Azidotische Belastungen des Pansens gelten bei Milchkühen besonders in der Frühlaktation als weit verbreitet. Sie werden als subakute Pansenazidosen (SARA) für die häufigen Produktionskrankheiten verantwortlich gemacht. Ziele : dieser Untersuchungen waren a) die Kontrolle des Säure-Basen-Haushalt (SBH) bei HF- Hochleistungskühen im peripartalen Zeitraum zum Vorkommen von SARA, b) die Prüfung bewährter sowie neuer Methoden zur Pansensaftanalyse, c) die Analyse von SBH-Harnparametern sowie d) die Prüfung möglicher Beziehungen von Stoffwechselparametern im Blut zu SBH-Parametern im Pansensaft. Versuchsanordnung : In 10 Betrieben Niedersachsens wurden an je 10 Kühen Verlaufsuntersuchungen mit vier Proben/Tier durchgeführt: 1. Trockenstehperiode/Färsen -30 Tage ante partum (d a.p.) bis zur Kalbung; 2. 2 bis 7 Tage post partum (d p.p.); 3. in der Frühlaktation 8 bis 30 d p.p. und 4. in der Mittellaktation 80 bis 150 d p.p. Pansensaft vormittags mit Geishauser- Sonde gewonnen, Blut aus der V. jugularis externa sowie Harn per Blasenkathederisierung. Analysiert wurden im Pansensaft der pH-Wert, die Pufferkapazität als Titrationsbilanz über die Titrationsazidität und - alkalität, die Methylenblauprobe sowie die Sedimentaktivitätszeit (SAT), im Harn der pH-Wert, die Netto-Säure-Basen-Ausscheidung (NSBA) sowie der Basen-Säure-Quotient (BSQ) und im Blutserum Glukose, freie Fettsäuren (FFS), Betahydroxybutyrat (BHB), L-Laktat, Cholesterol, Protein, Albumin, Bilirubin, Harnstoff, Kreatinin, Na, K, Cl, Ca, P, Mg, ALP, ASAT, GLDH sowie die CK. Ergebnisse: Zwischen Kühen und Färsen wurden bei den gemessenen Parametern keine gesicherten Unterschiede festgestellt. Es gab auch keine Unterschiede zwischen den Betrieben. Die Pansen-pH-Werte bewegten sich von x= 6,8 (6,43/7,0;1./3. Quartil) zu Beginn des Trockenstehens über minimal x = 6,3 (5,9/6,7) 30 bis 60 d p.p. bis x = 6,6 (6,2/6,8) in der Mittellaktation. Sie lagen alle im physiologischen Bereich. 20 Kühe hatten Pansen-pH-Werte von < 5,8, 6 Kühe von < 5,5 und 21 Kühe von > 7,2. Damit kamen die Kühe der SARA-Definition, bezogen auf das einmalige Auftreten von pH-Werten < 5,8 bei einer Kuh, nahe; bezogen auf alle gemessenen Pansen-pH-Werte betrug der Anteil < 5,8 aber nur 9,8 %. Die Titrationsbilanz war in der Trockensteherperiode ausgeglichen; bei allen drei Kontrollen p.p. bestand ein Basendefizit. Die Pufferkapazität war in der 1. Woche p.p. und in der Frühlaktation vermindert. Panse-pH-Werte und Titrationsbilanz korrelierten sehr eng (r=0,98,p<0,001). Die Methylenblauprobe war a.p. mit x = 3:37 (2:22/4:59) Minuten am längsten, in der Mittellaktation mit 3:01 (2:25/4:30) Minuten am kürzesten und ingesamt physiologisch. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Kontollzeiträumen. Die SAT war physiologisch und schwankte zwischen zwei und fünf Minuten ohne signifikante Unterschiede zwischen den Entnahmezeiträumen. Im Harn lagen die NSBA mit x = 70 mmol/l (20/122 = 1./3.Quartil) und der BSQ mit x = 2,2 (1,6/2,8) nur bei den Frischmelkern unter den unteren Grenzwerten und deuteten die Gefahr von SARA an. Der Harn-pH-Wert war mit x = 7,98 (7,7/8,2) physiologisch. Von der Gesamtheit alle NSBA-Werte waren 37% < 83 mmol/l sowie 28,9% < 25 mmol/l; beim BSQ waren es 52,6% < 2,5 sowie 27,4% < 1,5. Die für die NSBA, den BSQ und den Harn-pH-Wert berechneten Sensivitäten und Spezifitäten für einen Pansen-pH-Wert < 5,8 liegen mit 44,8% und 64,5% (NSBA), 55,8% und 47,9% (BSQ) sowie 2,3% und 97% (Harn-pH-Wert) unter den diagnostischen Erfordernissen.Sie können somit keine sicheren Rückschlüsse auf den Pansenzustand geben. Bei den Blutbefunden wurden Kühe mit Pansen-pH-Werten < 5,8 (SARA) und >5,8 gegenüber gestellt. Die Korrelationskoeffizienten, die Sensitivität und die mittels Receiver-Operating-Characteristics Analysen ermittelten Flächen unter der Kurve zwischen Pansen-pH-Wert und den Blutparametern waren niedrig ( p> 0,05). Schlussfolgerung: Hochleistende HF-Kühe haben peripartal nicht zwangsläufig eine SARA. Die Titrationsbilanz ergänzt den Pansensaft-pH-Wert, ist routinemäßig aber nicht nötig. Im Harn liegen die NSBA und BSQ häufiger unter den Grenzwerten und korrelieren nicht gesichert mit dem Pansen-pH-Wert. Auch Blutparameter erlauben keine sichere Aussage über den Pansenzustand. Die Diagnose von SARA muss mit direkter Messung des Pansen-pH-Wertes gestellt werden.

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Teleost fishes incorporate renal ammonia excretion as part of a greater acid-base regulatory system. However, the transport mechanisms employed by the renal epithelium to excrete ammonia are relatively unknown. I hypothesized that, under metabolic acidosis, increased renal ammonia excretion would be the product of tubular secretion and involve a Na+/NH4+ exchange metabolon mediated through Rhesus (Rh) glycoproteins. To induce metabolic acidosis, goldfish (Carassius auratus) were exposed to a low pH environment (pH 4.0; 48-h). There was a clear signal of metabolic acidosis: a reduction in both plasma [HCO3-] and blood pH with no influence on plasma PCO2. Goldfish demonstrated an elevation in total plasma [ammonia] with a reduction in PNH3 under acidosis. Metabolic acidosis induced higher rates of urinary excretion of acidic equivalents in the form of both NH4+ and titratable acidity-HCO3- (TA-HCO3-) excretion. Urinary Na+ excretion was not affected by acidosis and urine [Na+] did not correlate with urinary [ammonia]. Alanine aminotransferase activity in the kidney was higher in acidotic goldfish. Glomerular filtration rate and urine flow rate were not affected by acidosis. Increased renal NH4+ excretion was due to increased secretion, and not increased filtration, of ammonia. There was a corresponding elevation in Rhcg1b mRNA expression but no change in renal Na+ reabsorption. My data support a secretion-based mechanism of teleost renal ammonia transport. This system is Na+ independent and is likely mediated by Rh glycoproteins and H+ ATPase, involving a parallel H+/NH3 secretion mechanism. To investigate effects of metabolic acidosis on elasmobranch fish, Pacific spiny dogfish (Squalus acanthias suckleyi) were infused with an acidic saline (125 mM HCl/375 mM NaCl; 3 ml/kg/h; 24-h). The results are preliminary, with no marked effects of HCl infusion on plasma acid-base or N-status, but increased branchial NHE2 and lower renal NHE3 protein expressions. These data are summarized in an Appendix. / Thesis / Master of Science (MSc)

La forme canadienne-française du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie métabolique associée à une déficience en cytochrome oxydase (COX) et caractérisée par des crises d’acidose lactique, menant à une mort prématurée. Les mécanismes qui sous-tendent l’induction des crises restent inconnus et il n’existe aucune thérapie efficace pour les prévenir. Cette étude vise à caractériser l'effet de facteurs métaboliques périphériques potentiellement altérés chez les patients LSFC sur la mort de lignées cellulaires issues de ces patients et de témoins puis, à identifier des agents thérapeutiques pouvant la prévenir. Nous postulons que (i) ces facteurs métaboliques induiront une mort prématurée des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prévenir pallieront les conséquences de la déficience en COX, soit la diminution des taux d’adénosine triphosphate (ATP) et l’augmentation du stress oxydant, du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thérapeutiques a été réalisé. Les paramètres mesurés incluent la nécrose, l’apoptose, l’ATP et l’activité de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles à la mort par nécrose (39±6%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associé à des niveaux d’ATP diminués (53±8%). La mort cellulaire est réduite de moitié par l’ajout combiné d’agents ciblant le NADH, l’ATP et les lipides toxiques, alors que l’ajout d’antioxydants l’augmente. Ainsi, un excès de nutriments pourrait induire la mort prématurée des cellules LSFC et, pour atténuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant différents mécanismes. / Leigh syndrome French-Canadian variant (LSFC) is a metabolic disease associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency and characterized by episodes of lactic acidosis, referred to as “crisis”, leading to death at an early age. The mechanisms underlying a crisis and its cellular consequences remain elusive, and there is no effective therapy. The aim of this study was to characterize the effect of peripheral metabolic factors that are potentially altered in patients with LSFC on their cells death and to identify therapeutic agents able to prevent them using cell-lineage from LSFC patients and controls. The hypothesis are that (i) these metabolic factors can induce premature death in patient cells, and (ii) interventions that could rescue these cells may target potential consequences of COX deficiency, namely low adenosine triphosphate (ATP), high nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and toxic lipids, as well as oxidative stress. A screening of 8 blood factors and 10 therapeutic agents was conducted in fibroblasts. Parameter measured included cell death by necrosis and apoptosis, as well as ATP level and COX activity. LSFC fibroblasts were more susceptible to necrosis (39±6%) induced by high palmitate plus lactate and this was associated with a lower ATP (53±8%). Cell death decreased 2-fold with combined interventions, which presumably act on NADH, ATP, and the accumulation of toxic lipids, but increased with antioxidants. Collectively, our results emphasize the importance of nutrient overload as a factor eliciting premature cell death in LSFC cells and of combining interventions acting through various mechanisms for cell death rescue.

La forme canadienne-française du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie métabolique associée à une déficience en cytochrome oxydase (COX) et caractérisée par des crises d’acidose lactique, menant à une mort prématurée. Les mécanismes qui sous-tendent l’induction des crises restent inconnus et il n’existe aucune thérapie efficace pour les prévenir. Cette étude vise à caractériser l'effet de facteurs métaboliques périphériques potentiellement altérés chez les patients LSFC sur la mort de lignées cellulaires issues de ces patients et de témoins puis, à identifier des agents thérapeutiques pouvant la prévenir. Nous postulons que (i) ces facteurs métaboliques induiront une mort prématurée des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prévenir pallieront les conséquences de la déficience en COX, soit la diminution des taux d’adénosine triphosphate (ATP) et l’augmentation du stress oxydant, du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thérapeutiques a été réalisé. Les paramètres mesurés incluent la nécrose, l’apoptose, l’ATP et l’activité de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles à la mort par nécrose (39±6%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associé à des niveaux d’ATP diminués (53±8%). La mort cellulaire est réduite de moitié par l’ajout combiné d’agents ciblant le NADH, l’ATP et les lipides toxiques, alors que l’ajout d’antioxydants l’augmente. Ainsi, un excès de nutriments pourrait induire la mort prématurée des cellules LSFC et, pour atténuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant différents mécanismes. / Leigh syndrome French-Canadian variant (LSFC) is a metabolic disease associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency and characterized by episodes of lactic acidosis, referred to as “crisis”, leading to death at an early age. The mechanisms underlying a crisis and its cellular consequences remain elusive, and there is no effective therapy. The aim of this study was to characterize the effect of peripheral metabolic factors that are potentially altered in patients with LSFC on their cells death and to identify therapeutic agents able to prevent them using cell-lineage from LSFC patients and controls. The hypothesis are that (i) these metabolic factors can induce premature death in patient cells, and (ii) interventions that could rescue these cells may target potential consequences of COX deficiency, namely low adenosine triphosphate (ATP), high nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and toxic lipids, as well as oxidative stress. A screening of 8 blood factors and 10 therapeutic agents was conducted in fibroblasts. Parameter measured included cell death by necrosis and apoptosis, as well as ATP level and COX activity. LSFC fibroblasts were more susceptible to necrosis (39±6%) induced by high palmitate plus lactate and this was associated with a lower ATP (53±8%). Cell death decreased 2-fold with combined interventions, which presumably act on NADH, ATP, and the accumulation of toxic lipids, but increased with antioxidants. Collectively, our results emphasize the importance of nutrient overload as a factor eliciting premature cell death in LSFC cells and of combining interventions acting through various mechanisms for cell death rescue.

La protéine mitochondriale LRPPRC (leucine-rich pentatricopeptide repeat motif containing), codée par le gène nucléaire du même nom, est impliquée dans la stabilisation des ARNm mitochondriaux, particulièrement les ARNm codants pour l’assemblage du complexe IV (COX) de la chaîne respiratoire mitochondriale (OXPHOS). Le syndrome de Leigh de type canadien français (LSFC) est une maladie mitochondriale neurodégénérative caractérisée par une mutation spécifique A354V du gène Lrpprc, et par une déficience de l’activité de COX. Les organes les plus affectés sont le foie et le cerveau mais, les mécanismes associés à la progression de la maladie restent encore peu compris. Un modèle murin à délétion hépato-spécifique en LRPPRC (H-LRPPRC KO) a été créé dans le but d’étudier l’aspect hépatique du LSFC caractérisé par des dommages et une stéatose hépatique. Représentant l’objectif 1 de ce mémoire, le modèle H-LRPPRC KO a été utilisé pour une étude de caractérisation de la stéatose hépatique non-alcoolique (SHNA) sans obésité dans laquelle nous avons pu mettre en évidence une progression plus avancée de la pathologie hépatique chez les souris mâles associée à la présence d’une dysfonction cardiaque diastolique. L’objectif 2 de ce mémoire a pour but la caractérisation d’un nouveau modèle murin plus représentatif du LSFC pour ultimement trouver de nouvelles signatures/approches thérapeutiques. Nous utilisons cette fois un modèle murin développé par nos collaborateurs, à délétion inductible (KI), par le tamoxifène, de Lrpprc sur un allèle tandis que le deuxième exprime la mutation A354V spécifique au LSFC pour ainsi caractériser la maladie d’un point de vue biochimique et moléculaire. Nos premiers résultats montrent des signatures et caractéristiques comparables à celles observées chez les patient(e)s LSFC et dans le modèle H-LRPPRC KO avec une perte de poids drastique, une diminution des niveaux de la protéine LRPPRC et de COX et plusieurs perturbations du profil lipidomique dans le foie, le plasma et le cerveau. Ces résultats posent les bases biochimiques et moléculaires de ce modèle pour justifier son utilisation ultérieure pour l’évaluation des manifestations cliniques comme les atteintes musculaires et encore cognitives tel qu’observé chez les personnes atteintes de LSFC. / The mitochondrial protein LRPPRC (leucine-rich pentatricopeptide repeat motif containing), encoded by the nuclear gene of the same name, is involved in the stabilization of mitochondrial mRNAs, particularly those coding for the assembly of complex IV (COX) of the mitochondrial respiratory chain (OXPHOS). Leigh syndrome French Canadian type (LSFC) is a mitochondrial neurodegenerative disease characterized by a specific A354V mutation in the Lrpprc gene as well as a deficiency in COX activity. The most affected organs are the liver and brain, but the mechanisms associated with disease progression remain poorly understood. A hepato-specific knockout of LRPPRC mouse model (H-LRPPRC KO) was created to study the hepatic aspect of LSFC which includes liver damage and steatosis. Defined as the first objective of this master’s thesis, the H-LRPPRC KO model was used for the characterization of non-alcoholic hepatic steatosis (NAHS) without obesity in which we were able to highlight a more advanced progression of liver pathology in male mice associated with the presence of cardiac diastolic dysfunction. Furthermore, the second objective of this master’s thesis aims to characterize a new mouse model more representative of LSFC to ultimately find new therapeutic signatures/approaches. Here, we use a mouse model developed by our collaborators with tamoxifen-inducible deletion (KI) of Lrpprc on one allele, while the second one expresses the LSFC-specific A354V mutation, to characterize the disease from a biochemical and molecular perspective. Our initial results show signatures and characteristics comparable to those observed in LSFC patients as well as in the H-LRPPRC KO model, with drastic weight loss, reduced protein levels of LRPPRC and COX, and several disturbances of the lipidomic profile in liver, plasma and brain. These results lay the biochemical and molecular foundations of this model, justifying its future use in the evaluation of clinical manifestations such as muscular and cognitive impairment as observed in LSFC patients.