Made available in DSpace on 2016-08-29T15:35:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8659_Enia Vieira Lima.pdf: 11221892 bytes, checksum: de16b9dfe4e6936c100d6629fd872114 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, pois se tornou um estigma de mortalidade e dor. Em pesquisa realizada pela Organização Mundial de Saúde (WHO), estatisticamente, o câncer é a segunda causa de óbitos no mundo com 13%, matando cerca de 6,0 milhões de pessoas por ano. Acredita-se que em 2015 o câncer seja responsável por 9 milhões de mortes no mundo. Os avanços averiguados nas últimas décadas, na área da quimioterapia antineoplásica, têm facilitado admiravelmente a aplicação de outros tipos de tratamento de câncer e permitido maior número de curas. Todavia, muitos tipos de câncer são intrinsecamente resistentes a quimioterápicos, enquanto outros inicialmente respondem ao tratamento, mas adquirem resistência aos fármacos. A resistência múltipla ao fármaco (MDR), o quadro mais grave, advém quando culturas de células in vitro e in vivo mostram resistência simultânea a diferentes fármacos. Assim, apesar do grande número de compostos que compõem o arsenal quimioterápico de combate ao câncer, o problema de resistência requer a busca constante por novos fármacos eficazes no combate ao câncer. Assim, dando continuidade a incessante busca por novos compostos protótipos com atividade antineoplásica que vem sendo desenvolvido em nosso laboratório, o presente projeto de natureza interdisciplinar visa à síntese dos novos análogos acíclicos e cíclicos da metformina com potencial atividade anticâncer de modo a atuarem por vias celulares múltiplas com a finalidade de se evitar a aquisição de fenótipo resistente à quimioterapia pelas células tumorais. Estes compostos foram racionalmente desenhados por estudos prévios de ancoragem molecular para atuarem nas proteínas ERK, PI3K, AMPK, BRAF e na depleção de ATP pela inibição do complexo I da cadeia respiratória, que são alvos terapêuticos importantes para inibir a proliferação celular das células tumorais. Neste trabalho foram sintetizados quinze adutos de Mannich com rendimentos que variaram de 51 a 85% contendo grupos oxigenados, nitrogenados e sulfurados. Em seguida, foram realizadas algumas reações com o intuito de sintetizar a diidropirimidinona (DHPM), análogo cíclico da metformina, a fim de avaliar a correlação entre a restrição conformacional destes compostos e a atividade antineoplásica, porém, não foi obtido nenhum sucesso nessa reação. Os quinze adutos de Mannich sintetizados tiveram as suas citotoxidades avaliadas nas linhagens de câncerhumanode pulmão (H460 e A549), mama (MDA-MB-231 e MCF-7) e ovário (A2780 e ES2). Efetuou-se também estudos de docking desses compostos com os alvos terapêuticos PI3K, ERK2, AMPK e BRAF.

Foram preparados adutos de tetracloreto de titânio com ligantes orgânicos monodentados do tipo TiC14.2L, onde L = CH3CN, CD3CN, C2H5CN, C2H3CN, C6H5CN, C5H5N, C5D5N, (CH3)2S e (C2H5)2S. Foram feitas as previsões espectrais, pela aplicação da teoria de grupo, para o esqueleto do aduto TiCl4.2L, tendo em vista as três possíveis configurações: D4h, D2d e C2v. Os espectros vibracionais foram obtidos em estado sólido, sendo que para os adutos TiC14.2CH3CN e TiC14.2C2H5CN também o foram em solução, usando como solventes os respectivos ligantes. Os espectros Raman de todos os compostos e os espectros infravermelho dos adutos com os ligantes: acetonitrila deuterada, piridina deuterada e dietilssulfeto, são originais. Para maior facilidade na discussão e interpretação dos espectros os adutos foram agrupados em três conjuntos, caracterizados pela semelhança dos espectros vibracionais, especialmente, Raman. O primeiro conjunto compreende os adutos com nitrilas, o segundo os com piridina e o terceiro os com sulfetos. A análise dos espectros sugere que: a) Os compostos de adição do primeiro conjunto pertencem à configuração cis-octaédrica, grupo pontual C2v. b) O esqueleto dos adutos do segundo conjunto possuem configuração trans-octaédrica, simetria D4h. Para os complexos do terceiro conjunto não foi possível concluir, com base nos espectros vibracionais, a configuração do esqueleto. Foi feita uma tentativa de atribuição das frequências dos esqueletos para os adutos do primeiro e do segundo conjunto, com a utilização de vários argumentos empíricos. São discutidos alguns deslocamentos de frequências do ligante devido à coordenação. A análise em coordenadas normais, usando o campo de força de Urey-Bradley com duas interações, para os adutos de tetracloreto de titânio com acetonitrila e acetonitrila deuterada, confirma a atribuição feita. / Abstract not available.

É verificado que materiais nano/micro estruturado, com morfologia definida possui propriedades melhoradas em relação às formas macro. Essa constatação justifica o crescente número de rotas diferentes para se sintetizar polianilina numa ampla gama de morfologias diferentes e tamanhos definidos, através de variações na síntese padrão de polianilina. Utilizando uma dessas rotas que leva a produto com morfologia esférica, em estudo anterior do nosso grupo foi mostrado que o produto principal é adutos de anilinas constituídos por adutos tipo 1,4-Michael entre anilina e benzoquinona monoimina e segmentos fenazínicos substituídos. Neste trabalho foram feitas modificações nesse protocolo de síntese e os produtos foram caracterizados tanto morfologicamente como estruturalmente. A morfologia dos produtos foi determinada por microscopia eletrônica de varredura enquanto que as técnicas UV-VIS, Raman, IR e Fluorescência forneceram a estrutura dos produtos. A oxidação de anilina por persulfato de amônio sob sete diferentes condições experimentais foram realizadas mantendo o pH da solução reacional constante em 3 ou 4.5. Os produtos das condições experimentais realizadas apresentaram morfologias tipo esféricas (microesferas lisas ou porosas, e microesferas Tipo-Folha) e foram caracterizados como adutos de anilina constituídos por adutos tipo 1,4-Michael e segmentos fenazínicos não substituídos como produto majoritário de síntese. O grau de hidrólise dos nitrogênios imínicos mostrou dependência com o pH de síntese e concentrações dos reagentes. Os resultados sugeriram que o grau hidrólise dos nitrogênios imínicos é um fator importante na determinação de estruturas esféricas, assim como as concentrações dos reagentes, uma vez que estes aspectos podem influenciar na capacidade de interação entre os adutos de anilina que resulta na formação destas estruturas. A verificação de segmentos fenazínicos não substituídos (diferente do verificado no estudo anterior) na constituição dos adutos de anilina chama a atenção para a importância de caracterizar estes segmentos pela técnica de espectroscopia de Fluorescência nos trabalhos anteriores do grupo. A formação de produto de polimerização cabeça-cauda (PANI-ES) foi verificada na condição experimental realizada em pH 4,5 mais concentrada e nas condições experimentais realizadas em pH 3, exceto na condição mais diluída, corroborando a afirmação de que, além do pH reacional, a concentração absoluta dos reagentes influi na determinação do produto final / It is known that nano/micro structured materials with defined morphology has improved properties when compared to bulk forms. This finding justifies the increasing number of different routes to synthesize polyaniline in a wide range of different morphologies and sizes defined by variations in the standard synthesis of polyaniline. Using one of these routes that leads to product with spherical morphology, in a previous study from our group it was shown that the main product is aniline adducts formed by 1,4-Michael type adducts between aniline and benzoquinone monoimine and substituted phenazine segments. In this work, changes were made in this synthesis protocol and the products were characterized both morphologically and structurally. The morphology of the products was determined by scanning electron microscopy while the UV-VIS, Raman, IR and Fluorescence techniques provided the structure of the products. The oxidation of aniline with ammonium persulfate in seven different experimental conditions were carried out maintaining the pH of the reaction solution constant at 3 or 4.5. The products of the experimental conditions showed spherical-type morphologies (smooth or porous microspheres, and flower-like microspheres) and were characterized as aniline adducts formed by 1,4-Michael type adducts and non-substituted phenazine segments as the major synthesis product. The degree of hydrolysis of the imines nitrogen showed dependence on the pH of synthesis and concentration of reactants. The results suggested that the degree of hydrolysis of the imines nitrogen is an important factor in determining spherical structures, as well as the concentrations of reactants, once that these parameters can influence in the interaction ability between the adducts of aniline which results in the formation of such structures. The verification of non-substituted phenazine segments (different from that in the previous study) in the constitution of aniline adducts showed the importance of the use of fluorescence spectroscopy technique in the characterization of these segments. The head-to-tail polymerization of aniline (PANI-ES) was observed in the experimental condition performed at pH 4.5 with high concentration of reagents and on the experimental conditions at pH 3, except in the diluted reagent solution. These results show the role of the absolute concentration of reagents in the nature of the final product

O antantreno é um hidrocarboneto hexacíclico aromático (HPA) bastante difundido no meio ambiente e que não apresenta as regiões de baía ou fjord, que em geral, conferem alta reatividade a esses compostos após oxidação. Entretanto, sua mutagenicidade em bactérias após ativação metabólica é comparável à do Benzopireno (BP) e, com base na sensibilidade das linhagens de S. typhimurium utilizadas, os metabólitos do antantreno causam substituições de pares de base, trocas de fita e possivelmente dano oxidativo ao DNA. Alguns dos metabólitos que apresentam ação genotóxica em bactérias foram recentemente identificados, mas uma investigação mais ampla considerando a ligação desses e outros possíveis metabólitos a biomoléculas, com a identificação dos adutos formados, pode contribuir para um melhor esclarecimento das vias envolvidas em sua genotoxicidade. Neste trabalho investigamos a reação do antantreno (oxidado quimicamente e pelo sistema HRP/H2O2) com dG e DNA in vitro, tendo sido observada a formação de possíveis adutos nas análises por HPLC/ESI/MS, HPLC/UV/Fluorescência e espectrofluorimetria. Células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e hepatócitos de fígado humano normal (THLE-2) foram incubadas com antantreno e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas), verificando-se citotoxicidade dose dependente em diferentes condições de cultura. Uma vez que a sobrevivência relativa das células THLE-2 cultivadas sobre filme de colágeno e em meio PFMR-4 se assemelhou à sobrevivência relativa das células HepG2 cultivadas em meio DME e sem filme de colágeno, utilizamos as células HepG2 para análise de dano oxidativo. Produtos de oxidação do antantreno (quinonas e hidroquinonas acetiladas) induziram a formação de 8-oxodGuo no DNA celular. Os dados obtidos nos indicam que duas vias podem estar envolvidas na genotoxicidade do antantreno observada nos estudos com S.typhimurium realizados por Platt et al. (2002): indução de dano oxidativo e formação de adutos com o DNA. / Anthanthrene is a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) widely spread in the environment and does not have the bay or fjord regions, which in general provide high reactivity to these compounds after oxidation. However, its mutagenic activity to bacteria after metabolic activation is comparable to that of benzopyrene (BP) and, based on the sensitivity of the S. typhimurium strains used, anthanthrene metabolites cause base pair substitutions, DNA strand exchanges, and possibly DNA oxidative damage. Some of the metabolites that are genotoxic to bacteria have been recently identified, but a better investigation on how these and other possible metabolites react with biomolecules, identifying the generated adducts, can contribute to clarify the ways involved in its genotoxicity. In the present work we investigated the reaction of anthanthrene (chemically oxidized or oxidized by the HRP/H2O2 system) with dG and DNA in vitro. The formation of possible adducts was observed in the analyses by HPLC/ESI/MS, HPLC/UV/Fluorescence and spectrofluorimetry. Human hepatocelular carcinoma cell line (HepG2) and normal human liver hepatocytes (THLE-2) were incubated with anthanthrene and its oxidation products (quinones and acetyladet hidroquinones). Dose dependent cytotoxity was observed under different culture conditions. As the relative survival of the THLE-2 cells grown on a film of collagen in PFMR-4 medium was very close to the relative survival of the HepG2 cells grown in DME medium, without the collagen film, we used the HepG2 cells for analysis of oxidative damage. Anthanthrene oxidation products (quinones and acetylated hidroquinones) induced 8-oxodGuo formation in the cellular DNA. Data obtained indicate that two ways may be involved in the genotoxicity of anthanthrene observed in the S. typhimurium studies conducted by Platt et al. (2002): DNA oxidative damage and adducts formation.

É verificado que materiais nano/micro estruturado, com morfologia definida possui propriedades melhoradas em relação às formas macro. Essa constatação justifica o crescente número de rotas diferentes para se sintetizar polianilina numa ampla gama de morfologias diferentes e tamanhos definidos, através de variações na síntese padrão de polianilina. Utilizando uma dessas rotas que leva a produto com morfologia esférica, em estudo anterior do nosso grupo foi mostrado que o produto principal é adutos de anilinas constituídos por adutos tipo 1,4-Michael entre anilina e benzoquinona monoimina e segmentos fenazínicos substituídos. Neste trabalho foram feitas modificações nesse protocolo de síntese e os produtos foram caracterizados tanto morfologicamente como estruturalmente. A morfologia dos produtos foi determinada por microscopia eletrônica de varredura enquanto que as técnicas UV-VIS, Raman, IR e Fluorescência forneceram a estrutura dos produtos. A oxidação de anilina por persulfato de amônio sob sete diferentes condições experimentais foram realizadas mantendo o pH da solução reacional constante em 3 ou 4.5. Os produtos das condições experimentais realizadas apresentaram morfologias tipo esféricas (microesferas lisas ou porosas, e microesferas Tipo-Folha) e foram caracterizados como adutos de anilina constituídos por adutos tipo 1,4-Michael e segmentos fenazínicos não substituídos como produto majoritário de síntese. O grau de hidrólise dos nitrogênios imínicos mostrou dependência com o pH de síntese e concentrações dos reagentes. Os resultados sugeriram que o grau hidrólise dos nitrogênios imínicos é um fator importante na determinação de estruturas esféricas, assim como as concentrações dos reagentes, uma vez que estes aspectos podem influenciar na capacidade de interação entre os adutos de anilina que resulta na formação destas estruturas. A verificação de segmentos fenazínicos não substituídos (diferente do verificado no estudo anterior) na constituição dos adutos de anilina chama a atenção para a importância de caracterizar estes segmentos pela técnica de espectroscopia de Fluorescência nos trabalhos anteriores do grupo. A formação de produto de polimerização cabeça-cauda (PANI-ES) foi verificada na condição experimental realizada em pH 4,5 mais concentrada e nas condições experimentais realizadas em pH 3, exceto na condição mais diluída, corroborando a afirmação de que, além do pH reacional, a concentração absoluta dos reagentes influi na determinação do produto final / It is known that nano/micro structured materials with defined morphology has improved properties when compared to bulk forms. This finding justifies the increasing number of different routes to synthesize polyaniline in a wide range of different morphologies and sizes defined by variations in the standard synthesis of polyaniline. Using one of these routes that leads to product with spherical morphology, in a previous study from our group it was shown that the main product is aniline adducts formed by 1,4-Michael type adducts between aniline and benzoquinone monoimine and substituted phenazine segments. In this work, changes were made in this synthesis protocol and the products were characterized both morphologically and structurally. The morphology of the products was determined by scanning electron microscopy while the UV-VIS, Raman, IR and Fluorescence techniques provided the structure of the products. The oxidation of aniline with ammonium persulfate in seven different experimental conditions were carried out maintaining the pH of the reaction solution constant at 3 or 4.5. The products of the experimental conditions showed spherical-type morphologies (smooth or porous microspheres, and flower-like microspheres) and were characterized as aniline adducts formed by 1,4-Michael type adducts and non-substituted phenazine segments as the major synthesis product. The degree of hydrolysis of the imines nitrogen showed dependence on the pH of synthesis and concentration of reactants. The results suggested that the degree of hydrolysis of the imines nitrogen is an important factor in determining spherical structures, as well as the concentrations of reactants, once that these parameters can influence in the interaction ability between the adducts of aniline which results in the formation of such structures. The verification of non-substituted phenazine segments (different from that in the previous study) in the constitution of aniline adducts showed the importance of the use of fluorescence spectroscopy technique in the characterization of these segments. The head-to-tail polymerization of aniline (PANI-ES) was observed in the experimental condition performed at pH 4.5 with high concentration of reagents and on the experimental conditions at pH 3, except in the diluted reagent solution. These results show the role of the absolute concentration of reagents in the nature of the final product

O antantreno é um hidrocarboneto hexacíclico aromático (HPA) bastante difundido no meio ambiente e que não apresenta as regiões de baía ou fjord, que em geral, conferem alta reatividade a esses compostos após oxidação. Entretanto, sua mutagenicidade em bactérias após ativação metabólica é comparável à do Benzopireno (BP) e, com base na sensibilidade das linhagens de S. typhimurium utilizadas, os metabólitos do antantreno causam substituições de pares de base, trocas de fita e possivelmente dano oxidativo ao DNA. Alguns dos metabólitos que apresentam ação genotóxica em bactérias foram recentemente identificados, mas uma investigação mais ampla considerando a ligação desses e outros possíveis metabólitos a biomoléculas, com a identificação dos adutos formados, pode contribuir para um melhor esclarecimento das vias envolvidas em sua genotoxicidade. Neste trabalho investigamos a reação do antantreno (oxidado quimicamente e pelo sistema HRP/H2O2) com dG e DNA in vitro, tendo sido observada a formação de possíveis adutos nas análises por HPLC/ESI/MS, HPLC/UV/Fluorescência e espectrofluorimetria. Células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e hepatócitos de fígado humano normal (THLE-2) foram incubadas com antantreno e seus produtos de oxidação (quinonas e hidroquinonas acetiladas), verificando-se citotoxicidade dose dependente em diferentes condições de cultura. Uma vez que a sobrevivência relativa das células THLE-2 cultivadas sobre filme de colágeno e em meio PFMR-4 se assemelhou à sobrevivência relativa das células HepG2 cultivadas em meio DME e sem filme de colágeno, utilizamos as células HepG2 para análise de dano oxidativo. Produtos de oxidação do antantreno (quinonas e hidroquinonas acetiladas) induziram a formação de 8-oxodGuo no DNA celular. Os dados obtidos nos indicam que duas vias podem estar envolvidas na genotoxicidade do antantreno observada nos estudos com S.typhimurium realizados por Platt et al. (2002): indução de dano oxidativo e formação de adutos com o DNA. / Anthanthrene is a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) widely spread in the environment and does not have the bay or fjord regions, which in general provide high reactivity to these compounds after oxidation. However, its mutagenic activity to bacteria after metabolic activation is comparable to that of benzopyrene (BP) and, based on the sensitivity of the S. typhimurium strains used, anthanthrene metabolites cause base pair substitutions, DNA strand exchanges, and possibly DNA oxidative damage. Some of the metabolites that are genotoxic to bacteria have been recently identified, but a better investigation on how these and other possible metabolites react with biomolecules, identifying the generated adducts, can contribute to clarify the ways involved in its genotoxicity. In the present work we investigated the reaction of anthanthrene (chemically oxidized or oxidized by the HRP/H2O2 system) with dG and DNA in vitro. The formation of possible adducts was observed in the analyses by HPLC/ESI/MS, HPLC/UV/Fluorescence and spectrofluorimetry. Human hepatocelular carcinoma cell line (HepG2) and normal human liver hepatocytes (THLE-2) were incubated with anthanthrene and its oxidation products (quinones and acetyladet hidroquinones). Dose dependent cytotoxity was observed under different culture conditions. As the relative survival of the THLE-2 cells grown on a film of collagen in PFMR-4 medium was very close to the relative survival of the HepG2 cells grown in DME medium, without the collagen film, we used the HepG2 cells for analysis of oxidative damage. Anthanthrene oxidation products (quinones and acetylated hidroquinones) induced 8-oxodGuo formation in the cellular DNA. Data obtained indicate that two ways may be involved in the genotoxicity of anthanthrene observed in the S. typhimurium studies conducted by Platt et al. (2002): DNA oxidative damage and adducts formation.

Foram preparados adutos de tetracloreto de titânio com ligantes orgânicos monodentados do tipo TiC14.2L, onde L = CH3CN, CD3CN, C2H5CN, C2H3CN, C6H5CN, C5H5N, C5D5N, (CH3)2S e (C2H5)2S. Foram feitas as previsões espectrais, pela aplicação da teoria de grupo, para o esqueleto do aduto TiCl4.2L, tendo em vista as três possíveis configurações: D4h, D2d e C2v. Os espectros vibracionais foram obtidos em estado sólido, sendo que para os adutos TiC14.2CH3CN e TiC14.2C2H5CN também o foram em solução, usando como solventes os respectivos ligantes. Os espectros Raman de todos os compostos e os espectros infravermelho dos adutos com os ligantes: acetonitrila deuterada, piridina deuterada e dietilssulfeto, são originais. Para maior facilidade na discussão e interpretação dos espectros os adutos foram agrupados em três conjuntos, caracterizados pela semelhança dos espectros vibracionais, especialmente, Raman. O primeiro conjunto compreende os adutos com nitrilas, o segundo os com piridina e o terceiro os com sulfetos. A análise dos espectros sugere que: a) Os compostos de adição do primeiro conjunto pertencem à configuração cis-octaédrica, grupo pontual C2v. b) O esqueleto dos adutos do segundo conjunto possuem configuração trans-octaédrica, simetria D4h. Para os complexos do terceiro conjunto não foi possível concluir, com base nos espectros vibracionais, a configuração do esqueleto. Foi feita uma tentativa de atribuição das frequências dos esqueletos para os adutos do primeiro e do segundo conjunto, com a utilização de vários argumentos empíricos. São discutidos alguns deslocamentos de frequências do ligante devido à coordenação. A análise em coordenadas normais, usando o campo de força de Urey-Bradley com duas interações, para os adutos de tetracloreto de titânio com acetonitrila e acetonitrila deuterada, confirma a atribuição feita. / Abstract not available.

As espécies reativas são associadas a processos toxicológicos e fisiopatológicos, agindo como importantes mediadores, por exemplo, na sinalização celular. Diversas classes de compostos têm sido utilizadas como possíveis biomarcadores de estresse redox, destacando-se os aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, capazes de alquilar biomoléculas como o DNA. Para evitar efeitos deletérios, estes aldeídos são detoxificados por glutationilação e posterior metabolização a derivados mercaptúricos. Contudo, avaliar o estado redox em sistemas biológicos ainda é tarefa bastante complexa, sendo a dificuldade em quantificar de forma prática e acurada os efeitos de sinalização e/ou dano molecular o maior problema dos estudos redox. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos acurados e sensíveis de análise de potenciais biomarcadores de estresse redox, isto é: nucleosídeos modificados, aldeídos endógenos e exógenos, glutationa e produtos de glutationilação, e avaliá-los em sistemas modelos, celular e animal, e em humanos. A avaliação dos níveis urinários de três nucleosídeos modificados por metodologia de HPLC-MS/MS desenvolvida pelo grupo em moradores da cidade de São Paulo - região com poluição atmosférica - demonstrou aumento significativo de 1,N2-propanodGuo comparado aos moradores de região não poluída. Ademais, comprova-se pela primeira vez que células deficientes em reparo de ligações cruzadas apresentam níveis basais elevados de 1,N2-propanodGuo, em duas linhagens independentes, colocando este aduto como potencial mediador de carcinogênese em pacientes portadores de Anemia de Fanconi. Utilizando cérebro de ratos SOD1G93A (modelo de Esclerose Lateral Amiotrófica - ELA), verificou-se aumento de 50% nos níveis de 1,N2-propanodGuo e de 100% nos de 1,N6-&#949;dAdo em fase sintomática, sugerindo influência do conteúdo lipídico cerebral, levando a comprometimento do metabolismo neuronal e morte celular. O perfil de aldeídos determinado em cérebro de ratos SOD1G93A demonstrou aumento de trans-hexa-2-enal e trans,trans-hexa-2,4-dienal em fase assintomática e de trans,trans-deca-2,4-dienal em fase sintomática, não sendo observada nenhuma alteração na medula. Conhecer estas variações permite direcionar estudos de modificações em biomoléculas, além de a metodologia per se corroborar com as áreas de análises lipidômicas. Técnicas distintas e o preparo de amostras refletiram nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) relatados. A técnica de espectrometria de massas mostrou-se mais precisa que a detecção eletroquímica; e a alquilação do grupo tiol minimizou interferências de matriz. Por análise de HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS, a quantificação de trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) e crotonaldeido conjugados com GSH demonstrou não haver alterações em cérebro e medula de ratos SOD1G93A. Contudo, há formação esteroespecífica dos adutos de HNE in vivo. Ressalta-se que a metodologia desenvolvida é extremamente sensível e específica e permite análise simultânea de GSH, GSSG, cisteína, cistina e dos adutos supracitados, servindo para análise de outros adutos de glutationilação de aldeídos que possam ser importantes em doenças associadas a estresse redox. / Free radicais and oxidant species are associated with toxicological and pathophysiological processes. It has been demonstrated that production of reactive oxygen species may be involved in cell signaling and regulation. Several biomarkers of redox processes have been used, including adducts formed through the reaction of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes with biomolecules such as DNA. In order to avoid these deleterious effects, aldehydes are detoxified through glutathionylation and further metabolized to mercapturic derivatives. However, assessing the redox status in biological systems is still a very complex task, and the difficulty in practical and accurate quantification of signaling effects and/or molecular damage is a major problem in redox studies. The objective of this work was to develop accurate and sensitive methods for analysis of potential biomarkers of redox stress, i.e., modified nucleosides, endogenous and exogenous aldehydes, glutathione and glutathionylation products, and their evaluation in cell, animal model and humans. Evaluation of urinary levels of 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine (1,N2-propanodGuo), 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine and 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine in residents of São Paulo City - polluted region - showed a significant increase (p<0.05) in 1,N2-propanodGuo levels compared to residents of an unpolluted region by a HPLC-MS/MS methodology developed by the group. Moreover, it was proven, for the first time, that repair deficient cells have basal levels of 1,N2-propanodGuo higher than proficient cells in two independent strains, placing 1,N2-propanodGuo as a potential mediator of carcinogenesis in Fanconi Anemia patients. In an Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) animal model (SOD1G93A rat) , a 50% increase in the levels of 1,N2-propanodGuo and 100% in the 1,N6-etheno-2\'-deoxyadenosine in brain tissue in the symptomatic phase was observed, suggesting that the high brain lipid content may play a role, leading to impairment of cell metabolism and neuronal cell death. There is an increase of trans-hex-2-enal and trans,trans-hexa-2,4-dienal in asymptomatic SOD1G93A rats brain and of trans,trans-deca-2,4-dienal in symptomatic ones. However, no alteration was observed in spinal cord. Our approach contributes to a better understanding of the aldehyde status in vivo and allows us to predict biomolecule modifications. The developed methodology can contribute to lipidomic studies. The use of different techniques and sample preparation reflected in the reported levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG). The mass spectrometry technique proved to be more accurate than the electrochemical one, and the use of thiol alkylating agent minimizes matrix interference. No changes were observed in the levels of the GSH conjugates of trans-4-hydroxy-2-nonenal (HNE) and crotonaldehyde in brain and spinal cord of SOD1G93A rats quantified by HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS compared to controls. However, it was observed stereospecific HNE adducts formation in vivo. Note that this methodology is extremely sensitive and specific and allows simultaneous analysis of GSH, GSSG, Cys, cystine and the aforementioned adducts, serving for analysis of other aldehyde-glutathionylation adducts that may be important in pathologies associated with stress redox.

As espécies reativas são associadas a processos toxicológicos e fisiopatológicos, agindo como importantes mediadores, por exemplo, na sinalização celular. Diversas classes de compostos têm sido utilizadas como possíveis biomarcadores de estresse redox, destacando-se os aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, capazes de alquilar biomoléculas como o DNA. Para evitar efeitos deletérios, estes aldeídos são detoxificados por glutationilação e posterior metabolização a derivados mercaptúricos. Contudo, avaliar o estado redox em sistemas biológicos ainda é tarefa bastante complexa, sendo a dificuldade em quantificar de forma prática e acurada os efeitos de sinalização e/ou dano molecular o maior problema dos estudos redox. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos acurados e sensíveis de análise de potenciais biomarcadores de estresse redox, isto é: nucleosídeos modificados, aldeídos endógenos e exógenos, glutationa e produtos de glutationilação, e avaliá-los em sistemas modelos, celular e animal, e em humanos. A avaliação dos níveis urinários de três nucleosídeos modificados por metodologia de HPLC-MS/MS desenvolvida pelo grupo em moradores da cidade de São Paulo - região com poluição atmosférica - demonstrou aumento significativo de 1,N2-propanodGuo comparado aos moradores de região não poluída. Ademais, comprova-se pela primeira vez que células deficientes em reparo de ligações cruzadas apresentam níveis basais elevados de 1,N2-propanodGuo, em duas linhagens independentes, colocando este aduto como potencial mediador de carcinogênese em pacientes portadores de Anemia de Fanconi. Utilizando cérebro de ratos SOD1G93A (modelo de Esclerose Lateral Amiotrófica - ELA), verificou-se aumento de 50% nos níveis de 1,N2-propanodGuo e de 100% nos de 1,N6-&#949;dAdo em fase sintomática, sugerindo influência do conteúdo lipídico cerebral, levando a comprometimento do metabolismo neuronal e morte celular. O perfil de aldeídos determinado em cérebro de ratos SOD1G93A demonstrou aumento de trans-hexa-2-enal e trans,trans-hexa-2,4-dienal em fase assintomática e de trans,trans-deca-2,4-dienal em fase sintomática, não sendo observada nenhuma alteração na medula. Conhecer estas variações permite direcionar estudos de modificações em biomoléculas, além de a metodologia per se corroborar com as áreas de análises lipidômicas. Técnicas distintas e o preparo de amostras refletiram nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) relatados. A técnica de espectrometria de massas mostrou-se mais precisa que a detecção eletroquímica; e a alquilação do grupo tiol minimizou interferências de matriz. Por análise de HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS, a quantificação de trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) e crotonaldeido conjugados com GSH demonstrou não haver alterações em cérebro e medula de ratos SOD1G93A. Contudo, há formação esteroespecífica dos adutos de HNE in vivo. Ressalta-se que a metodologia desenvolvida é extremamente sensível e específica e permite análise simultânea de GSH, GSSG, cisteína, cistina e dos adutos supracitados, servindo para análise de outros adutos de glutationilação de aldeídos que possam ser importantes em doenças associadas a estresse redox. / Free radicais and oxidant species are associated with toxicological and pathophysiological processes. It has been demonstrated that production of reactive oxygen species may be involved in cell signaling and regulation. Several biomarkers of redox processes have been used, including adducts formed through the reaction of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes with biomolecules such as DNA. In order to avoid these deleterious effects, aldehydes are detoxified through glutathionylation and further metabolized to mercapturic derivatives. However, assessing the redox status in biological systems is still a very complex task, and the difficulty in practical and accurate quantification of signaling effects and/or molecular damage is a major problem in redox studies. The objective of this work was to develop accurate and sensitive methods for analysis of potential biomarkers of redox stress, i.e., modified nucleosides, endogenous and exogenous aldehydes, glutathione and glutathionylation products, and their evaluation in cell, animal model and humans. Evaluation of urinary levels of 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine (1,N2-propanodGuo), 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine and 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine in residents of São Paulo City - polluted region - showed a significant increase (p<0.05) in 1,N2-propanodGuo levels compared to residents of an unpolluted region by a HPLC-MS/MS methodology developed by the group. Moreover, it was proven, for the first time, that repair deficient cells have basal levels of 1,N2-propanodGuo higher than proficient cells in two independent strains, placing 1,N2-propanodGuo as a potential mediator of carcinogenesis in Fanconi Anemia patients. In an Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) animal model (SOD1G93A rat) , a 50% increase in the levels of 1,N2-propanodGuo and 100% in the 1,N6-etheno-2\'-deoxyadenosine in brain tissue in the symptomatic phase was observed, suggesting that the high brain lipid content may play a role, leading to impairment of cell metabolism and neuronal cell death. There is an increase of trans-hex-2-enal and trans,trans-hexa-2,4-dienal in asymptomatic SOD1G93A rats brain and of trans,trans-deca-2,4-dienal in symptomatic ones. However, no alteration was observed in spinal cord. Our approach contributes to a better understanding of the aldehyde status in vivo and allows us to predict biomolecule modifications. The developed methodology can contribute to lipidomic studies. The use of different techniques and sample preparation reflected in the reported levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG). The mass spectrometry technique proved to be more accurate than the electrochemical one, and the use of thiol alkylating agent minimizes matrix interference. No changes were observed in the levels of the GSH conjugates of trans-4-hydroxy-2-nonenal (HNE) and crotonaldehyde in brain and spinal cord of SOD1G93A rats quantified by HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS compared to controls. However, it was observed stereospecific HNE adducts formation in vivo. Note that this methodology is extremely sensitive and specific and allows simultaneous analysis of GSH, GSSG, Cys, cystine and the aforementioned adducts, serving for analysis of other aldehyde-glutathionylation adducts that may be important in pathologies associated with stress redox.

Globalmente, os problemas de poluição são mais severos em regiões densamente povoadas ou industrializadas. A Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) é um exemplo de megalópole com um conjunto único de emissões, insolação e condições meteorológicas que determinam sua elevada poluição atmosférica. Entre os compostos mais tóxicos presentes nesta atmosfera estão os aldeídos, moléculas de grande potencial mutagênico e carcinogênico que podem ser originados da oxidação de combustíveis fósseis e etanol, além de possuir fontes endógenas. Sua adição covalente em biomoléculas como DNA e proteínas é estudada como mecanismo de sua ação mutagênica e carcinogênica. Desenvolvemos um método ultrassensível de HPLC acoplado à espectrometria de massas para análise simultânea de vários adutos de DNA com aldeídos presentes na atmosfera urbana como formaldeído, acetaldeído, crotonaldeído e acroleína, além de modificações oxidativas. Foram utilizados para validação da metodologia células modelo de Anemia Fanconi e tecido de músculo de ratos modelo para ELA (Esclerose Lateral Amiotrófica), os quais apresentaram níveis basais dos adutos de formaldeído, acetaldeído, acroleína e crotonaldeído. Outros modelos de exposição aos aldeídos foram utilizados na validação desta metodologia, como a fumaça de cigarro de tabaco e de cannabis sendo que a formação desses adutos também foi verificada em DNA de timo de bezerro. Pela primeira vez, foi mostrada a formação inequívoca do aduto de acetaldeído (1,N2-propanodGuo) em pulmões e cérebros de ratos Wistar expostos à 10 ppb de acetaldeído isotopicamente marcado e sua estrutura confirmada por espectrometria de massas de alta resolução. Esse resultado comprova o mecanismo de formação do aduto por meio da adição de duas moléculas de acetaldeído in vivo por inalação e em baixa concentração, sendo crucial para formulação de políticas públicas por agências ambientais. / Globally, air pollution problems are more severe in densely populated or industrialized regions. The Metropolitan Region of São Paulo (RMSP) is an example of a megalopolis with a unique set of emissions, insolation and meteorological conditions that determinates its high atmospheric pollution. Among the most toxic compounds present in this atmosphere are aldehydes, molecules of great mutagenic and carcinogenic potential that can be originated from the oxidation of fossil fuels and ethanol, besides having endogenous sources. Its covalent addition in biomolecules like DNA and proteins is studied as a mechanism of its mutagenic and carcinogenic action. We developed an ultra-sensitive HPLC method coupled with mass spectrometry for the simultaneous analysis of several DNA adducts with aldehydes present in the urban atmosphere as formaldehyde, acetaldehyde, crotonaldehyde and acrolein and oxidative lesions as well. To validate the method, we used a cell model of Fanconi Anemia and muscle tissue from a rat model for ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) which presented basal levels of the adducts of formaldehyde, acetaldehyde, acrolein and crotonaldehyde. Other models of exposure to aldehydes were used to validate the method, such as tobacco and cannabis smoke and the formation of these adducts was also verified in Calf Thymus DNA. For the first time, the unequivocal formation of the acetaldehyde (1, N2-propanodGuo) adduct was shown in lungs and brains of Wistar rats exposed to 10 ppb of isotopically labeled acetaldehyde and its structure was confirmed by high resolution mass spectrometry. This result confirms the mechanism of adduct formation by the addition of two molecules of acetaldehyde in vivo by inhalation of a low concentration of acetaldehyde, being crucial for the formulation of public policies by environmental agencies.