werden. Microarray-Analysen wiesen in der deltahfq-Mutante für 31 Gene eine veränderte, in den meisten Fällen reduzierte Transkriptakkumulation nach. Am stärksten betroffenen waren Gene bzw. Operone, welche dem Regulon des cAMP-Rezeptorproteins Sycrp1 zugeordnet werden und zum Teil nachweislich an der Motilität von Synechocystis-Zellen beteiligt sind. Weitere vergleichende Expressionsanalysen identifizierten mithilfe eines speziellen Tiling-arrays ferner zwei „intergenisch“ kodierte potenzielle sRNAs, Hpr1 und Hpr3, deren Transkriptmengen signifikant von der hfq-Inaktivierung beeinflusst werden. Kristallstrukturdaten deuten zusammen mit den Ergebnissen aus in vitro-Bindungsstudien und genetischen Komplementierungsexperimenten - trotz starker Konservierung zentraler struktureller Charakteristika - neuartige biochemische und funktionelle Eigenschaften des Hfq-Proteins aus Synechocystis sp. PCC 6803 an. Funktionelle Implikationen werden im strukturellen und phylogenetischen Kontext diskutiert. / The phylogenetically conserved RNA binding protein Hfq is a key player in bacterial RNA metabolism, particularly with regard to sRNA-mediated post-transcriptional gene regulation. Hfq proteins belong to the well-conserved family of Sm- and Lsm proteins and are characterized by the formation of homo-hexameric ring-shaped structures. In comparison with well-studied Hfq proteins from E.coli and other proteobacteria the cyanobacterial orthologues show rather poor sequence conservation. Therefore, they provide a quite interesting background for analyzing riboregulatory processes in these organisms. In this work, the orthologous Hfq protein from the unicellular model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 has been initially characterized on the functional and structural level. Insertional inactivation of the hfq gene (ssr3341) led to a non-phototactic phenotype that was due to the loss of type IV pili on the cell surface, as demonstrated by electron microscopy. Microarray analyses revealed a set of 31 genes with altered transcript levels in the knock-out mutant. Among the most strongly affected genes, there were members of two operons that had previously been shown to be involved in motility, controlled by the cAMP receptor protein Sycrp1. Further comparative transcriptional analyses using custom tiling arrays revealed two putative sRNAs (Hpr1 and Hpr3) from intergenic regions, whose transcript levels appeared to be significantly affected by hfq-inactivation. Structural analyses, genetic complementation as well as RNA-binding studies in vitro indicate that the Hfq orthologue from Synechocystis sp. PCC 6803 exhibits novel biochemical and functional properties, though retaining general structural features of its proteobacterial counterparts. Functional implications are discussed with regard to structural und phylogenetic considerations.