Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_BrunaOliveirae_D.pdf: 26161582 bytes, checksum: 03a823d75454c98764eb80bc3c4a356d (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Malária vivax foi por muito tempo considerada uma infecção benigna, porém, complicações frequentes nas infecções por P. falciparum, como a malária cerebral, síndrome respiratória aguda (ARDS), disfunção hepática, trombocitopenia grave e baixo peso ao nascer devido à infecção placentária, também têm sido observadas em pacientes infectados por P. vivax. Na malária falciparum, estes sintomas estão associados à adesão de eritrócitos infectados por P. falciparum (Pf-IE) que se ligam a diversos receptores do hospedeiro, incluindo CD36, ICAM-1 e CSA. No entanto, não há evidência direta do seqüestro de eritrócitos infectados por P. vivax (Pv-IE) e uma possível capacidade citoadesiva permanecia por ser demonstrada. Pv-IE coletados de pacientes da Amazônia brasileira foram enriquecidos por gradiente de Percoll ® e a capacidade de citoadesão parasitária foi testada em um grupo de células que expressam receptores endoteliais sabidamente envolvidos na citoadesão de P. falciparum, em condições estáticas e em um sistema que mimetiza o fluxo sanguíneo. Mostramos que Pv-IE citoaderem sob condições estáticas e de fluxo, embora em níveis cerca de 10 vezes inferiores aos observado para P. falciparum. Demonstramos ainda que a citoadesão de P. vivax pode ser mediada por membros da família VIR, proteínas expressas na superfície de eritrócitos infectados e codificadas por uma superfamília de genes variantes (vir). Estes dados abrem perspectivas para uma melhor compreensão do fenômeno patológico relacionado com a malária vivax grave incluindo a descoberta de ligantes parasitários e receptores do hospedeiro / Abstract: Vivax malaria has been considered for a long time a benign infection; however severe complications, as observed in P. falciparum, such as cerebral malaria, acute respiratory distress syndrome (ARDS), liver dysfunction, severe thrombocytopenia and low birth weight due placental infection have also been reported worldwide for P. vivax-infected patients. In falciparum malaria, these symptoms are associated to sequestration of P. falciparum-infected erythrocytes (Pf-IE) that bind to several host receptors, including CD36, ICAM-1 and CSA. Nonetheless, direct evidence of P. vivax-infected erythrocytes (Pv-IE) sequestration is missing and binding analyzes of this species is lacking. Pv-IE obtained from patients in the Brazilian Amazon were enriched by Percoll® gradient and parasite adherence was tested to a panel of cells expressing endothelial receptors known to mediate cytoadhesion of P. falciparum, in static and flow conditions. Here we show that mature Pv-IE cytoadhere both under static and flow conditions, albeit at levels about 10-fold lower than those observed for P. falciparum. We further demonstrate that cytoadhesion by P. vivax was in part mediated by members of the VIR family, parasite-derived proteins expressed at the infected erythrocyte surface and encoded by a superfamily of variant genes (vir). These data open perspectives for a better understanding of the pathological phenomenon related to severe P. vivax malaria, including the discovery of novel parasite ligand(s) and host receptor(s) / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bastos_MarceleFontenelle_M.pdf: 15905703 bytes, checksum: b7c6bc673961fdae05225ebe3ac50346 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: 0 seqüestro de eritrócitos infectados par Plasmodium falciparum (Pf-Els) na microvasculatura de varies órgãos envolve uma seqüência de eventos que acredita­se contribuir para a patogênese da malaria grave. Apesar do tratamento com drogas antimaláricas serem eficazes, mortalidade significativa ainda é vista nos casos graves da doença, particularmente no prazo de 24 horas da admissão hospitalar. Acredita-se que o uso de terapias anti-adesivas nesse período poderia minimizar as complicações causadas pelo P. falciparum. Nesse sentido, polissacarídeos sulfatados, como a heparina e a condroitina-sulfato-A (CSA), têm mostrado capacidade em inibir a citoaderência de Pf-Els a receptores endoteliais. A heparina foi usada no passado no tratamento da malaria grave, mas deixou de ser recomendada, devido a ocorrência de sérios efeitos colaterais, como hemorragias. Além disso, esses compostos são derivados de mamíferos, o que aumenta o risco de contaminação por agentes patogênicos. De fato, embora muitos compostos tenham sido testados, nenhum demonstrou evidência inequívoca de melhora nos testes clínicos para prevenção e tratamento da malária grave. 0 condroitim sulfate fucosilado (FucCS) é um polissacarídeo altamente sulfatado extraído do pepino-do-mar Ludwigothurea grisea, composto por uma base estrutural de condroitim sulfato de mamífero, e substituído na posição 3 dos resíduos de acido ß-D-glucurônico com cadeias de fucose sulfatadas. Nesse estudo, mostramos que o FucCS apresenta baixa toxicidade, e é um potente inibidor da citoaderência parasitária em células endoteliais de pulmão humano (HLEC) e da reinvasão de eritrócitos por merozoítos de P. falciparum. Em ambos os casos, a inibição ocorre de maneira dose dependente, e o composto mostrou ser eficiente na inibição de diferentes fenótipos parasitários. A remoção das cadeias de fucose sulfatadas do FucCS praticamente aboliu o efeito inibitório, sugerindo um papel central desempenhado por essas cadeias na ocorrência do processo inibitório. 0 composto também mostrou ser capaz de reverter a citoadesão parasitária em sistema que mimetiza o fluxo sangüíneo. Além disso, o tratamento com o FucCS (1 mg/kg/animal/dia) demonstrou retardar a morte de camundongos infectados com Plasmodium berghei ANKA (PbA), modelo experimental de malária cerebral. Assim, sugerimos o FucCS como um candidato promissor a terapia adjuvante no tratamento da malária grave e na prevenção ao agravamento da doença / Abstract: Sequestration of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (Pf-EIs) in the microvasculature of several organs involves a sequence of events that contributes to the pathogenesis of severe malaria. Despite treatment with effective antimalarial drugs, significant mortality is still observed in severe cases of disease, particularly within 24 hours of hospital admission. It is believed that the use of anti-adhesive therapies in this period could reduce complications caused by P. falciparum. Accordingly,sulfated polysaccharides such as heparin and chondroitin sufate A (CSA) have shown ability to inhibit the cytoadherence of Pf-EIs to endothelial receptors. Although heparin was used in the past as treatment for severe malaria, its use was discontinued due to the occurrence of serious side effects such as bleeding. Moreover, given that these compounds are obtained from mammals, potential risk of contamination has to be considered. In fact, although many compounds have been tested, none demonstrated unequivocal evidence of improvement in clinical trials for prevention and treatment of severe malaria. The fucosylated chondroitin sulfate (FucCS) is a highly sulfated polysaccharide extracted from sea cucumber Ludwigothurea grisea, composed of a chondroitin sulfate backbone substituted at the 3-position of the ß-D-glucuronic acid residues with sulfated fucose branches. In this study, we show that FucCS presents low toxicity and is a potent inhibitor of parasite cytoadherence in human lung endothelial cells (HLEC) and reinvasion of erythrocytes by P. falciparum merozoites. In both cases, inhibition occurs in a concentration-dependent manner, and the compound showed to be effective in inhibiting different parasite phenotypes. Removal of the sulfated fucose branches on the FucCS practically abolished the inhibitory effect, suggesting a central role played by these branches in the occurrence of the inhibitory process. The compound also showed ability to reverse parasite cytoadhesion under flow conditions. Furthermore, treatment with FucCS at 1 mg/kg/animal/day improved survival of C57BL/6 ice infected with Plasmodium berghei ANKA (PbA), an experimental model for cerebral malaria. Thus, we suggest FucCS as a promising candidate for adjunct therapy in the treatment of severe malaria and in prevention of severe malaria outcomes / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Ibsen Bellini Coimbra / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T21:46:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mara_CristianeSampaiode_D.pdf: 1385801 bytes, checksum: b23144f0f1856aa53731ad5cb632b9bb (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo. O sangue do cordão umbilical contem células tronco mesenquimais (CTM) indiferenciadas que tem potencial condrogênico e podem ser usadas para reparo de lesão articular. Durante o processo de condrogênese, a atuação de fatores de crescimento ainda não está totalmente elucidada. Este estudo teve como objetivo avaliar a formação de condrócitos, matriz cartilaginosa e colágeno tipo II a partir de células do sangue do cordão umbilical humano, expondo-as a quatro diferentes fatores de crescimento: TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 e BMP-6 e cultivando-as em micromass e monolayer. Métodos: Sangue do cordão umbilical foi obtido de gestantes a termo. Células mononucleares foram separadas e colocadas em cultura, para expansão, caracterizadas por citometria de fluxo com anticorpos específicos para CTM e induzidas a diferenciação condrogênica, com TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 e BMP-6 em micromass e monolayer. O fenótipo das células foi avaliado após 21 dias por RT-PCR e Western Blotting para identificação de Colágeno tipo II, Sox-9 e Agrecano. Resultados: As células expandidas foram caracterizadas como mesenquimais. A expressão do mRNA para colágeno tipo II e agrecano foi expresso a partir do 14º dia, nas células estimuladas com TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 e BMP-6. O fator de transcrição SOX-9 foi expresso pelas células estimuladas com TGF-ß3, IGF-1 e BMP-2, o que mostra que estes fatores de crescimento estão associados com a condrogênese de condrócitos articulares, enquanto que a BMP-6 esta associada a condrogênese de condrócitos hipertróficos. No Western Blotting, nós encontramos colágeno tipo II em todos os grupos e a maior expressão foi observada no 14º dia nas células estimuladas com TGF-ß3 em sistema de cultura em micromass. Estes resultados mostram que o TGF-ß3 usado em micromass é o melhor fator de crescimento para promover a diferenciação e proliferação celular das células mesenquimais do sangue do cordão umbilical. Embora mais estudos sejam necessários, este fato nos aproxima de uma alternativa para transplantes autólogos. / Abstract. Umbilical cord blood contains undifferentiated mesenchymal stem cells (MSCs) with chondrogenic potential that may be used for the repair of joint damage. The role of growth factors during the process of chondrogenesis is still not entirely understood. The objective of this study was to evaluate the formation of chondrocytes, cartilaginous matrix and type II collagen from human umbilical cord blood stem cells exposed to four different growth factors, TGF-ß3, IGF-1, BMP-6 and BMP-2, while being cultured as a micromass or a monolayer. Umbilical cord blood was obtained from full-term deliveries, and then mononuclear cells were separated and cultured for expansion. Afterwards, these cells were induced to chondrogenic differentiation in micromass and monolayer cultures supplemented with TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 and BMP-6. Cellular phenotype was evaluated after 7, 14 and 21 d by RT-PCR and western blot analysis to identify type II collagen, Sox- 9 and Aggrecan. The expanded cells displayed surface antigens characteristic of mesenchymal progenitor cells and were negative for hematopoietic differentiation antigens. Type II collagen and aggrecan mRNAs were expressed from day 14 in cells stimulated with TGF-ß3, IGF-1, BMP-2 or BMP-6. The Sox-9 transcription factor was expressed in cells stimulated with TGF-ß3, IGF-1 and BMP-2, which demonstrates those are associated with chondrogenesis in joint chondrocytes while BMP-6 is associated with the chondrogenesis of hypertrophic chondrocytes. Type II collagen was demonstrated by western blotting in all groups, and the greatest expression was observed 14 d after cells were stimulated with TGF. The results of this study demonstrate that TGF-ß3 used in micromass culture is the best growth factor for promoting the proliferation and differentiation of mesenchymal cells from UCB during chondrogenesis. Although more studies are needed, this approach may provide an alternative to autologous grafting. / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A principal causa de mortalidade em pacientes com cÃncer està relacionada com a presenÃa de tumores secundÃrios pelo organismo. Devido a falta de tratamento das metÃstases, muitos esforÃos estÃo sendo lanÃados para o desenvolvimento de novas drogas com potencial antimetastÃtico. Em estudos realizados em nosso laboratÃrio observamos que a biflorina, uma o-naftoquinona isolada das raÃzes da Capraria biflora, aumentava a sobrevida dos animais transplantados com o melanoma B16 sem expressiva toxicidade. Diante desse dado resolvemos avaliar a atividade antimetastÃtica desta naftoquinona, em modelos experimentais in vivo e in vitro, utilizando as linhagens celulares B16-F10 (melanoma murino) e MDAMB-435 (melanoma humano). A induÃÃo da metÃstase experimental foi realizada pela inoculaÃÃo da linhagem celular B16-F10 via veia caudal de animais C57BL/6. Neste ensaio, a biflorina (25 e 50 mg/kg/dia) inibiu a formaÃÃo dos nÃdulos metastÃtico em 57 e 71 %, respectivamente. Entretanto, em anÃlise histopatolÃgica dos pulmÃes dos animais tratados, foi observada a presenÃa de hemÃcias e hemossiderina, o que indica a presenÃa de hemorragia recente e tardia. Com objetivo de avaliar como a biflorina tem seu efeito sobre a metÃstase, foram realizados alguns ensaios in vitro utilizando duas linhagens de melanoma metastÃtico: B16-F10 e MDAMB-435. Em ensaio de adesÃo celular, a biflorina foi capaz de inibir a adesÃo de ambas as cÃlulas sobre o colÃgeno tipo I, um dos constituintes da matriz extracelular. AlÃm disso, em ensaio de migraÃÃo celular, utilizando o mÃtodo Wound healing (cicatrizaÃÃo), a biflorina tambÃm foi capaz de inibir a motilidade destas cÃlulas. Vale ressaltar que nesses ensaios foram utilizadas concentraÃÃes nÃo-citotÃxicas, o que exclue um efeito falso positivo. Por fim, em ensaio de zimograma com gelatina, foi observado que a biflorina nÃo alterava a liberaÃÃo das metaloproteinases -2 e -9 para o meio de crescimento, excluindo esse mecanismo de aÃÃo. Esses resultados sugerem que a biflorina apresenta um potencial antimetastÃtico bastante promissor atravÃs da sua aÃÃo sobre a adesÃo e migraÃÃo celular, eventos cruciais para que ocorra a formaÃÃo de metÃstase. Entretanto, futuros estudos sÃo necessÃrios para elucidar seu mecanismo de aÃÃo. / The main cause of mortality in cancer patients is related to the incidence of secondary tumors in the body. Owning up to the deficiency of therapeutic schemes direct to the treatment of metastasis, many efforts are being launched to develop drugs with anti-metastatic potential. In previous studies performed in our laboratory, biflorin, an o-naphthoquinone isolated from the roots of Capraria biflora, was found to increase the survival rates of B16-bearing mice without significant toxicity. In spite of these findings we decided to evaluate the anti-metastatic activity of biflorin using B16-F10 (murine melanoma) and MDAMB-435 (human melanoma) cells line. The experimental metastasis model was achieved by injecting B16-F10 cells in the tail vein of C57BL/6 mice. In this assay, biflorin (25 and 50 mg/kg/day) inhibited the formation of metastatic nodules in 57 and 71 %, respectively. Nevertheless, histopathological analyses of biflorin-treated lungs showed the presence of erythrocytes and hemosiderin, indicating the occurrence of recent and late hemorrhage. In order to evaluate how biflorin inhibits metastasis, we carried out in vitro tests using two cell lines of metastatic melanoma, B16-F10 and MDAMB-435. In the cell adhesion assay, biflorin inhibited adhesion of both cells lines on type I collagen, a substrate of the extracellular matrix. Moreover, biflorin was able to inhibit cell motility in the wound healing assay. The concentrations used in these assays did not show any cytotoxicity after 24 h of incubation, excluding a false-positive. Even so, in the zymogram assay we observed that biflorin did not alter the release of metallopeptidases -2 and -9 into growth medium, thus excluding this as the means by which biflorin exerts the anti-metastatic effect. These data suggest that biflorin has a promising anti-metastatic potential, as shown by its anti-adhesion and anti-migration properties on metastatic melanoma cell lines, however further studies are indispensable to elucidate its action mechanism.

Objetivo: As moléculas de adesão celular (MAC) são essenciais para a manutenção do fenótipo epitelial. Alguns estudos têm relatado associação entre as alterações de sua expressão e a carcinogênese, mas o seu papel no câncer de próstata não é claro. Nosso objetivo foi estudar o perfil de expressão de E-caderina, cateninas e integrinas em espécimes cirúrgicos de câncer de próstata e associar as suas expressões com a evolução do tumor. Avaliamos também o perfil de expressão em metástases ósseas e linfonodais, a fim de compreender a influência destes marcadores na progressão do câncer de próstata. Materiais e Métodos: Foram selecionados 111 pacientes com câncer de próstata localizado tratados com prostatectomia radical pelo mesmo cirurgião. Sessenta pacientes não apresentaram recidiva tumoral após acompanhamento médio de 123 meses. A expressão das MAC foi avaliada por imuno-histoquímica (IH) em microarranjo tecidual (TMA), contendo duas amostras de cada tumor. Empregamos análise semiquantitativa para avaliação da expressão e determinamos a associação entre a expressão de cada MAC com a recorrência do tumor após a cirurgia. Avaliamos também a expressão das MAC por IH em TMA contendo espécimes de 28 metástases ósseas e em outro TMA contendo 19 metástases linfonodais com seus 19 tumores primários correspondentes. Resultados: Nos tumores primários a análise multivariada mostrou que a expressão das integrinas 3 e 3 1 relaciona-se com recidiva da doença. Quando a expressão de 3 foi forte e a expressão de 3 1 foi positiva, as chances de recorrência foram de 3,0 e 2,5 vezes maior. Apenas 19% e 28% dos pacientes estavam livres de recidiva após seguimento médio de 123 meses, quando os tumores apresentavam forte imunoexpressão de 3 ou positiva para 3 1 respectivamente. Outras integrinas apresentaram expressão reduzida, exceto 6 que foi expressa pela maioria dos tumores primário e metástases. A E-Caderina e as cateninas não mostraram associação com o prognóstico no tumor de próstata localizado. No sítio metastático, houve perda global de expressão das MAC. Encontramos ganho de expressão com a progressão do câncer de próstata somente para a integrina 3 que mostrou forte expressão em metade das metástases ósseas e linfonodais. Encontramos forte expressão de e -catenina foi em 94% dos linfonodos e 45% Conclusões: Nossos experimentos demonstram que a expressão das integrinas 3 e 3 1 está independentemente associada à recidiva de câncer de próstata após prostatectomia radical, e que a perda das moléculas de adesão celular pode ser considerada uma característica da progressão desta neoplasia / Purpose: Cell adhesion molecules (CAM) are essential for the maintenance of epithelial phenotype. Some studies have reported correlations between abnormalities in their expression and carcinogenesis, but their role in prostate cancer is unclear. Our aim was to study the expression profile of E-cadherin, catenins and integrins in surgical specimens of prostate cancer and associate their expression with outcome. We also assessed these expressions in bone and lymph node metastases in order to understand their influence in the progression of prostate cancer. Materials and Methods: We selected 111 patients with localized prostate cancer who underwent radical prostatectomy performed by the same surgeon. Sixty patients had no tumor recurrence after a median follow-up of 123 months. The CAM expression was evaluated by immunohistochemistry in a tissue microarray (TMA) containing two samples of each tumor. A semiquantitative analysis was employed and we measured the association between the expression of CAM and tumor recurrence. We also evaluated CAM expression by immunohistochemistry in a TMA containing 28 bone metastases and in other TMA containing 19 lymph node metastases with their corresponding 19 primary tumors. Results: In primary tumors, multivariate analysis showed that expression of 3 and 31 integrins was related to worse outcome. When 3 expression was strong and 31 expression was positive,the odds of recurrence were 3.0 and 2.5 fold higher. Only 19% and 28% of patients were recurrence-free in a mean follow up period of 123 months, when tumors showed strong 3 or positive 31 immuno-expression respectively. Other integrins have shown reduced expression, except 6 , which was expressed in most primary and metastatic cases. E-cadherin and catenins expressions were not associated with primary tumor outcome. At the metastatic setting, there was a global loss of CAM expression. We observed reliable gain of expression with prostate cancer progression only for integrin 3 that showed strong expression in half of bone and lymph node metastases. Interestingly, strong expression of and -catenin was observed in 94% of lymph node and 45% of bone metastases. Conclusions: We have demonstrated that the expression of integrins 3 and 31 was independently associated with recurrence after radical prostatectomy. In addition, we have shown that the loss of cell adhesion molecules can be considered a characteristic of prostate cancer progression

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T10:07:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_LauremiliaRiconG.R.da_D.pdf: 3335092 bytes, checksum: 1187b50ec4df532e027b86fabe029bc9 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os eventos de migração e adesão das células progenitoras hematopoéticas são cruciais para a sua manutenção nos nichos da medula óssea e são regulados por diversos fatores, dentre eles as RhoGTPases. ARHGAP21 é uma proteína RhoGAP (RhoGTPase activating protein, que regulam negativamente as RhoGTPases), e atua na migração e adesão celulares. O papel da Arhgap21 na hematopoese ainda é desconhecido. O objetivo geral do presente estudo foi estudar a função da Arhgap21 na migração e adesão das células progenitoras hematopoéticas. Neste trabalho, mostramos que ainda não foi possível a obtenção do camundongo nocaute para Arhgap21, pois parece que morrem antes do nascimento. O estudo foi realizado com os camundongos Arhgap21+/-, cuja expressão gênica e protéica de Arhgap21 está reduzida. As células progenitoras hematopoéticas Arhgap21+/- apresentaram menor quimiotaxia induzida por CXCL-12 e redução da adesão à fibronectina, o que provavelmente levou a um homing ineficiente para a medula óssea e para o baço. Observou-se também que o microambiente da medula óssea e do baço com redução de Arhgap21 leva à ineficiência do homing das células progenitoras hematopoéticas normais. Não foi observada alteração na expressão gênica e na freqüência de células expressando CXCR-4, bem como não houve diferença na secreção de CXCL-12. As células da medula óssea Arhgap21+/- apresentaram maior expressão de Cdc42 e parecem possuir maior atividade desta RhoGTPase. Pela primeira vez se descreve o papel da Arhgap21 na hematopoese normal e ela parece ser um importante regulador da migração, adesão e homing das células progenitoras hematopoéticas, provavelmente pela regulação negativa de Cdc42, através da sua função GAP / Abstract: Migration and adhesion of hematopoietic progenitor cells are crucial events for their maintenance on bone marrow niches. The role and mechanisms underlying hematopoietic progenitors migration and adhesion has been extensively studied and RhoGTPases have been implicated in these events. Regulators and effectors of RhoGTPases functions also have been studied in biology of hematopoietic progenitor cells. ARHGAP21 is a RhoGAP member, which function as negative regulators of RhoGTPases, and plays role in cell migration and adhesion. The aim of this study was to investigate the role of Arhgap21 in migration and adhesion of hematopoietic progenitor cells. It was not possible to generate a knockout mouse until now, because they die before birth, as results indicate. Heterozygous mice (Arhgap21+/-)v have reduction in Arhgap21 gene and protein expression and we used it as model. Hematopoietic Progenitor cells from Arhgap21+/- mice showed reduction in CXCL-12- induced chemotaxis as well as in fibronectin adhesion, which probably leaded to inefficient homing to wild-type bone marrow and spleen observed. In addition, homing of wild-type hematopoietic progenitor cells to Arhgap21+/- bone marrow and spleen was also reduced. It was not observed differences in CXCR-4 gene expression and frequency of progenitor hematopoietic cells expressing this receptor as well as in CXCL-12 secretion in Arhgap21+/- bone marrow or serum. It is the first time that the role of Arhgap21 in hematopoiesis is described and it seems to be an important regulator of hematopoietic progenitor cell migration, adhesion and homing, probably due to Cdc42 negative regulation by its RhoGAP function / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutora em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Carla Beatriz Collares Buzato, Maria Tereza Cartaxo Muniz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Falcao_VivianeTannuriFerreiraLima_D.pdf: 4019842 bytes, checksum: b5e69f5076caaaff42a597448cba843c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As junções intercelulares (JIs) e suas proteínas estruturais estão envolvidas em vários processos celulares tais como adesão e comunicação celular, diferenciação, proliferação e homeostase celular em diversos órgãos. No pâncreas endócrino, JIs parecem estar envolvidas na regulação da citoarquitetura das ilhotas pancreáticas, bem como na biossíntese e secreção de insulina. O objetivo desta tese foi investigar o possível papel do contato intercelular mediado pelas junções intercelulares e suas proteínas estruturais na disfunção das células beta pancreáticas na patogênese do Diabetes mellitus tipo 2 (DMT2). Para tanto, investigamos a distribuição e expressão celular de proteínas juncionais (a saber, E-, N-, VE-caderinas, ZO-1, ?- e ? - cateninas) no pâncreas endócrino de camundongos C57BL/6/JUnib alimentados com uma dieta rica em gorduras (dHL) durante 8 meses. Inicialmente, foi feita uma caracterização metabólica dos animais e uma análise estrutural e morfométrica do pâncreas endócrino, já que estudos avaliando o efeito da administração de dHL por tempo prolongado são escassos. Os animais do grupo dHL (alimentados com ração contendo 21%g lipídios por 8 meses) tornaram-se obesos, mostrando importante aumento do ganho de peso (170%) em relação ao grupo controle (que receberam ração padrão com 4,5%g lipídios pelo mesmo período de tempo). Ainda, os camundongos obesos exibiram distúrbios metabólicos característicos e indicativos dos estágios iniciais do estabelecimento da DMT2, como resistência periférica a insulina, com um aumento (de 27,34%, p=0,0005) da área sob a curva de ITT, bem como marcada hiperglicemia em jejum (52%, p<0,0001) e hiperinsulinemia pós-prandial (88%, p=0,0058) em relação ao grupo Ct. Ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos alimentados com dHL mostraram uma deficiência significativa da secreção de insulina estimulada por glicose (p<0,05), associada a um aumento da expressão do gene da insulina (isoformas 1 e 2), analisado por qPCR. A histologia do pâncreas endócrino não revelou alterações marcantes na morfologia e citoarquitetura das ilhotas entre os grupos de animais. Entretanto, os animais dHL apresentaram um aumento significativo do volume relativo de células ? por pâncreas total (aumento de 57,1%, p<0,036) e da área relativa de células ? por ilhota em relação ao grupo controle (p<0,003), indicando uma expansão compensatória da massa de célula beta, associada com uma significativa diminuição (p<0,003) da área ocupada pelas células alfa em relação à área total da ilhota (30%, p<0,003). Com relação à distribuição celular das proteínas juncionais nas ilhotas pancreáticas, a N-caderina, E-caderina, ZO-1 e cateninas estão distribuídas na região de contato intercelular das células endócrinas pancreáticas, enquanto que a VE-caderina está limitada ao endotélio. Verificou-se, por imunoistoquímica, uma diminuição na marcação intercelular das células ? para N-caderina (p<0,0001), E-caderina (p<0,0001) e ?-catenina (p<0,0001) e um aumento na imunoreação para VE-caderina (p<0,004) nas ilhotas de camundongos diabéticos em relação ao grupo Ct. No caso particular da imunofluorescência para N-caderina, verificou-se um aumento na marcação difusa do interior das células ?, indicando uma redistribuição dessa proteína da região de contato intercelular para o citoplasma. Entretanto, não observamos diferenças significativas no grau do conteúdo celular dessas proteínas juncionais em homogeneizados de ilhotas isoladas entre os grupos experimentais, analisado por Western Blot. Conforme revelado por qPCR, um aumento na expressão gênica da VE- e N-caderinas, bem como de ZO-1, foi observado em ilhotas isoladas de camundongos diabéticos em comparação com os controles. Em conclusão, as proteínas juncionais estudadas são expressas por células endócrinas e endoteliais das ilhotas pancreáticas e, em particular, a distribuição/expressão de N-, E- e VE-caderinas, bem como ?-catenina nas ilhotas é significativamente alterada em camundongos obesos e diabéticos, o que pode ter repercussão no desenvolvimento da DMT2 / Abstract: Intercellular junctions (IJs) and their CAMs participate in important cellular processes such as adhesion, growth/death and signaling. In the endocrine pancreas, IJs play a role in regulating islet cytoarchitecture, insulin biosynthesis and secretion. In this PhD thesis, we investigate the islet histology and cellular distribution and content of CAMs (E-, N-, VE-cadherins, ZO-1, ?- and ?-catenins) in the endocrine pancreas of C57BL/6/JUnib mice fed a high fat (HF) diet for a prolonged time period (8 months). After HF diet exposure, mice became obese and displayed marked metabolic disturbances indicative of type 2 diabetes mellitus, such as marked peripheral insulin resistance and hyperglycemia, and moderate hyperinsulinemia. Isolated pancreatic islets of HF-fed mice showed a significant impairment of glucose-stimulated insulin secretion associated with an increase in insulin (isoforms 1 and 2) gene expression as revealed by qPCR. Histology of the endocrine pancreas revealed no marked changes in islet morphology and cytoarchitecture between animal groups, although HF-fed mice showed a 57% increase in the relative beta cell volume (per total pancreas) in comparison with controls. As shown by immunohistochemistry, ZO-1, E-, N-cadherin and catenins, were expressed at the intercellular contact site of endocrine cells while VE-cadherin was restricted to the islet vascular compartment. A cellular redistribution of N- and E-cadherin and ?-catenin (from the contact region to the cytoplasm in endocrine cells) and an increase in VE-cadherin islet content were seen in diabetic mice as compared to controls. No significant differences in islet immunoreaction for the other CAMs were observed between the animal groups. As revealed by qPCR, an increase in gene expression of VE- and N-cadherins as well as of ZO-1, not accompanied by significant changes in islet protein content, was observed in isolated islets of diabetic mice as compared to the controls. In conclusion, CAMs are expressed by endocrine and endothelial cells of pancreatic islets and, in particular, the islet distribution/content of N-, E- and VE-cadherins as well as ?-catenin are significantly altered in obese and diabetic mice / Doutorado / Biologia Celular / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa de Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiao_MunirRegini_M.pdf: 7191608 bytes, checksum: f8a5e81d9fd9e880ec841934fe773e2d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A participação de células produtoras de IL-17 (Th17) na resposta imunológica contra infecções causadas por fungos tem sido recentemente objeto de grande interesse. A principal função da IL-17 é a ativação e atração de neutrófilos para o local de infecção. Lesões de pacientes com paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais importante no Brasil, são caracterizadas por um infiltrado inflamatório rico em neutrófilos. Entretanto, neutrófilos de pacientes com PCM apresentam uma resposta fungicida diminuída, quando comparada à observada em indivíduos saudáveis. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do tratamento com IL-17 e IL-23 sobre a atividade fungicida, bem como sobre a capacidade migratória e inflamatória de neutrófilos. Neutrófilos de indivíduos saudáveis e de pacientes com a forma adulta multifocal da doença foram isolados e estimulados com citocinas recombinantes (rh-IL17 e/ou rh-IL23). Após o estímulo as células foram avaliadas quanto a expressão de receptores de quimiocinas (CXCR1 e CXCR2) e moléculas de adesão (CD54 e CD62L). Os neutrófilos também foram avaliados quanto a sua capacidade de adesão em Células Endoteliais Pulmonares Humanas (HLEC), sua resposta migratória a diferentes concentrações de CXCL8 e sua capacidade fungicida, e sobre a produção de H2O2, matriz metaloproteinase 9 (MMP-9) e citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-? e IL-1?). Os resultados demonstraram que células estimuladas com IL-17 e/ou IL-23 apresentaram uma expressão aumentada de receptores de quimiocina e moléculas de adesão, associadas com uma capacidade aumentada de adesão e migração. Além disso, observamos que neutrófilos estimulados com ambas as citocinas exibiram uma antifúngica diminuída relacionada com produção diminuída de H2O2, ao lado de uma produção aumentada de MMP-9, IL-6 e IL-1?. Os dados obtidos nos permitem concluir que citocinas relacionadas à resposta Th17 (IL-17 e IL-23) podem desempenhar um papel importante na contenção da infecção causada pelo P. brasiliensis, uma vez que predominam em sua forma mais branda e localizada, a forma adulta. Essas citocinas poderiam atuar de forma semelhante àquela observada em outras infecções fúngicas, induzindo uma resposta inflamatória local e ativando células do sistema imunológico inato. Apesar de sua importância, a produção crônica dessas citocinas, e sua atuação sobre os neutrófilos, podem induzir uma resposta inflamatória exacerbada que em última instância seria responsável pela destruição tecidual observada principalmente nas formas crônicas da doença / Abstract: The participation of IL-17 producing cells in the immune response to fungi has been recently described. The main function of IL-17 is the activation and attraction of neutrophils to infection sites. Lesions of patients with paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Brazil, are characterized by an inflammatory infiltrate rich in neutrophils, that shows an impaired fungicidal activity when compared to cells from healthy individuals. The aim of this study was to evaluate the effect of IL-17 and IL-23 on the fungicidal activity, as well as on the migratory and inflammatory ability of neutrophils. Neutrophils from healthy controls and patients with the multifocal adult form of PCM were isolated and stimulated with rhIL-17 and/or rhIL-23. Stimulated cells were evaluated for their expression of chemokine receptors (CXCR1 and CXCR2), and adhesion molecules (CD54 and CD62L), as well as, for their capacity of adhesion on Human Lung Endothelial Cells (HLEC) and for their migratory ability in response to CXCL8. We also evaluated the effect of these cytokines treatment on fungicidal activity and on the production of H2O2, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and inflammatory cytokines (IL-6, TNF-alpha and IL-1-beta). Neutrophils exposed to IL-17 and/or IL-23 increased their expression of CXCR1 and CXCR2 and adhesion molecules, which were associated with an increased adhesive and migratory capacity. Furthermore, the treatment of neutrophils with IL-17 and IL-23 had a suppressive effect on their fungicidal activity, characterized by a diminished production of H2O2, but increased their production of MMP-9 and inflammatory cytokines. These data indicate that Th17 related cytokines (IL-17 and IL-23) can participate in the initial resistance to the infection caused by P. brasiliensis, once they are predominant in the milder and localized form of the disease, the adult form. As in other fungal infections, IL-17 (and IL-23) can induce a local inflammatory response and the activation of innate immune cells. However, when chronically produced these cytokines can induce an exacerbated inflammatory response, mainly acting on neutrophils, which can be responsible for the tissue damage observed in the chronic form of the disease / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Maria Heloísa de Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - UniversidadeEstadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T04:42:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amarante_FernandaGambogiBraga_D.pdf: 4196475 bytes, checksum: 56f21492faf4255d8c10af9a3b41018c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Pacientes com a forma juvenil da paracoccidioidomicose (PCM) apresentam resposta imune celular deprimida, evidenciada por teste de hipersensibilidade do tipo tardio negativo e proliferação linfocitária deficiente a antígenos do fungo e pela produção de citocinas do tipo TH2 como IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-?. Além disso, um aspecto comum desta forma da doença é o número elevado de eosinófilos no sangue periférico, que retorna a valores normais após o tratamento antifúngico. O papel dos eosinófilos na PCM nunca foi investigado. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a capacidade funcional de eosinófilos de 15 pacientes com a forma juvenil da PCM. Para tanto eosinófilos isolados do sangue periférico de pacientes (antes e durante o tratamento antifúngico) e de doadores sadios (controles) foram avaliados quanto a: capacidade quimiotática em resposta ao RANTES, eotaxina e IL-5; capacidade de adesão a células endoteliais pulmonares; expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos (CD80, CD86, MHC de classe II, TLR-2 e TLR-4), de moléculas de adesão (CD11a, CD11b, CD49d e CD54), de receptores de IgE (CD23 e FC?RI?), marcadores de ativação (CD69) e do receptor CCR3; atividade fungicida direta contra leveduras de P. brasiliensis e expressão gênica de citocinas, quimiocinas e proteínas de grânulos. Também foi realizada a dosagem dos níveis séricos de constituintes dos grânulos citotóxicos (MBP, EPO, ECP e EDN) e das quimiocinas CCL5, eotaxina, CXCL9, CXCL10 em pacientes antes e durante o tratamento antifúngico e controles. Biópsias de linfonodos e fígados dos pacientes foram analisadas quanto a expressão de RANTES, eotaxina, MBP, IL-25 e IDO. Os resultados mostraram eosinofilia periférica em 86,7% dos casos, altos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis e concentração sérica elevada de proteína C reativa. A resposta quimiotática à eotaxina, a adesão a HLECs e a expressão do RNAm para IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 e CXCL8 foi maior nos eosinófilos de pacientes comparados aos controles. Eosinófilos de pacientes, assim como de controles, foram capazes de matar leveduras de P. brasiliensis. Maior frequência de eosinófilos CD69+ e TLR2+ e menor frequência de eosinófilos CD80+, MHC de classe II+, TLR-4+, CD23+ e CD11a+ foi observada em pacientes comparado aos controles. O acompanhamento dos pacientes durante o tratamento antifúngico mostrou a redução número de eosinófilos do sangue periférico, da concentração sérica de proteína C reativa, dos títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis, dos níveis séricos de proteínas citotóxicas e quimiocinas, além de aumento da capacidade migratória em resposta à eotaxina. Adicionalmente, eosinófilos de pacientes apresentam redução da expressão de receptores de reconhecimento e apresentação de antígenos, de ativação, de moléculas de adesão, do receptor de IgE CD23 e do receptor CCR3 durante o tratamento antifúngico. Nas lesões causadas pelo fungo em linfonodos e fígado foi detectada marcação positiva para MBP, eotaxina, RANTES, IL-25 e IDO. Em conclusão, o presente trabalho permitiu demonstrar que os eosinófilos dos pacientes com a forma juvenil da PCM encontram-se ativados (alta expressão do CD69) e poderiam estar contribuindo para a intensa resposta inflamatória que caracteriza a fase inicial da forma juvenil da PCM e prejudica a resposta de eliminação do fungo. Após o tratamento antifúngico, observou-se uma diminuição dos parâmetros analisados, exceto a capacidade quimiotática dos eosinófilos que aumentou devido, provavelmente, a redução de inibidores da quimiotaxia como o CXCL9 e CXCL10 / Abstract: Patients with juvenile form of paracoccidioidomycosis (PCM) have a depressed cellular immune response as shown by negative delayed-type hypersensitivity, suppressed lymphocyte proliferation to P. brasiliensis antigens, and production of TH2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-10 and TGF-?. Furthermore, a common feature of this disease is the large number of eosinophils in the peripheral blood that returns to normal values after antifungal treatment. The role of eosinophils in PCM has never been investigated. This study aimed to evaluate the phenotypic and functional characteristics of eosinophils of 15 patients with the juvenile form of PCM. Eosinophils of patients isolated from peripheral blood (before and during the antifungal treatment) and of healthy donors (controls) were evaluated for: chemotactic response to RANTES, eotaxin and IL-5; adhesion to human lung endothelial cells (HLECs); expression of antigen recognition and presentation molecules (CD80, CD86, MHC class II, TLR2 and TLR-4), adhesion molecules (CD11a, CD11b, CD49d and CD54), IgE receptors (CD23 and FC?RI?), activation marker (CD69) and CCR3; direct fungicidal activity against P. brasiliensis yeast cells and gene expression of cytokines, chemokines and protein granules. We also assessed serum levels of granules cytotoxic molecules (MBP, EPO, ECP and EDN) and chemokines (CCL5, eotaxin, CXCL9, CXCL10) in patients before and during the antifungal treatment and controls. Lymph nodes and liver biopsies of patients were stained for RANTES, eotaxin, MBP, IL-25 and IDO. The results showed peripheral eosinophilia in 86.7% of cases, high titers of antibodies to P. brasiliensis and high concentration of C-Reactive Protein. The chemotactic response to eotaxin, adhesion to HLECs and expression of mRNA for IL-1 ?, IL-2, IL-4, CCL5 and CXCL8 was higher in eosinophils of patients than in controls. Eosinophils of patients as well as of controls were able to kill P. brasiliensis yeast cells. A higher frequency of eosinophil CD69+ and TLR2+ and lower frequency of eosinophil CD80+, MHC class-II+, TLR-4+, CD23+ and CD11a+ was found in patients compared to controls. Patient's follow-up showed a reduction in the number of eosinophils in peripheral blood, serum concentration of C-Reactive protein, anti-P. brasiliensis antibodies, serum levels of cytotoxic proteins and chemokines, in addition to increased migration capacity. Moreover, eosinophils of patients exhibited reduced expression CD80, MHC class-II, TLR-4, CD23, CD11a, CD11b, CD23, CD69 and CCR3 during the antifungal treatment. Immunohistochemistry staining showed strong expression of MBP, eotaxin, RANTES, IL-25 and IDO in liver and lymph nodes biopsies from PCM patients. In conclusion, this study demonstrated that eosinophils are strongly activated (high CD69 expression) and could contribute to the intense inflammatory response that characterize the initial phase of juvenile form of PCM response and impairs the elimination of the fungus. After antifungal treatment, there was a decrease of all parameters except the chemotactic ability of eosinophils which increased, probably due to reduction of inhibitors of chemotaxis such as CXCL9 and CXCL10 / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Tomomasa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T18:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_CatiaMariaGeraldadosSantos_M.pdf: 1717590 bytes, checksum: 6c341cf3cd058cf34bc633755af508d8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Neste estudo foram analisadas oito isolados de Plesiomonas shigelloides, obtidos da bacterioteca do Laboratório de Fatores de Virulência em Bactérias, Instituto de Biologia -UNICAMP - Campinas/SP: sete isolados são provenientes de água doce do Rio Cambé na região de Londrina/PR e, um isolado de ATCC 14029. Os sobrenadantes de culturas de P. shigelloides foram capazes de induzir efeitos anticarcinogênicos in vitro (em células He-La e HEp-2), apesar de apresentarem efeitos citotóxicos em linhagens celulares não cancerígenas (em células CHO e Vero). A atividade hemolítica dos cultivos de P. shigelloides foi detectada em placas com ágar sangue (meio sólido) e em microplaca (meio líquido) contendo hemácias de carneiro. A atividade citotóxica e hemolítica de Plesiomonas shigelloides apresenta característica de termolabilidade. Os isolados de P. shigelloides aderiram em células HEp-2 e em superfícies inertes como o plástico (microplaca de poliestireno) e vidro (lamínula) e, ainda apresentaram a capacidade de formar biofilme in vitro, sendo possível a colonização e formação de biofilmes em células epiteliais e em dispositivos médicos implantáveis como cateteres, próteses e/ou sondas. A produção de exoenzimas hidrolíticas como lípase e proteases (caseinase e elastase) foi detectada nos isolados de P. shigelloides. No teste de sensibilidade antimicrobiana pelo método de difusão de discos, os isolados de P. shigelloides se mostraram sensíveis à maioria dos antibióticos utilizados. Entretanto, outros testes de sensibilidade antimicrobiana se tornam necessários de modo a assegurar uma terapia antibiótica eficiente em casos de confirmação de diagnóstico clínico microbiológico. Neste estudo, os isolados de P. shigelloides expressaram fatores de virulência in vitro como citotoxicidade, adesão, exoenzimas e resistência antimicrobiana que podem potencialmente estar envolvidos na sua patogenicidade, de modo especial às gastroenterites ou complicações extra-intestinais (septicemia) em indivíduos imunocomprometidos (HIV-soropositivo, câncer ou ainda doenças hepatobiliares) / Abstract: We analyzed eight isolates Plesiomonas shigelloides, obtained from the bacterial collection Laboratory of Virulence Factors in Bacteria, Biology Institute - UNICAMP - Campinas/SP: seven isolates are from freshwater in Cambé River, region of Londrina/PR and a isolate ATCC 14029. The culture supernatants P. shigelloides were able to induce anticarcinogenic effects in vitro (He-La and HEp-2 cells), although having cytotoxic effects on non-cancer cell lines (CHO and Vero cells). The hemolytic activity of cultures P. shigelloides was detected on blood agar plates (solid medium) and microplates (liquid medium) containing sheep erythrocytes. The hemolytic and cytotoxic activity P. shigelloides features characteristics of thermo ability. Isolates P. shigelloides joined in HEp-2 cells and inert surfaces such as plastic (polystyrene microplate) and glass (coverslips) and also had the ability to form biofilm in vitro, it being possible colonization and biofilm formation in epithelial cells and devices implantable medical devices such as catheters, implants and/or probes. The production of hydrolytic exoenzymes such as lipase and protease (caseinase and elastase) was detected in isolates P. shigelloides. In antimicrobial susceptibility testing by the disc diffusion method, isolates P. shigelloides were sensitive to most antibiotics. However, other antimicrobial susceptibility testing has become necessary to ensure efficient antibiotic therapy in cases of clinical diagnostic microbiological confirmation. In this study, isolates P. shigelloides expressed virulence factors in vitro as cytotoxicity, adhesion, exoenzymes and antimicrobial resistance that may potentially be involved in this pathogenicity, specially to gastroenteritis or extraintestinal complications (septicemia) in immunocompromised individuals (HIV-seropositive, cancer or diseases hepatobiliary) / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica