La lécithine:rétinol acyltransferase (LRAT) est une enzyme de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) qui joue un rôle essentiel dans le cycle visuel des rétinoïdes au niveau de l'estérification du rétinol tout-trans en rétinyl ester tout-trans. Plusieurs travaux de caractérisation de cette protéine ont été publiés depuis les 20 dernières années, mais ce n'est que depuis 2003 qu'il est possible d'utiliser une forme tronquée et purifiée de la LRAT qui correspond à sa portion cytosolique (tLRAT) (Bok et al. 2003). Bien que plusieurs mécanismes biochimiques aient été approfondis avec la tLRAT purifiée, très peu d'investigations à propos de sa structure et de son interaction membranaire ont été publiées jusqu'à maintenant. De plus, même si les paramètres enzymatiques de la tLRAT ont été étudiés par différents groupes de recherche, ces travaux ont été effectués avec un protocole expérimental indadéquat conduisant à des niveaux d'activité non-reproductibles d'un article à l'autre. Nous avons donc produit la tLRAT afin d'étudier en profondeur sa structure secondaire, son interaction membranaire et son activité enzymatique. En élaborant un nouveau protocole de recherche pour étudier l'activité enzymatique de la tLRAT, nous avons pu obtenir des niveaux d'activité très élevés et reproductibles. Par surcroît, les méthodes de spectroscopie infrarouge (IR) dichroïsme circulaire électronique et vibrationnel ont permis de déterminer que la tLRAT était constituée d'une structure secondaire majoritairement en hélice alpha. Ensuite, la spectroscopie de réflexion-absorption par modulation de polarisation en IR (PM-IRRAS) a permis de déterminer que la tLRAT interagissait fortement et hydrolysait des monocouches de phospholipides. L'interaction entre la tLRAT et différents types de lipides retrouvés dans les membranes de l'EPR a également été caractérisée avec la méthode des monocouches de Langmuir par la détermination de la pression d'insertion maximale (PIM). Cette méthode a permis de déterminer que la tLRAT s'adsorbait spontanément aux monocouches de lipides à des pressions de surface au-delà la pression latérale des membranes biologiques. Les deux segments hydrophobes en N- et C-terminal de la LRAT qui n'ont pas été surexprimés dans la tLRAT ont été synthétisés afin de les étudier en PM-IRRAS. Ces expériences ont permis de démontrer qu'ils interagissaient fortement avec les monocouches de lipide et qu'ils adoptaient une structure en hélice alpha. Enfin, le mutant S175R responsable de la rétinite pigmentaire a été produit afin de comprendre les impacts moléculaires de cette mutation. La méthode des monocouches de Langmuir et le dichroïsme circulaire ont permis de démontrer que son interaction membranaire et sa structure secondaire n'étaient pas modifiés en comparaison à la forme sauvage de la tLRAT. Cependant, comme son activité enzymatique est absente, il a été conclu que l'entrée du substrat dans le site actif devait être compromise par la mutation de la serine en arginine.

En plus de leurs propriétés structurales comme constituants majeurs des membranes biologiques des cellules, les lipides jouent de nombreux rôles dans la signalisation cellulaire, le stockage d’énergie et le transport de protéines. Leurs importances biologiques ont mené à une augmentation accrue des méthodes analytiques pour la caractérisation d’espèces moléculaires uniques. De récents progrès en spectrométrie de masse ont amené à la caractérisation et à la quantification des espèces moléculaires des lipides dans des extraits lipidiques bruts (Han and Gross, 2005; Murphy et al., 2001). Par exemple, les espèces moléculaires de phospholipides peuvent être identifiées spécifiquement par leur tête polaire, la nature de leurs chaînes d’acide gras et leur positionnement au niveau du squelette glycérol. / In addition to their structural properties as main constituents of biological membranes, lipids play a multitude of roles such as in cell signalling, energy storage, and protein transport. Their biological importance has led to an increasing focus on analytical methods for the characterisation of their individual molecular species. Improvements in mass spectrometric technology has provided a great advantage for the characterisation and quantification of molecular lipid species in total lipid extracts (Han and Gross, 2005; Murphy et al., 2001). For instance, phospholipid molecular species can be identified on the basis of a characteristic fragment of the lipid class, the nature of the acyl chains and their positions on the glycerol backbone.A method allowing the quantitative profiling of the yeast lipidome was developed in a recent study using automated shotgun infusion strategy (Ejsing et al., 2009). We applied this method to characterise several lysophospholipid acyltransferase yeast mutants produced using reverse-genetics. These enzymes are involved in essential biological processes like de novo synthesis or remodelling of the phospholipid membrane component (Testet et al., 2005; Le Guedard et al., 2009). The comparative analysis of phospholipid molecular species from the wild-type strain and the corresponding deletion mutants has allowed us to identify lipid compositional changes, and has given us significant indications about the in vivo function of the encoded lysophospholipid acyltransferases.

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Le remodelage vasculaire est un processus pathologique responsable du développement de la maladie coronarienne, de la resténose intra-stent et de l'échec des greffes de pontage coronarien. Il se caractérise par un épaississement de la paroi des vaisseaux, dû à une prolifération excessive des cellules musculaires lisses vasculaires (CMVL) résidentes, induisant une réduction du flux sanguin dans les artères et conduits qui alimentent le cœur et augmentent le risque d'infarctus du myocarde. Ce phénotype anormal des CMVL est gouverné par la régulation réciproque des changements métaboliques (effet Warburg, synthèse accrue de lipides) et la reprogrammation épigénétique, mécanismes partagés avec les cellules cancéreuses. Dans la pathologie, les CMVL normalement quiescentes, acquièrent un phénotype synthétique caractérisé par une diminution de l'expression des marqueurs contractiles et par l'augmentation concomitante de l'expression de gènes impliqués, entre autres, dans la prolifération, la migration et la production de matrice extracellulaire, contribuant activement au remodelage vasculaire. L'enzyme nucléo-cytoplasmique ATP citrate lyase (ACLY) a récemment émergé comme un acteur majeur et une nouvelle cible thérapeutique favorisant l'effet Warburg, la synthèse de lipides et la reprogrammation épigénétique des cellules cancéreuses. ACLY génère de l'acétyl-CoA à partir du citrate dérivé des mitochondries, produit à partir du glucose et est considérée comme la source majeure d'acétyl-CoA pour la synthèse de lipides et l'acétylation globale des histones (favorisant l'expression des gènes). Son expression et son activation sont augmentées dans de nombreux cancers et associées avec un mauvais pronostic. Cependant, son implication dans le remodelage vasculaire coronarien est inconnue. Dans notre étude nous avons mis en évidence que la protéine ACLY est surexprimée et suractivée dans les CMVL d'artères coronariennes isolées de patients avec syndrome coronarien (SC) comparativement à des CMVL isolées de patients témoins. L'originalité de notre étude réside dans le fait qu'ACLY se retrouve au croisement des processus bioénergétiques et épigénétiques connus pour favoriser le profil pro-prolifératif des CMVL-SC. En effet, nous démontrons qu'en soutenant la production d'acétyl-CoA, ACLY participe au maintien de l'effet Warburg et de l'expression de gènes pro-prolifératifs via l'acétylation des histones. Dans les cellules cancéreuses, il a déjà été démontré qu'ACLY se localise à la fois dans le cytoplasme et le noyau pour réguler l'état métabolique cellulaire ainsi que l'acétylation des histones, affectant l'activité de nombreux facteurs de transcription. Ainsi, cibler l'ATP-citrate lyase en tant que régulateur critique de l'activité proliférative et métabolique des cellules peut être considéré comme un mécanisme essentiel de l'activité et de la viabilité cellulaire. Nous montrons que la réduction de l'expression d'ACLY affecte principalement un certain nombre de gènes impliqués dans la prolifération cellulaire des CMVL, dont l'expression est contrôlée par le facteur de transcription FOXM1, et est associée à une amélioration du métabolisme cellulaire et protège contre le remodelage vasculaire in vivo. Les effets de l'inhibition génétique et pharmacologique d'ACLY sur nos modèles précliniques (animaux et culture de tissu humain) suggèrent qu'ACLY représente une cible thérapeutique pour entraver l'état pro-prolifératif des CMVL contribuant au développement du remodelage vasculaire dans la maladie coronarienne et les pathologies associées (resténose intra-stent et échec des greffes coronariennes).