La phylogénie moléculaire reconstruit des relations de parenté entre unités évolutives, en se basant sur des changements structurels au niveau moléculaire (ADN, protéines). Elle constitue donc un outil précieux pour déchiffrer l'évolution spatio-temporelle de la biodiversité. Le présent travail examine l'histoire évolutive d'un groupe de criquets (Insecta: Orthoptera: Caelifera), par le biais de méthodes phylogénétiques (parcimonie, maximum de vraisemblance et bayésienne) et de datation, appliquées à l'étude de séquences d'ADN nucléaire et mitochondrial combinées. Dans un premier temps, nous étudions la sous-famille Melanoplinae (Orthoptera: Acrididae) et l'une de ses tribus, Podismini, pour éclaircir leur histoire évolutive, la resituer dans un contexte paléobiogéographique, et la mettre en relation avec la taxonomie existante. Dans un deuxième temps, les méthodes de reconstruction phylogénétiques et de datation sont appliquées à l'étude de la dynamique de l'évolution concertée au sein de l'espèce Podisma pedestris, en analysant le polymorphisme intra- et interindividuels de l'ADN ribosomal, i.e. gènes et pseudogènes d'ITS1.

Dans ce travail, nous proposons un nouvel appareillage, destiné à aider à la détermination du mécanisme de certaines protéines. Cet outil, qui combine un appareil de pinces magnétiques, et un microscope de fluorescence en ondes évanescentes, a été conçu pour permettre à la fois la manipulation mécanique et l'observation de l'activité d'ADN translocases à l'échelle de la molécule unique. Nous présentons d'abord ici la conception, la réalisation et l'expérimentation de ce montage. Nous montrons que, d'une part, il se compare favorablement à ses composants séparés (pinces magnétiques et microscope de fluorescence), et que d'autre part leur réunion dans un appareil unique permet d'obtenir des résultats d'un type nouveau. Nous avons orienté l'étude des ADN translocases avec cet appareil sur l'exemple de deux protéines : le moteur FtsK de Escherichia coli et l'ARN Polymérase de T7. Nous détaillons dans cette étude les questions importantes encore en suspens concernant le mécanisme et présentons les expériences que nous avons envisagées pour y répondre. Nous relatons ensuite également la difficulté que nous avons rencontrée à obtenir des substrats protéiques adaptés aux expériences que nous avons envisagées, et les solutions que nous avons mises en oeuvre pour y remédier. Enn, nous analysons les résultats obtenus dans des expériences en volume ou en pinces magnétiques seules, qui ont permis de mettre en valeur de nouveaux comportements et de préparer la réalisation de nouvelles expériences sur notre montage combiné.

Chez Arabidopsis thaliana, Les gènes d'ARN 5S sont regroupés en blocs situés dans l'hétérochromatine péricentromérique des chromosomes 3,4 et 5. La transcription des gènes d'ARN 5S est régulée par des facteurs épigénétiques altérant notamment leur structure chromatinienne. Une étude a été menée durant les premières étapes du développement post-germinatif pour identifier les évènements et des facteurs conduisant à l'élaboration de telles structures. Nous avons pu observer une décompaction de l'ADNr 5S immédiatement suivie d'une recondensation. Ces phénomènes impliquent respectivement ROS 1 et l'ARN polymérase IV. L'étude des formes Pol IVa et Pol IVb nous indique que Pol IVb, en plus de son activité partenaire de Pol IVa, possède une action spécifique dédiée au locus d'ADNr 5S du chromosome 4. Cette nouvelle activité de Pol IVb, qui est indispensable au silencing et à la compaction de ce locus, semble indépendante de la voie classique de méthylation de l'ADN dépendante des ARN.

Les dommages engendrés par l'exposition au cadmium (Cd) proviennent non seulement de l'inactivation de diverses molécules antioxydantes mais aussi de l'interférence du métal avec d'autres systèmes impliqués dans la régulation de l'homéostasie redox et de l'homéostasie de métaux essentiels comme le zinc (Zn) et le cuivre (Cu). Afin de mieux comprendre l'implication du stress oxydant dans les mécanismes de toxicité induits par ces métaux de transition, nous avons analysé leur impact sur la balance antioxydante (biomarqueurs de stress oxydant, activités des principales enzymes antioxydantes, synthèse d'autres facteurs antioxydants comme les métallothionéines, le glutathion intracellulaire) de deux lignées cellulaires ; une lignée cellulaire dérivée de kératinocytes humains et immortalisée par mutation du gène p53 (HaCaT); ainsi qu'une lignée issue du glioblastome de rat (C6). Nos résultats sont en faveur d'un effet globalement pro-oxydant. Ils montrent que les 3 métaux affectent le statut redox des cellules. Ceci est révélé par une augmentation du taux de glutathion oxydé (GSSG), du taux de MDA, des lésions de l'ADN, et une décroissance non seulement du taux des thiols protéiques (SH), de glutathion (GSH) mais aussi des activités glutathion peroxydase (GPx), catalase (CAT), glutathion réductase (GRase) et des superoxydes dismutases (SODs). L'impact des métaux sur les activités des enzymes antioxydantes s'accompagne d'une augmentation de la quantité de radicaux libres comme le radicale hydroxyle qui peut initier la peroxydation lipidique, ainsi que l'oxydation des protéines, du GSH et de l'ADN.<br /><br />Contrairement aux autres métaux, le Cd présente une toxicité relativement faible dans les cellules HaCaT pour des concentrations inférieures ou égales à 50 µM. Cette résistance s'explique principalement par la présence des métallothionéines (MTs) à l'état basal d'une part et par une synthèse induite par le Cd du GSH et des MTs d'autre part. L'induction des MTs par le Cd, le Cu ou le Zn et leur redistribution nucléaire fait de ces protéines un acteur prépondérant dans la protection du génome contre les dommages oxydatifs. L'expression des MTs est régulée non seulement par une synthèse induite par les métaux mais aussi par le GSH et la protéine p53 dont la mutation a un impact sur le taux intracellulaire de MTs et sur la résistance des HaCaT au Cd.<br /><br /> Ces études indiquent que le déséquilibre entre l'inhibition des activités antioxydantes et la synthèse des facteurs comme le GSH et les MTs est très impliqué dans la toxicité des métaux. C'est ce déséquilibre qui est à l'origine de l'augmentation du stress oxydant et qui explique la sensibilité et la forte mortalité des cellules C6 induite par le Cd. En effet dans ces cellules, les activités des enzymes antioxydantes et les taux de GSH et de MTs diminuent dès 20 µM. Cette diminution s'accompagne d'une mort cellulaire accrue. La mort cellulaire obtenue après incubation avec le Cd, le Cu ou le Zn est dose-dépendante et très différente entre les lignées C6 et HaCaT. En effet, les cellules HaCaT en présence de Cd ou de Cu présentent une mort non apoptotique alors que les cellules C6, incubées avec le Cd, meurent par une voie apoptotique p53-dépendante.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'esturgeon européen Acipenser sturio (Linnaeus, 1758) était un poisson commun de nos fleuves jusqu'au début du 20e siècle. Toutes ses populations sont maintenant éteintes sauf une qui survit dans le bassin Gironde-Garonne-Dordogne en France. Les données disponibles sur l'espèce restent très partielles car elles proviennent quasi exclusivement de cette population relictuelle. Au cours de cette thèse, plus d'une centaine d'échantillons anciens d'esturgeons restes archéologiques ou spécimens naturalisés conservés dans les muséums d'histoire naturelle ont été analysé grâce aux méthodes de la paléogénétique. Ces analyses génétiques ont été réalisées sur l'ADN mitochondrial (surtout la Dloop) ainsi que sur cinq loci microsatellites qu'il a été nécessaire d'adapter aux méthodes d'étude de l'ADN ancien. Les données paléogénétiques obtenues ont permis d'étudier : 1) les relations de l'esturgeon européen avec les autres espèces d'esturgeons vivant ou ayant vécu en Europe, en particulier l'esturgeon de l'Adriatique A. naccarii et l'esturgeon atlantique A. oxyrinchus. 2) la diversité génétique de l'esturgeon européen sur l'ensemble de son ancienne aire de répartition. 3) la diversité génétique d'une population d'esturgeon européen au cours du temps la population du Rhône, d'une période où elle était florissante jusqu'à son extinction. L'ensemble de ces données ont été discuté à la lumière de la conservation de l'espèce, qui est aujourd'hui en danger critique d'extinction. / The European sturgeon Acipenser sturio (Linnaeus, 1758) was a common fish of our rivers until the beginning of the 20th century. All populations are now extinct except one which survives in the Gironde-Garonne-Dordogne basin in France. Data available on this species are only partial because they only stem from this relictual population. During this thesis, more than one hundred ancient sturgeon samples archaeological remains or naturalized museum specimens were analysed by paleogenetics means. These genetics anlyses were carried out on mitochondrial DNA (mainly the Dloop) and five microsatellites loci which were adapted to ancient DNA methodologies. Paleogenetics data that we obtained were used to study : 1) A. sturio interactions with other sturgeon species which live or lived in Europe, especially the Adriatic sturgeon A. naccarii and the atlantic sturgeon A. oxyrinchus. 2) the genetic diversity of A. sturio all over its former geographical range. 3) genetic diversity of a population of the European sturgeon through time the Rhone River population from a period it was flourishing until its extinction. All these data were considered in the light of the species conservation, since A. sturio is now critically endangered.

L’objectif de cette thèse a été d’enrichir nos connaissances sur les bactériesintracellulaires strictes et spécialement Coxiella burnetii, agent responsable de la fièvre Q.Pour ce faire, nous avons d’une part amélioré les techniques de préparation de l’ARN pourles études transcriptionnelles et d’autre part utilisé la technologie des puces à ADN pouranalyser le transcriptome ainsi que la diversité génomique de C. burnetii.L’utilisation d’échantillons cliniques dans les études transcriptionnelles est limitéepar la quantité de matériel disponible qui ne permet pas d’analyser simultanément les profilsdu pathogène et de son hôte au cours de l’infection. De ce fait, nous avons développé, sur unmodèle d’escarres obtenus à partir de malades de fièvre boutonneuse méditerranéenne, unestratégie basée sur l’hybridation soustractive pour séparer les ARN eucaryotes etprocaryotes dans le but d’entreprendre des hybridations de puces à ADN.C. burnetii est une bactérie hautement résistante aux stress environnementaux commele changement de pH, la dessiccation, mais aussi le changement de température. Nous avonsparticulièrement étudié la réponse précoce de C. burnetii lors d’une exposition à une hauteet faible température. L’analyse globale du profil transcriptionnel a montré que la réponsede C. burnetii était limitée et similaire pour les différents stress appliqués. Cependant,malgré cette faible réponse, il apparait clairement qu’une accumulation de ppGpp, un arrêtde la croissance et des modifications de la membrane et de la paroi cellulaire permettraient àC. burnetii de résister à ces stress. Toutes ces régulations géniques convergent vers unchangement d’état de la bactérie vers une forme pseudo-sporulée. De plus, nous avonsobservé une organisation spatiale des gènes différentiellement exprimés. Nos analyses bioinformatiquesont montré que ces clusters de régulation ne répondaient ni au paradigmepromoteur - facteur de transcription – opéron, ni à des réseaux biologiques. Ayant retrouvéce phénomène dans plusieurs autres études transcriptionnelles chez d’autres bactériesintracellulaires, nous spéculons que ces clusters de régulations pourraient être dus à unerégulation épigénétique qu’il reste à caractériser.Différentes méthodes de typage ont déjà été mises au point pour classer les isolats deC. burnetii dans le but d'explorer son pouvoir pathogène. Ici, nous présentons une méthodede génomotypage basée sur la présence ou l'absence de gènes à l'aide de puces à ADN.Nous avons testé notre stratégie de génomotypage sur 52 isolats provenant de différenteszones géographiques, de différents hôtes et de patients présentant différentes manifestationscliniques. L'analyse a révélé la présence de 10 génomotypes organisés en 3 groupes avecune topologie congruente à celle observée avec le Multi Spacer Typing. Nous avons aussidécouvert 4 génomotypes particulièrement associés à la fièvre Q aiguë, alors que tous lesgénomotypes étaient associés à la forme chronique. De plus, le génomotypage a révélé queles isolats retrouvés dans les tiques dures, y compris la souche de référence Nine Mileappartiennent au même genomotype.Globalement, les données que nous avons obtenues confirment le fait que les puces àADN sont un outil adapté pour l’analyse de la pathogénicité de C .burnetti mais aussi desautres bactéries intracellulaires strictes. Cependant, de nouvelles technologies plusrésolutives comme le DNA ou RNAseq semblent être plus prometteuses mais restent encoreà optimiser / The objective of this thesis was to increase knowledge of obligate intracellular bacteriaand specifically, the causative agent of Q fever C. burnetii. In this regard, we have improvedstrategies to purify RNA for the transcriptional studies. We also used the technologymicroarrays to analyze the transcriptome and genomic diversity of C. burnetii.The use of clinical samples in the transcriptional studies is limited by the amount ofmaterial available and thus the transcriptional profiles of the pathogen and its host duringinfection can not be simultaneously analyze. We developed, with a model of eschars obtainedfrom Mediterranean spotted fever patients, a strategy based on subtractive hybridization toseparate RNA eukaryotic and prokaryotic cells in order to perform microarray experiments.Analysis of the survival strategies used by this bacterium to adapt to new environmentalconditions is critical for our understanding of C. burnetii pathogenicity. Here, we report theearly transcriptional response of C. burnetii under temperature stresses. Our data show thatC. burnetii exhibited minor changes in gene regulation under short exposure to heat or coldshock. While small differences were observed, C. burnetii seemed to respond similarly to coldand heat shock. The expression profiles obtained using microarrays produced in-house wereconfirmed by quantitative RT-PCR. Under temperature stresses, 190 genes were differentiallyexpressed in at least one condition, with a fold change of up to 4. Globally, the differentiallyexpressed genes in C. burnetii were associated with bacterial division, (p)ppGpp synthesis,wall and membrane biogenesis and, especially, lipopolysaccharide and peptidoglycansynthesis. These findings could be associated with growth arrest and witnessed transformationof the bacteria to a spore-like form. Unexpectedly, clusters of neighboring genes weredifferentially expressed. These clusters do not belong to operons or genetic networks; theyhave no evident associated functions and are not under the control of the same promoters. Wealso found undescribed but comparable clusters of regulation in previously reportedtranscriptomic analyses of intracellular bacteria, including Rickettsia sp. and Listeriamonocytogenes. The transcriptomic patterns of C. burnetii observed under temperature stressespermits the recognition of unpredicted clusters of regulation for which the trigger mechanismremains unidentified but which may be the result of a new mechanism of epigenetic regulation.Different typing methods have been previously developed to classify C. burnetii isolatesin order to explore its pathogenicity. Here, we report a comprehensive genomotyping methodbased on presence or absence of genes using microarray. The genomotyping method was thentested on 52 isolates obtained from different geographic areas, different hosts and isolated frompatient with different clinical manifestations. The analysis reveals the presence of10 genomotypes organized in 3 groups with a topology congruent with that of Multi SpacerTyping. We also found out 4 genomotypes especially associated with acute Q fever whereas allthe genomotypes could be associated to chronic human infection. Serendipity, genomotypingreveals that hard ticks isolates including Nine Mile belong to the same genomotype.Overall, the data we obtained confirm that DNA microarrays are a suitable tool forexploring pathogenicity of C. Burnetti and other obligate intracellular bacteria. However newtechnologies such as DNAseq or RNAseq seem more promising but still need to optimize andalso are still expensive compared to microarray.

La papa (Solanum spp.) tiene una gran importancia alimenticia y es de gran utilidad en el mejoramiento genético, esta representado por 8 especies cultivadas y alrededor de 200 especies silvestres con gran diversidad de caracteres. El “Proyecto de Conservación In Situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres” se viene desarrollando como respuesta a la amenaza latente de perdida de la diversidad genética y busca fortalecer la conservación de las especies nativas más importantes en las chacras de los campesinos. Una de las primeras acciones ha sido inventariar y caracterizar la diversidad y variabilidad de los cultivos priorizados. Para el caso de la papa, los inventarios y el uso de marcadores morfológicos han demostrado un alto grado de diversidad genética mantenida por los agricultores andinos, sin embargo, debido a que estas características morfológicas son afectadas por el ambiente se hace necesario corroborar los resultados obtenidos mediante otras técnicas que no se encuentren bajo la presión ambiental. Por tal motivo, se decidió analizar el grado de diversidad genética presentada en una muestra aleatoria de 79 variedades nominales de papa nativa (Solanum spp.) procedente de cinco zonas del Perú (Ayacucho, Cajamarca, Cuzco, Huancavelica y Puno) cultivadas en las chacras de los agricultores que forman parte del Proyecto de “Conservación In situ de los cultivos nativos y sus parientes silvestres”, mediante el uso de 18 marcadores moleculares microsatélites-SSR Los microsatélites son secuencia cortas de di, tri o tetranucleótidos que están distribuidas en tandem a lo largo del genoma, siguen una herencia mendeliana, no son afectados por factores ambientales, son de carácter codominante y tienen un alta tasa polimórfica. Las secuencias son detectadas mediante PCR con el uso de iniciadores específicos, separación en geles de poliacrilamida y tinción con plata. Los análisis de agrupamiento, riqueza alélica y análisis de diversidad genética realizados a partir de los datos obtenidos de 19 locus microsatélites registrados, demostraron el alto grado de diversidad genética que presenta la muestra colectada y corrobora los resultados obtenidos en el proyecto In situ. Además la comparación de la riqueza alélica mantenida por cada región de colecta hace presumir que existe un flujo génico constante entre estos lugares.

Un set de 18 marcadores microsatélite (SSR, del inglés “simple sequence repeat”, repetición de secuencia simple) identificados en Solanum tuberosum (papa cultivada) y que cubren sus 12 cromosomas fue desarrollado previamente para genotipificar el germoplasma de la papa cultivada. Hemos evaluado su utilidad a diferentes distancias filogenéticas de su especie originaria, la papa cultivada S. tuberosum, en una muestra de 50 especies de papa silvestre y otras 2 especies del mismo género. Los marcadores SSR produjeron amplicones en 27% a 100% de las 52 especies, dependiendo del marcador. Se comprobó mediante secuenciación de una muestra de amplicones que los motivos repetitivos estuvieron presentes en la mayoría de los fragmentos secuenciados. Además, se observó un alto grado de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, del inglés “single nucleotide polymorphism”, polimorfismo de un solo nucleótido) e inserciones / supresiones (indel, del inglés insertion / deletion) entre los motivos repetitivos y la secuencia de los iniciadores (primers). Estos resultados indican, en primer lugar, que los 18 loci microsatélites producen amplicones en loci homólogos. En segundo lugar el alto grado de polimorfismo fuera del motivo repetitivo indica que existe un considerable grado de homoplasia que reducirá extensamente la utilidad del set de SSR para papa cultivada en estudios filogenéticos en especies de papa silvestre distanciadas de la base de germoplasma de la papa cultivada. A pesar de esto, el análisis de distancia genética usando el índice de similitud de Jaccard y el método de agrupamiento Neighbor Joining, produjo dendrogramas que coinciden con hipótesis de relaciones cladísticas basadas en recientes filogenias moleculares, pero no así con relaciones anteriores basadas en series. / --- A kit of 18 microsatellite markers, also referred to as simple sequence repeats (SSR), covering all 12 chromosomes of the potato was previously developed for genotyping the cultivated potato. We have assessed its utility on a sample of 50 wild potato species and 2 other species of the same genus at varying phylogenetic distances from its source, the cultivated potato Solanum tuberosum. The SSR markers produced amplicons in 27% to 100% of the 52 species. A sample of them was sequenced. Although repeat motifs were present in most of the amplicons sequenced, a high degree of single nucleotide polymorphism (SNP) and insertion / deletion events (indel) was observed between the repeat motifs and the primer sequence. These results indicate that: firstly, the 18 microsatellite loci produce amplicons in homologous loci; and secondly, homoplasy will be relatively frequent and hence reduce largely the utility of the cultivated potato SSR kit for phylogenetic studies in wild potato species distant from the cultivated potato germplasm base. Despite this, genetic distance analyses using Jaccard similarity index and Neighbor Joining clustering method produced trees roughly matching hypotheses of cladistic relationships based on recent molecular phylogenies, but not on prior series relationships.