Abstract: It is well established that ionizing radiation induces a variety of damage in DNA by direct effects that are mediated by one-electron oxidation and indirect effects that are mediated by the reaction of water radiolysis products, e.g., hydroxyl radicals (•OH). In cellular DNA, direct and indirect effects appear to have about an equal effect toward DNA damage. We have shown that ϒ-(gamma) ray irradiation of aqueous solutions of DNA, during which •OH is the major damaging ROS can lead to the formation several lesions. On the other hand, the methylation and oxidative demethylation of cytosine in CpG dinucleotides plays a critical role in the gene regulation. The C5 position of cytosine in CG dinucleotides is frequently methylated by DNA methyl transferees (DNMTs) and constitutes 4-5% of the total cytosine. Here, my PhD research work focuses on the analysis of oxidative base modifications of model compounds of methylated and non methylated oligonucleotides, isolated DNA (calf-thymus DNA) and F98 cultured cell by gamma radiation. In addition, we identified a series of modifications of the 2-deoxyribose moiety of DNA arising from the exposure of isolated and cellular DNA to ionizing radiation. We also studied one electron oxidation of cellular DNA in cultured human HeLa cells initiated by intense nanosecond 266 nm laser pulse irradiation, which produces cross-links between guanine and thymine bases (G*-T*). To achieve these goals, we developed several methods based on mass spectrometry to analyze base modifications in isolated DNA and cellular DNA. / Résumé : Les radiations ionisantes induisent une variété de dommages à l'ADN selon des effets directs, correspondant à une oxydation suite à l’éjection d’un électron, et indirecte, médiés par une réaction avec les produits issus de la radiolyse de l’eau environnante, tels que les radicaux hydroxyles (•OH). Au sein d’une cellule, l’importance relative des effets directs et indirects semble être quantitativement similaire en ce qui concerne les dommages induits à l'ADN cellulaire. Nous avons démontré que l'irradiation par rayons Υ-(gamma) de solutions aqueuses d'ADN, dont l’action délétère est principalement véhiculé e par l’intermédiaire des radicaux hydroxyles, peut induire sur l’ADN la formation de toute une palette de modifications. D'autre part, la méthylation et la déméthylation oxydative de la cytosine au sein de couples de dinucléotides CpG jouent un rôle essentiel dans la régulation des gènes. La position C5 de cette cytosine se retrouve fréquemment méthylée par les méthyltransférases (DNMTs) et constitue alors 4-5% de l’ensemble de la cytosine présente au sein de l’ADN. Mon projet de recherche est centralisé autour de l'analyse de la modification des bases de l’ADN suite à leur oxydation dans des composés modèles constitués d'oligonucléotides méthylés et non-méthylés, puis dans l'ADN isolé (extrait de cellules de thymus de veau) et enfin au sein de cultures cellulaires F98 ayant subies une irradiation par rayons Υ-(gamma). De plus, nous avons identifié une série de modifications spécifiques au groupement fonctionnel 2-désoxyribose de l'ADN résultant de l'exposition de l'ADN isolé et cellulaire aux rayonnements ionisants. Nous avons également étudié les conséquences de l’irradiation par des impulsions lasers nanoseconde à 266 nm de cultures cellulaires de lignée humaine (HeLa). Responsable d’une réaction d’oxydation suite à l’éjection d’un électron, l’identification des modifications induites à l’ADN cellulaire suite à l’irradiation laser a permis de mettre en évidence des pontages ADN-ADN caractéristiques entre les bases guanine et thymine (G*-T*). Pour atteindre ces objectifs, nous avons développé plusieurs méthodes d’analyse des modifications de bases au sein de l’ADN isolé et de l'ADN cellulaire basées sur la spectroscopie de masse.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité de l'agent anticancéreux cisplatine en activant une voie apoptotique. La déficience de ce système de réparation est reliée in vivo à une chimiorésistance des cellules cancéreuses au cisplatine. Afin de définir le lien entre la cytotoxicité du cisplatine et le fonctionnement du système MMR, nous avons étudié l'interaction de la protéine MutS du système MMR bactérien avec un composé de lésion du cisplatine (formé lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux guanines platinées appartenant à l'adduit intrabrin d(GpG)). Mon travail a porté essentiellement sur i) une étude des propriétés biochimiques ATP-dépendantes de MutS en présence d'un composé de lésion du cisplatine ii) une étude d'interaction entre plusieurs composés de lésion du cisplatine et la protéine HMGB1 qui est bien connue comme pouvant inhiber l'accessibilité des lésions majoritaires du cisplatine à des protéines de réparation. Notre étude a été réalisée par des techniques de biologie moléculaire, de biochimie et de spectroscopie (résonance plasmonique de surface). Nous montrons qu'un composé de lésion du cisplatine module les propriétés ATP-dépendantes de MutS, un résultat inattendu étant qu'il inhibe le relargage de MutS de l'ADN. Un composé de lésion pourrait donc jouer un rôle dans la signalisation MMR-dépendante en modulant les stades précoces de l'initiation de la réparation ce qui est en accord avec le modèle dit « de signalisation directe MMRdépendante».

L'analyse et l'interprétation d''echantillons constitu'es de mélanges d'ADN de plusieurs individus est un défi majeur en science forensique. Lorsqu'un expert de la police scientifique a affaire à un mélange d'ADN il doit répondre à deux questions: d'abord, "combien de contributeurs y a-t-il dans ce mélange ?"et puis, "quels sont les génotypes des individus impliqués ?" Le typage seul de cet ADN ne permet pas toujours de r'epondre 'a ces questions. En effet leproblème est posé d'es lors que plus de deux allèles sont observées à un locus donné, plusieurscombinaisons génotypiques sont alors 'a envisager et il est impossible de déterminer avec certitudele nombre d'individus qui ont contribué au m'elange. De plus, la présence d'anomalies liées àl'analyse de marqueurs g'en'etiques, comme la contamination ou la perte d'all'eles ("drop-out"),peut davantage compliquer l'analyse.Les nombreux d'eveloppements statistiques d'edi'es 'a ces probl'ematiques n'ont pas eu le succ'esescompt'e dans la communaut'e forensique, essentiellement, parce que ces m'ethodes n'ont pas 'et'evalid'ees. Or sans cette validation, les experts de la police scientifique ne peuvent exploiter cesm'ethodes sur des m'elanges issus d'affaires en cours d'investigation.Avant d'ˆetre valid'ees, ces m'ethodes doivent passer par une rigoureuse 'etape d''evaluation.Cette derni'ere soul'eve deux questions: d'abord, la question de la m'ethodologie 'a adopter, puis,celle des outils 'a d'eployer. Dans cette th'ese, nous tentons de r'epondre aux deux questions.D'abord, nous menons des 'etudes d''evaluation sur des m'ethodes d'edi'ees 'a deux questions cl'es: i)l'estimation du nombre de contributeurs 'a un m'elange d'ADN et ii) l'estimation des probabilit'esde "drop-out". En second lieu, nous proposons un logiciel "open-source" qui offre un certainnombre de fonctionnalit'es permettant de faciliter l''evaluation de m'ethodes statistiques d'edi'eesaux m'elanges d'ADN.Cette thèse a pour but d'apporter une r'eponse concr'ete aux experts de la police scientifiqueen leur fournissant 'a la fois une d'emarche m'ethodologique pour l''evaluation de m'ethodes, et lapossibilit'e d'analyser la sensibilit'e de leurs r'esultats au travers d'un outil informatique en libreacc'es.

Au sein de la Sibérie Orientale, l'origine des Yakoutes reste une énigme qui demeure non résolue par les études classiques. Les Yakoutes représentent en effet le seul peuple d'éleveurs de bétail et de chevaux au sein d'un ensemble de populations composé de chasseurs et d'éleveurs de rennes. Leur langue, mélange de mots d'origine turque et mongole, ainsi que leurs pratiques culturelles accentuent encore ce contraste avec les populations alentour. <br />L'analyse moléculaire de spécimens yakoutes anciens apparaissait comme bien adaptée à l'étude de la formation de ce peuple. En effet, l'évolution récente des techniques de biologie moléculaire rend aujourd'hui possible l'analyse génétique des populations du passé et les conditions environnementales rencontrées en Sibérie Orientale sont particulièrement propices à la conservation des acides nucléiques. <br />L'étude de plus de 60 sujets anciens provenant de Yakoutie Centrale, a permis d'obtenir des résultats originaux concernant, d'une part, l'aspect moléculaire de ce travail et d'autre part, l'ethnogenèse yakoute. Ces résultats ont notamment permis de souligner la très grande qualité des échantillons provenant de Sibérie Orientale. Il a ainsi été possible d'étudier des marqueurs génétiques rarement analysables dans les études d'anthropologie moléculaire, comme les STR autosomaux et du chromosome Y, et d'obtenir des résultats uniques sur des substrats difficiles. Cet ensemble de facteurs a conduit à l'obtention de données dont l'authenticité est manifeste. En outre, le nombre important de sujets étudiés ainsi que la mise en parallèle de nouveaux protocoles sur plusieurs types de prélèvements ont permis d'apporter des informations sur les propriétés de ces différents substrats. <br />La comparaison des résultats collectés pour le chromosome Y et l'ADN mitochondrial des sujets anciens avec les populations voisines mais également du sud de la Sibérie, ont permis de dégager de nouvelles hypothèses concernant les origines des lignées paternelles et maternelles des Yakoutes. L'influence méridionale semble confirmée par notre étude, mais nos résultats mettent également en avant que des contacts anciens, précédant les migrations déjà proposées, ont du se produire entre les peuples nomades des steppes et les populations de Sibérie Orientale. De plus, la population yakoute apparaît extrêmement stable au cours des siècles malgré des changements notables dans les influences culturelles et l'arrivée des colons russes au XVIIIième siècle. Ainsi, certaines lignées masculines, spécifiques à la population yakoute, montrent une pérennité exceptionnelle puisqu'elles se sont maintenues depuis le XVième siècle jusqu'à nos jours, avec des fréquences très importantes.<br />La qualité des données obtenues ainsi que les conclusions qui ont pu être proposées suite à ce travail de recherche confirment à nouveau la pertinence de la mise en œuvre d'un approche moléculaire dans la compréhension de la formation et de l'organisation des populations du passé.

La microscopie à force atomique (AFM) ouvre de nouvelles perspectives dans l'étude des interactions ADN-protéines. Mon travail a consisté à développer de nouvelles méthodologies pour contrôler l'adsorption de l'ADN sur les surfaces et permettre l'étude en liquide de la dynamique des complexes. <br />Nous avons caractérisé les interactions entre l'ADN et la surface de mica. Nous proposons un modèle simple pour décrire les interactions électrostatiques en solution entre l'ADN et le mica, en considérant le rôle des cations monovalents et divalents. La bonne corrélation avec les données expérimentales permet de valider un référentiel de conditions et une méthode d'adsorption réversible de l'ADN sur mica prétraité nickel. Nous avons parallèlement développé un système de plots pour ancrer l'ADN par ses extrémités. <br />Le contrôle de ces méthodologies permet de caractériser l'accessibilité en fonction des états d'adsorption. Nous abordons cette problématique en caractérisant l'activité de la bléomycine sur l'ADN. Cette approche sur un système modèle permet de caractériser l'influence de la surface en termes d'accessibilité et d'activité. <br />La dernière partie de ce travail considère la caractérisation des interactions de la protéine Ku avec l'ADN dans le cadre de l'étude de la réparation des cassures double brin. Notre approche qui combine les apports de la microscopie électronique à transmission et de l'AFM met en évidence une polymérisation coopérative de Ku sur l'ADN double brin et un mode de fixation très différent sur l'ADN simple brin. Ce travail montre l'intérêt de l'imagerie moléculaire pour caractériser les mécanismes de recherche des sites cibles par les protéines.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biologie moléculaire et cellulaire : Lille 2 : 2008. / Résumé en français et en anglais. Titre provenant de l'écran-titre. ADN = Acide Désoxyribonucléique. Bibliogr. f. 184-202.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 18 sept. 2007). Bibliogr.

Th. : Göteborg : 1998. / Notes bibliogr.

Le dioxyde de titane (TiO2) compte parmi les nanoparticules (NP) les plus produites dans le monde. Ce constat soulève la question de sa toxicité, en particulier par inhalation, voie d'exposition la plus probable en milieu professionnel. Il a été montré précédemment in vitro que ces NP induisent des dommages à l'ADN et réduisent l'activité de réparation de l'ADN. L'objectif est ici d'étudier les mécanismes de toxicité sous-jacents à l'aide de cellules épithéliales alvéolaires humaines A549 exposées à 1-100 µg/mL de NP de TiO2 pendant 4-48 h. L'expression de 40 gènes et de 6 protéines de réparation de l'ADN a été étudiée par RT-qPCR et western-blot. L'impact des NP de TiO2 sur des régulateurs amont comme la méthylation des promoteurs de certains de ces gènes, l'activité du protéasome et la signalisation cellulaire par phosphorylation a également été investigué. De plus les profils de cyto-/géno-toxicité et d'expression des gènes de réparation de l'ADN ont été comparés avec ceux des cellules épithéliales bronchiques BEAS-2B. Les résultats montrent une répression globale des gènes et des protéines dans l'ensemble des voies de réparation de l'ADN. Cette répression pourrait être due en partie à la répression de régulateurs transcriptionnels et à l'augmentation de la méthylation de certains promoteurs et de l'activité caspase du protéasome. Les NP de TiO2 engendrent par ailleurs une perturbation du phosphoprotéome. Invisible à l'échelle du phosphoprotéome entier, celle-ci impacte de nombreuses protéines impliquées dans divers processus cellulaires, reflétant les effets toxiques connus de ces NP. On note en particulier un impact sur le cycle cellulaire, mais pas sur la prolifération, ainsi que la dérégulation du niveau de phosphorylation de quelques protéines liées à la réparation de l'ADN. Enfin on relève des profils de cyto-/géno-toxicité et d'expression des gènes de réparation de l'ADN similaires dans les cellules A549 et BEAS-2B, ce qui renforce la pertinence de ces modèles dans le cadre de l'étude de la génotoxicité des nanomatériaux. Dans l'ensemble, ces données apportent de nouvelles pistes d'explication des mécanismes de toxicité des NP de TiO2, qui pourraient notamment expliquer la chute précédemment observée des capacités cellulaires de réparation de l'ADN. / Titanium dioxide (TiO2) belongs to the top nanoparticles (NPs) most produced worldwide. This raises the question of their impact on human health, especially through inhalation, which is the main exposure route in occupational settings. It was previously shown in vitro that these NPs induce DNA damage and impair DNA repair activity. The aim here is to study the underlying toxicity mechanisms, in human A549 epithelial alveolar cells exposed to 1-100 µg/ml TiO2 NPs during 4-48 h. The expression of 40 genes and 6 proteins involved in DNA repair was investigated by RT-qPCR and western-blotting. The impact of TiO2 NPs on upstream regulators such as the methylation rate of some corresponding gene promoters, proteasome activity and cellular signaling through phosphorylation was assayed as well. Moreover cyto-/geno-toxicity and DNA repair gene expression patterns were compared with those of BEAS-2B bronchial epithelial cells. Results show a global down-regulation of genes and proteins in all DNA repair pathways. This could be partly explained by the down-regulation of transcriptional regulators and increased gene promoter methylation and caspase-like proteasome activity. TiO2 NPs also scramble the phosphoproteome. While invisible on a global scale, this dysregulation affects numerous proteins involved in diverse cellular processes, which reflect the toxicity pathways reported for these NPs. Although cell proliferation is unaffected, a significant impact is observed on cell cycle, as well as on a few proteins involved in DNA repair. Finally cyto-/geno-toxicity and DNA repair gene expression profiles are similar in both A549 and BEAS-2B cells, thereby strengthening the relevance of using any of these cell lines in nanomaterial genotoxicity studies. On the whole these data bring novel insights into TiO2-NP toxicity mechanisms, which could especially explain the previously observed impairment of DNA repair activity.