A prevalência mundial de asma na infância é alta. Alterações estruturais das vias aéreas são observadas na asma, e podem ocorrer precocemente na infância. Este estudo tem como objetivo comparar os resultados de um modelo de sensibilização alérgica, em camundongos de diferentes idades. Para tanto foram utilizados camundongos Balb/C pré-desmamados, jovens e adultos. O grupo de animais pré desmamados foram divididos em outros dois grupos (18D 18D1), sendo que ambos foram sensibilizados com duas injeções intraperitoneal (i.p.) de 10 g ovalbumina (OVA) no 5º e 7º dia de vida. Após, o primeiro grupo de camundongos pré desmamados foram submetidos a 01 (um) desafio, este consistente em receberem inalações por 3 dias consecutivos, a 3% de OVA, por 10 minutos, nos dias 14, 15 e 16. O segundo grupo de camundongos pré desmamados foram submetidos 02 (dois) desafios, estes nos dias 09, 10 e 11; e 14, 15 e 16 dias de vida. O grupo de camundongos jovens (40D) receberam as mesmas inalações nos dias 22 a 24 e depois nos dias 36 a 38. Um quarto grupo de camundongos, denominados adultos (100D), foram sensibilizados com 10 g OVA i.p. nos dias 60 e 62 de vida; e também recebendo inalações por 3 dias consecutivos a 3% de OVA, por 10 minutos, nos dias 77 a 79 de vida, repetindo o procedimento nos dias 96, 97 e 98, sendo que os animais em todos os xiii grupos foram sacrificados 48hs após a última inalação. Todos os grupos possuíam um grupo controle respectivo, mesmo protocolo, mas ao invés de OVA, recebiam apenas solução salina. Observamos que os animais sensibilizados, quando comparados entre si, não apresentavam diferença quanto à densidade de células de eosinófilos (p = 0,052). A densidade de células TCD3+ foi maior nos camundongos adultos e no grupo de animais pré desmamados com dois desafios (p<0,001), não havendo diferença nos demais grupos (p=1,000). Foi possível observar também uma maior expressão de IL-5 nas vias aéreas quando comparados os grupos OVA de 18 dias de vida (18D e 18D1) com os seus controles (p=0,017). Todavia não houve esta diferença de IL-5 nos grupos jovens e adultos. Entre os grupos controles, a expressão de IL-5 foi menor nos grupos de 18 dias de vida (18D e 18D1) em relação aos animais dos grupos de 40 e 100 dias de vida (40D e 100D - p<0,001). Verificamos ainda que o grupo de animais pré desmamados com um desafio (p = 0,003) e os camundongos adultos (p = 0,006) apresentaram aumento da expressão de TGF- nas vias aéreas, quando comparados aos seus respectivos controles; e que os camundongos do grupo pré desmamado com um ou dois desafios apresentaram maior expressão de PAS no epitélio bronquiolar, quando comparado aos camundongos jovens e adultos (18D e 18D1 - p=0,007 e 40D e 100D - p=0,073). Entre os camundongos sensibilizados, o grupo pré desmamado com um único desafio, apresentou menor fração de área de colágeno comparado ao grupo de camundongos pré desmamados que receberam dois desafios (p<0,001), não havendo outras diferenças entre os grupos. xiv Camundongos jovens e adultos apresentaram um aumento de espessura do músculo liso da via aérea (MLB) quando comparados a seus respectivos controles (p = 0,048). Desta forma, foi possível demonstrar que os camundongos pré desmamados podem desenvolver alterações inflamatórias e estruturais nas vias aéreas, porém apresentam características diferentes das alterações observadas em animais com maior idade. Por fim, conclui-se que o presente estudo proporciona resultado e forma a ser utilizado como base para um estudo experimental, seja para verificar o resultado de medicamentos, seja para um estudo comparativo em crianças, jovens e adultos com asma, a fim de se verificar as diferenças apresentadas; e assim, auxiliar na adequada conduta clínica para prevenção ou combate dessa doença / The prevalence of childhood asthma is high worldwide. Recent data indicate that asthma structural changes occur early in childhood, and that structure alterations occur early in life. In this study we have aimed to compare a model of allergic sensitization in infantile, juvenile and adult mice. BALB/c mice at different ages were sensitized with two intraperitoneal injections (i.p.) of 10 g ovalbumin (OVA) at day 05 and 07 and received 3 daily inhalations of 3% OVA for 10 min on days 14 to 16 and 09 to 11 - 14 to 16 the infantile groups (18d - 18d1).The juvenile mice (40d) at days 22 to 24 - 36 to 38 and adult mice (100d) were sensitized with 3% OVA i.p. at day 60 and 62 and received 2x 3 daily inhalations at days 77-79 and at day 96-98, being euthanized 48h later. Control groups received saline using the same protocols. The OVA treated animals were compared among each other there were no differences regarding eosinophil cell density (p= 0.052). The density of T CD3+ cells was higher in the adult mice and in the infantile group with two challenges in relation to 18D e 40D (p=0.000), but without differences between the former groups (p= 1.000). When OVA groups were compared to the respective controls, infantile groups presented increased IL-5 expression in the airways (p=0.017), no differences were observed in the juvenile and adult mice. Among controls, IL-5 expression was lower in the infantile groups in relation to the juvenile and adult mice (p<0.001). The infantile group (p=0.003) with one challenge and the adult mice (p=0.006) presented increased TGF- expression in the airways when compared to their respective controls. Infantile mice with one or two challenges presented more PAS positivity in the bronchiolar epithelium than the juvenile and adult mice (p=0.007 and p=0.073). Among the OVA mice, infantile mice with one xvi challenge presented lower collagen area fraction than the group of infantile mice that received two challenges (p=0.000), without further differences among groups. Juvenile and adult mice had increased ASM thickness when compared to their age related controls (p=0.48). In summary, we have shown that infantile mice develop inflammatory and structural alterations in the airways, but that are partially different from those developed in older animals. Understanding the phenotypic differences in children vs adult asthma is very important to treat disease adequately and to manage prevention of severity

Orientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Valeria Marçal Felix de Lima / Banca: Richardt Gama Landgraf / Resumo: Na inflamação alérgica, a histamina desencadeia papel crucial na indução de sintomas, tais como vasodilatação, broncoconstrição e produção de muco. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da histamina na inflamação e no remodelamento das vias aéreas, avaliando para tanto a produção de muco e colágeno em modelo murino de inflamação pulmonar. Camundongos Balb/c machos de 20-25g foram estimulados, por via intratraqueal, com histamina em diferentes concentrações (10, 50 e 100 µM) e avaliados após 6, 24 e 48 horas. A partir dos dados resultantes do ensaio dose-resposta, foi realizado tratamento farmacológico, onde animais foram separados em 5 grupos (6 camundongos por grupo): Grupo 1 (PBS), controle não estimulado; Grupo 2 (Histamina), controle estimulado; Grupo 3 (Histamina + Loratadina); Grupo 4 (Histamina + Dexametasona) e Grupo 5 (Histamina + Dexametasona e Loratadina). Analisamos a migração de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA) e no tecido pulmonar. As alterações estruturais no tecido pulmonar e na traqueia foram avaliadas por análise histopatológica, bem como a produção de muco e deposição de colágeno usando Alcian blue/Periodic Acid Shiff e Tricômio de Masson, respectivamente. O sobrenadante do LBA e o tecido pulmonar foram coletados para quantificar os níveis SCF e CCL3 por ELISA de captura. A expressão gênica de Muc5ac, Gob-5, Col1a2 e receptores de histamina foi avaliada por RT-PCR em tempo real. Nossos resultados demonstram que a histamina induz infla... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In allergic inflammation, histamine exerts a crucial role in the induction of symptoms, such as vasodilation, bronchoconstriction and mucus production. The aim of this study was to investigate the effects of histamine in inflammation and airway remodeling, evaluating the mucus production and collagen in a murine model of pulmonary inflammation. Male Balb/c mice of 20-25g were challenged by intratracheal instillation of histamine at different concentrations (10, 50 and 100 μM) and evaluated after 6, 24 and 48 hours. From the data resulting from the dose-response assay, pharmacological treatment was performed, and animals were separated into 5 groups (6 mice per group): Group 1 (PBS), non-challenged control; Group 2 (Histamine), challenged control; Group 3 (Histamine + Loratadine); Group 4 (Histamine + Dexamethasone) and Group 5 (Histamine + Dexamethasone and Loratadine). We analyzed the recruitment of leukocytes in bronchoalveolar lavage (BAL) and lung tissue. Structural changes in lung tissue and trachea were assessed by histopathological analysis, as well as mucus production and collagen deposition using Alcian blue/Periodic Acid Shiff and Masson's Trichrome, respectively. BAL supernatant and lung tissue were collected for SCF and CCL3 levels quantification by capture ELISA. The gene expression of Muc5ac, Gob-5, Col1a2, and histamine receptors was evaluated by RT-PCR real time. Our results demonstrated that histamine induces airway inflammation, with presence of leukocyte infiltrate in BAL and lung tissue. In addition, histamine-challenged animals demonstrated a significant increase in the gene expression of Muc5ac, Gob-5 and Col1a2 in lung tissue, SCF and CCL3 production in BAL and lung, as well as structural changes in the trachea and lung tissue, such as leukocyte infiltrate, presence of goblet cell, mucus production and collagen... / Mestre

Submitted by Leonardo Siqueira Vasconcelos (leonardosiq@gmail.com) on 2017-06-29T19:00:55Z No. of bitstreams: 1 LeonardoSV_MFEE(29062017).pdf: 995295 bytes, checksum: ac8da096bc5c475ee94c4f80d2256774 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcia Bacha (marcia.bacha@fgv.br) on 2017-07-05T19:06:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LeonardoSV_MFEE(29062017).pdf: 995295 bytes, checksum: ac8da096bc5c475ee94c4f80d2256774 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-05T19:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LeonardoSV_MFEE(29062017).pdf: 995295 bytes, checksum: ac8da096bc5c475ee94c4f80d2256774 (MD5) Previous issue date: 2017-05-31 / The availability of online prices represents a unique opportunity for the construction of price indexes and the measurement of inflation. This type of data can be collected remotely, at much higher frequencies, and a tiny fraction of the cost of traditional price- collection methods. The Brazilian Institute of Geography and Statistics (IBGE), through the Broad National Consumer Price Index (IPCA), already collects data online for the subitem airfare. The paper seeks to show evidence that simple collection on company websites is not always the best way to obtain price variations due to automatic price swings. Additionally, a review of the theoretical and empirical literature highlighting the national and international collection method is presented. In order to reach the proposed objective, we used the time-series econometric procedure using the Vector Autoregressive Model related to the National Civil Aviation Agency (ANAC) price changes. / A disponibilidade de preços online representa uma oportunidade única para a construção de índices de preços e mensuração da inflação. Esse tipo de dado pode ser coletado remotamente, com grande frequência e um custo reduzido em relação ao método tradicional de coleta de preços. O Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), através do Índice Nacional de Preços ao Consumidor Amplo (IPCA), já realiza a coleta de dados online referente ao subitem passagem aérea. O trabalho procura mostrar evidências de que a simples coleta nos sites das empresas nem sempre é a melhor forma de se obter as variações de preço, em virtude das oscilações automáticas de preços. Adicionalmente apresenta-se uma revisão da literatura teórica e empírica destacando o método de coleta nacional e internacional. Para alcançar o objetivo proposto, utilizou-se o procedimento econométrico de séries temporais através do Modelo de Vetor Autoregressivo relacionado as variações de preços da Agência Nacional de Aviação Civil (ANAC).

Made available in DSpace on 2010-04-20T20:20:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1996-07-17T00:00:00Z / Utilização do Database Marketing, o marketing com banco de dados, e sua obtenção através do Sistema de Informação de Marketing SIM, visando a buscar a otimização do relacionamento com os clientes, criando um vínculo de fidelidade, atendendo suas necessidades e conhecendo-os profundamente nos seus desejos. Esta relação tenderá a manter os clientes atuais, reconquistar os perdidos e buscar novos clientes de forma mais eficaz. São utilizados os princípios e elementos de marketing no planejamento e operacionalização de uma empresa, assim como o conceito de vantagem competitiva, visando não somente uma maior participação no mercado, mas principalmente como posicioná-la estrategicamente

Para avaliar a capacidade da toxina ExoU de P. aeruginosa de induzir a expressão do fator tissular (FT) por células epiteliais respiratórias da linhagem BEAS-2B, células infectadas pela cepa PA103, produtora da toxina, foram comparadas com outras infectadas por cepa mutante obtida por deleção do gene exoU e com células controles não infectadas quanto a i) expressão do mRNA do FT, por RT-PCR; ii) expressão da proteína FT em lisados celulares, por ensaio imunoenzimático (ELISA), e na superfície celular, por citometria de fluxo; iii) atividade pró-coagulante das células, pela determinação da capacidade de indução de coagulação de plasma humano normal e do lisado celular, através de ensaio colorimétrico; iv) presença de FT solúvel no sobrenadante das culturas, por ELISA; v) liberação de micropartículas expressando FT e fosfatidilserina (FS), por citometria de fluxo. Nossos resultados mostraram que ExoU foi responsável pelo aumento da expressão do mRNA e da concentração da glicoproteína FT tanto nos lisados quanto na superfície celular. Esse aumento foi revertido quando as bactérias foram tratadas com uma droga inibidora de PLA2 (MAFP), comprovando-se a dependência da atividade fosfolipásica A2 de ExoU para a modulação da expressão do FT. Células infectadas pela cepa PA103 induziram uma diminuição no tempo de coagulação do plasma humano normal e o aumento da hidrólise do substrato sintético utilizado no teste colorimétrico em comparação com as células infectadas com a cepa mutante, mostrando que o FT expresso era funcionalmente ativo. Foi também detectado um aumento na concentração de FT solúvel presente nos sobrenadantes de culturas infectadas por PA103 e no número de micropartículas expressando, simultaneamente, FT e FS em relação à cultura infectada pela cepa PA103&#8710;exoU. Os resultados obtidos nos testes in vitro foram validados pela demonstração de que a concentração de FT no parênquima pulmonar de camundongos infectados, por via intratraqueal, com a cepa selvagem foi significativamente superior à detectada nos animais infectados com a cepa mutante. / To evaluate the capacity of the P. aeruginosa toxin ExoU to induce the expression of tissue factor (TF) by epithelial respiratory cells from the BEAS-2B cell line, cells infected with the ExoU-producing PA103 bacterial strain were compared with cells infected with a mutant obtained by deletion of the exoU gene and with control non-infected cells in their i) expression of the TF mRNA, by RT-PCR; ii) expression of the protein TF in cell lisates and surfaces, by enzyme immunoassay (ELISA) and flow cytometry, respectively; iii) procoagulant activity by determining the ability of intact cells to induce the coagulation of normal human plasma and the ability of cell lysates to cleave the synthetic substrate of a chromogenic assay; iv) presence of soluble TF in cell culture supernatants, by ELISA and v) release of microparticles simultaneously expressing TF and phosphatidylserine, by flow cytometry. Cells infected with the wild type bacteria exhibited increased expression of TF mRNA 1 hour after infection and a positive modulation of TF expression in both cell lysates and cell surfaces. The enhancement of TF expression was inhibited when cells were infected with bacteria previously treated with a PLA2 inhibitor (MAFP), confirming that the ability of ExoU to modulate TF expression depended on its phospholipase A2 activity. Newly expressed TF was shown to be functionally active, by both the decrease in the clotting time of human plasma and the enhancement of the hydrolysis of the chromogenic assay substrate. Cells infected with the ExoU-producing bacteria exhibited also higher concentrations of soluble TF and of TF and PS bearing microparticles in the cell culture supernatants. These in vitro results were validated by our finding of increase TF concentrations in the lung parenchyma of mice infected intratracheally with the ExoU producing-bacteria at 24 h post-infection.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silicose é uma doença pulmonar causada pela inalação de partículas de sílica, na qual vários são os mediadores inflamatórios implicados. Neste estudo investigamos o envolvimento do óxido nítrico (NO) nas alterações de função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas, em camundongos estimulados com sílica por via intranasal. Foram analisados parâmetros como i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas ao aerossol com metacolina (3 27 mg/mL) através de sistema de pletismografia invasiva, e ii) alterações morfológicas, mediante técnicas clássicas de histologia e imuno-histoquímica. Verificamos que a instilação de partículas de sílica (10 mg) causou aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonar, bem como de hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina, em tempos que variaram de 2 a 28 dias. Observamos uma correlação temporal com as alterações morfológicas no tecido pulmonar, que refletiram presença de resposta inflamatória e infiltrado celular intenso, seguidos de progressiva fibrose e formação de granulomas. Os tempos de 7 e 28 dias pós-estimulação com sílica foram selecionados para os ensaios subsequentes, por corresponderem às fases aguda e crônica da silicose experimental, respectivamente. Foram detectados níveis elevados de óxido nítrico (NO), bem como de peroxinitrito/expressão da enzima iNOS no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar de camundongos estimulados com sílica, respectivamente. Em outro grupo de experimentos, observamos que camundongos depletados para o gene codificante para a enzima NOS induzida (iNOS) apresentaram abolidas as respostas de aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonares, bem como da hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina em comparação aos animais selvagens (C57BL/6). A inibição da resposta inflamatória e fibrótica granulomatosa foi também notada no caso dos animais nocautes para iNOS. O tratamento com 1400W, um inibidor da enzima iNOS, diminui de forma marcada as alterações de função pulmonar e fibrose tecidual verificadas nos camundongos silicóticos. Em conclusão, nossos resultados mostram que o comprometimento da função pulmonar, representado pelo aumento na resistência/elastância e hiper-reatividade das vias aéreas, mostraram-se correlacionados à maior geração de NO e de peroxinitrito, assim como da expressão da enzima iNOS. A depleção do gene codificante ou, ainda, o bloqueio da enzima iNOS aboliram a resposta de comprometimento da função pulmonar e fibrose tecidual na silicose experimental. Em conjunto estes achados indicam que o NO parece ser um mediador importante no contexto da silicose, colocando-se como um alvo terapêutico em potencial no tratamento de doenças de caráter fibrótico. / Silicosis is a lung disease caused by inhalation of silica particles, which is dependent on several inflammatory mediators. In this study we investigated the role of nitric oxide (NO) in the alteration of lung function and airways hyperreactivity caused by intranasal silica stimulation in mice. The parameters analyzed included: i) lung function (resistance and elastance) and airways hyperreactivity to aerosolized methacholine (3 - 27 mg/mL) by invasive plethysmography, and ii) morphological changes, by classical histological techniques and immunohistochemistry. We found that the instillation of silica particles (10 mg) caused an increase in the baseline levels lung of resistance and elastance and airways hyperreactivity to methacholine, from 2 to 28 days. We noted that there was a temporal correlation with morphological changes in lung tissue, which reflected the presence of an intense inflammatory cell infiltrate, followed by progressive fibrosis and granuloma formation. The time-points of 7 and 28 days post-silica stimulation were chosen for subsequent experiments, because they corrrespond to acute and chronic phases of experimental silicosis, respectively. Higher levels of nitric oxide (NO) and peroxynitrite as well as iNOS expression were detected in the bronchoalveolar lavage and lung tissue of silica-stimulated mice stimulated, respectively. In another group of experiments, we observed that mice depleted for the gene encoding for inducible NOS (iNOS) had the responses of increased basal levels of resistance and elastance lung and airways hyperreactivity abolished as compared to wildtype animals (C57BL/6). Inhibition of the inflammatory and fibrotic granulomatous responses were also inhibited in the case iNOS knockout mice. Treatment with the iNOS inhibitor 1400W markedly suppressed changes in lung function and tissue fibrosis observed in silicotic mice. In conclusion, our results show that suppression of lung function failure, including increased in resistance/elastance as well as airways hyperreactivity were correlated with NO and peroxynitrite generation as well as the iNOS expression. The depletion of the gene encoding to or inhibition of iNOS enzymatic activity abolished the response of lung function and tissue fibrosis in experimental silicosis. Together, these findings indicate that NO is an important mediator in the context of silicosis and suggest that it can be considered a potential therapeutic target for the treatment of fibrotic diseases.

Orientador: Sérgio Campos / Banca: Zacarias Xavier de Barros / Banca: Osmar Delmanto Junior / Banca: Teresa Cristina T. Pissarra / Banca: Sergio Paschoal de Campos / Resumo: A grande importância da citricultura no Estado de São Paulo, particularmente no Município de Botucatu, e sua grande expansão em área nos últimos anos e o avanço das técnicas de monitoramento ambiental, como o sensoriamento remoto motivou a presente pesquisa. O objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações espaço-temporal da citricultura no Município de Botucatu-SP, no período de 1962 a 2005, utilizando-se de: fotografias aéreas pancromáticas de 1962, 1972 e 1977 e coloridas de 2000 e 2005, imagens de satélite Landsat 2000 e 2005; juntamente com técnicas de Sensoriamento Remoto e Sistemas de Informações Geográficas, visando avaliar as diferenças na determinação de áreas e perímetros, por meio dos aplicativos: CartaLinx, SIG-Idrisi e SPLAN. Os resultados obtidos permitem concluir que: a área ocupada pela citricultura no Município de Botucatu-SP em 2000 representava 5,22% da área total do Município; passando a ocupar 8,63 % no ano de 2005, representando um incremento de 3,41% na área total estudada e uma expansão de 65,27% da área citrícola no período de cinco anos; sendo que, no período de 43 anos (1962 a 2005), houve um incremento de 12722,56 ha desta área. As áreas obtidas por meio de fotografias aéreas e avaliadas pelo Carta Linx apresentam valores mais próximos da verdade terrestre para a determinação de áreas e perímetros. A falta de nitidez das imagens de satélite dificulta a identificação de pequenas áreas de cobertura vegetal; o SIG-Idrisi apresentou discrepâncias para a determinação de perímetros, em função de trabalhar de forma matricial e que o SPLAN, é próximo do Carta Linx, para a determinação de áreas e perímetros, devido ao fato de ambos trabalharem de forma vetorial / Abstract: The great importance of citrus in São Paulo, particularly in Botucatu, its major expansion in area in recent years and the advanced techniques for environmental monitoring, such as remote sensing, are all factors that have motivated the present research. The aim of this study was to evaluate the spatial and temporal changes of citrus in Botucatu-SP from 1962 to 2005. For this, was used, panchromatic aerial photographs from 1962, 1972 and 1977, color ones from 2000 and 2005, Landsat satellite images from 2000 and 2005. Along with those, Remote Sensing and Geographic Information Systems were also used in order to evaluate the differences in determining areas and perimeters, by using software such as CartaLinx, GISIdrisi and SPLAN. The results showed that the area occupied by citrus in Botucatu-SP was 5.22% of the total area of the county in 2000. In 2005, it represented 8.63%, showing a 3.41% increase of the total area and an expansion of 65.27% of the citrus area within five years, being that during the period of 43 years (1962-2005), there was an increase of 12722.56 ha of this area. The areas obtained from aerial photographs and evaluated with CartaLinx present values closer to ground truth for the determination of areas and perimeters. The lack of accuracy in the satellite images makes it difficult to identify small areas of vegetation. GISIdrisi showed discrepancies in perimeter determination, as it works with matrixes. SPLAN is similar to CartaLinx for the determination of areas and perimeters, due to the fact that both work with vectors / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silicose é uma doença pulmonar causada pela inalação de partículas de sílica, na qual vários são os mediadores inflamatórios implicados. Neste estudo investigamos o envolvimento do óxido nítrico (NO) nas alterações de função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas, em camundongos estimulados com sílica por via intranasal. Foram analisados parâmetros como i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas ao aerossol com metacolina (3 27 mg/mL) através de sistema de pletismografia invasiva, e ii) alterações morfológicas, mediante técnicas clássicas de histologia e imuno-histoquímica. Verificamos que a instilação de partículas de sílica (10 mg) causou aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonar, bem como de hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina, em tempos que variaram de 2 a 28 dias. Observamos uma correlação temporal com as alterações morfológicas no tecido pulmonar, que refletiram presença de resposta inflamatória e infiltrado celular intenso, seguidos de progressiva fibrose e formação de granulomas. Os tempos de 7 e 28 dias pós-estimulação com sílica foram selecionados para os ensaios subsequentes, por corresponderem às fases aguda e crônica da silicose experimental, respectivamente. Foram detectados níveis elevados de óxido nítrico (NO), bem como de peroxinitrito/expressão da enzima iNOS no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar de camundongos estimulados com sílica, respectivamente. Em outro grupo de experimentos, observamos que camundongos depletados para o gene codificante para a enzima NOS induzida (iNOS) apresentaram abolidas as respostas de aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonares, bem como da hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina em comparação aos animais selvagens (C57BL/6). A inibição da resposta inflamatória e fibrótica granulomatosa foi também notada no caso dos animais nocautes para iNOS. O tratamento com 1400W, um inibidor da enzima iNOS, diminui de forma marcada as alterações de função pulmonar e fibrose tecidual verificadas nos camundongos silicóticos. Em conclusão, nossos resultados mostram que o comprometimento da função pulmonar, representado pelo aumento na resistência/elastância e hiper-reatividade das vias aéreas, mostraram-se correlacionados à maior geração de NO e de peroxinitrito, assim como da expressão da enzima iNOS. A depleção do gene codificante ou, ainda, o bloqueio da enzima iNOS aboliram a resposta de comprometimento da função pulmonar e fibrose tecidual na silicose experimental. Em conjunto estes achados indicam que o NO parece ser um mediador importante no contexto da silicose, colocando-se como um alvo terapêutico em potencial no tratamento de doenças de caráter fibrótico. / Silicosis is a lung disease caused by inhalation of silica particles, which is dependent on several inflammatory mediators. In this study we investigated the role of nitric oxide (NO) in the alteration of lung function and airways hyperreactivity caused by intranasal silica stimulation in mice. The parameters analyzed included: i) lung function (resistance and elastance) and airways hyperreactivity to aerosolized methacholine (3 - 27 mg/mL) by invasive plethysmography, and ii) morphological changes, by classical histological techniques and immunohistochemistry. We found that the instillation of silica particles (10 mg) caused an increase in the baseline levels lung of resistance and elastance and airways hyperreactivity to methacholine, from 2 to 28 days. We noted that there was a temporal correlation with morphological changes in lung tissue, which reflected the presence of an intense inflammatory cell infiltrate, followed by progressive fibrosis and granuloma formation. The time-points of 7 and 28 days post-silica stimulation were chosen for subsequent experiments, because they corrrespond to acute and chronic phases of experimental silicosis, respectively. Higher levels of nitric oxide (NO) and peroxynitrite as well as iNOS expression were detected in the bronchoalveolar lavage and lung tissue of silica-stimulated mice stimulated, respectively. In another group of experiments, we observed that mice depleted for the gene encoding for inducible NOS (iNOS) had the responses of increased basal levels of resistance and elastance lung and airways hyperreactivity abolished as compared to wildtype animals (C57BL/6). Inhibition of the inflammatory and fibrotic granulomatous responses were also inhibited in the case iNOS knockout mice. Treatment with the iNOS inhibitor 1400W markedly suppressed changes in lung function and tissue fibrosis observed in silicotic mice. In conclusion, our results show that suppression of lung function failure, including increased in resistance/elastance as well as airways hyperreactivity were correlated with NO and peroxynitrite generation as well as the iNOS expression. The depletion of the gene encoding to or inhibition of iNOS enzymatic activity abolished the response of lung function and tissue fibrosis in experimental silicosis. Together, these findings indicate that NO is an important mediator in the context of silicosis and suggest that it can be considered a potential therapeutic target for the treatment of fibrotic diseases.

Para avaliar a capacidade da toxina ExoU de P. aeruginosa de induzir a expressão do fator tissular (FT) por células epiteliais respiratórias da linhagem BEAS-2B, células infectadas pela cepa PA103, produtora da toxina, foram comparadas com outras infectadas por cepa mutante obtida por deleção do gene exoU e com células controles não infectadas quanto a i) expressão do mRNA do FT, por RT-PCR; ii) expressão da proteína FT em lisados celulares, por ensaio imunoenzimático (ELISA), e na superfície celular, por citometria de fluxo; iii) atividade pró-coagulante das células, pela determinação da capacidade de indução de coagulação de plasma humano normal e do lisado celular, através de ensaio colorimétrico; iv) presença de FT solúvel no sobrenadante das culturas, por ELISA; v) liberação de micropartículas expressando FT e fosfatidilserina (FS), por citometria de fluxo. Nossos resultados mostraram que ExoU foi responsável pelo aumento da expressão do mRNA e da concentração da glicoproteína FT tanto nos lisados quanto na superfície celular. Esse aumento foi revertido quando as bactérias foram tratadas com uma droga inibidora de PLA2 (MAFP), comprovando-se a dependência da atividade fosfolipásica A2 de ExoU para a modulação da expressão do FT. Células infectadas pela cepa PA103 induziram uma diminuição no tempo de coagulação do plasma humano normal e o aumento da hidrólise do substrato sintético utilizado no teste colorimétrico em comparação com as células infectadas com a cepa mutante, mostrando que o FT expresso era funcionalmente ativo. Foi também detectado um aumento na concentração de FT solúvel presente nos sobrenadantes de culturas infectadas por PA103 e no número de micropartículas expressando, simultaneamente, FT e FS em relação à cultura infectada pela cepa PA103&#8710;exoU. Os resultados obtidos nos testes in vitro foram validados pela demonstração de que a concentração de FT no parênquima pulmonar de camundongos infectados, por via intratraqueal, com a cepa selvagem foi significativamente superior à detectada nos animais infectados com a cepa mutante. / To evaluate the capacity of the P. aeruginosa toxin ExoU to induce the expression of tissue factor (TF) by epithelial respiratory cells from the BEAS-2B cell line, cells infected with the ExoU-producing PA103 bacterial strain were compared with cells infected with a mutant obtained by deletion of the exoU gene and with control non-infected cells in their i) expression of the TF mRNA, by RT-PCR; ii) expression of the protein TF in cell lisates and surfaces, by enzyme immunoassay (ELISA) and flow cytometry, respectively; iii) procoagulant activity by determining the ability of intact cells to induce the coagulation of normal human plasma and the ability of cell lysates to cleave the synthetic substrate of a chromogenic assay; iv) presence of soluble TF in cell culture supernatants, by ELISA and v) release of microparticles simultaneously expressing TF and phosphatidylserine, by flow cytometry. Cells infected with the wild type bacteria exhibited increased expression of TF mRNA 1 hour after infection and a positive modulation of TF expression in both cell lysates and cell surfaces. The enhancement of TF expression was inhibited when cells were infected with bacteria previously treated with a PLA2 inhibitor (MAFP), confirming that the ability of ExoU to modulate TF expression depended on its phospholipase A2 activity. Newly expressed TF was shown to be functionally active, by both the decrease in the clotting time of human plasma and the enhancement of the hydrolysis of the chromogenic assay substrate. Cells infected with the ExoU-producing bacteria exhibited also higher concentrations of soluble TF and of TF and PS bearing microparticles in the cell culture supernatants. These in vitro results were validated by our finding of increase TF concentrations in the lung parenchyma of mice infected intratracheally with the ExoU producing-bacteria at 24 h post-infection.

INTRODUÇÃO: Embora seja reconhecida a existência do espessamento da membrana basal e da fibrose da concha nasal na rinite alérgica, não há estudos descritivos do comportamento da mucosa nasal nos pacientes com rinite idiopática. O propósito desse estudo é descrever possíveis alterações na membrana basal e na lâmina própria da concha nasal inferior em pacientes com rinite alérgica ou idiopática, além do estudo quantitativo das fibras colágenas nesta localização. MÉTODOS: Analisou-se na concha nasal inferior obtida através de turbinectomia bilateral em 28 pacientes - 14 com rinite alérgica e 14 com rinite idiopática - a área ocupada pelo colágeno, a espessura da membrana basal e o diâmetro das fibrilas de colágeno através do uso de microscopia óptica (coloração Hematoxilina-eosina e Picrossírius-hematoxilina), microscopia eletrônica e imunoistoquímica para laminina e colágeno IV. RESULTADOS: 1) pacientes com rinite alérgica apresentaram significantemente maior área da concha nasal ocupada por colágeno do que o grupo com rinite idiopática. 2) a membrana basal de pacientes com rinite alérgica foi significantemente mais espessa. 3) a lâmina reticular da membrana basal dos pacientes com rinite alérgica apresentaram fibrilas de colágeno com menor diâmetro que os pacientes com rinite idiopática. 4) não houve diferenças significativas entre os grupos na distribuição de laminina e de colágeno IV. CONCLUSÕES: Alterações na mucosa nasal ocorrem na rinite alérgica, sendo caracterizadas pelo aumento da espessura da membrana basal e por fibrose. Na rinite idiopática, observou-se uma mucosa com aspecto estrutural semelhante aos pacientes normais / INTRODUCTION: Despite our knowledge about nasal conchae fibrosis and basement membrane thickening in allergic rhinitis, there are no descriptive studies on nasal mucosa behavior in patients with idiopathic rhinitis. The aim of our study was to describe possible changes in the basement membrane and lamina propria of the inferior concha in patients with idiopathic or allergic rhinitis, in addition to a quantitative study of collagen fibers in this site. METHODS: The inferior nasal concha obtained from 28 patients submitted to bilateral turbinectomy was examined - 14 with allergic rhinitis and 14 with idiopathic rhinitis; analyzing the collagen area, the basement membrane thickness and the collagen fibrils diameter using optical microscopy (Hematoxylin-eosin and Picrosirius-hematoxylin staining), electron microscopy and immunohistochemistry for laminin and collagen IV. RESULTS: 1) patients with allergic rhinitis had a significantly larger area of the nasal concha occupied by collagen than the group with idiopathic rhinitis. 2) the basement membrane of patients with allergic rhinitis was significantly thicker. 3) the reticular lamina of the basement membrane of patients with allergic rhinitis had collagen fibrils with diameters which were smaller than those from patients with idiopathic rhinitis. 4) there were no significant differences between the groups concerning the distribution of laminin and collagen IV. CONCLUSIONS: Alterations to the nasal mucosa that happen in allergic rhinitis are characterized by basement membrane thickening and fibrosis. In idiopathic rhinitis the patients\' mucosae were structurally similar to those from normal patients