Geobacillus thermodenitrificans JK1 kamieno termostabilios ksilanazės geno klonavimas, ekspresija ir fermento savybių analizė Ksilanas - pagrindinis hemiceliuliozės komponentas ir antras pagal paplitimą polisacharidas gamtoje. Šis biologinis polimeras yra chemiškai heterogeniška bei kompleksiška medžiaga, kurios efektyviam degradavimui reikalingos multifermentinės sistemos. Tokios sistemos yra plačiai paplitusios tarp įvairių prokariotinių ir eukariotinių mikroorganizmų. Pagrindinį vaidmenį ksilano degradacijoje atlieka endo-1,4-β-ksilanazės. Ksilanazės pasižyminčios termostabilumu yra plačiai taikomas popieriaus ir maisto pramonėje, pašarų gamyboje bei biokonversijoje. Darbo metu buvo atrinktas JK1 kamienas, gebantis sekretuoti ksilanolizinius fermentus į ląstelės išorę. Remiantis 16S rRNR ir spo0A genų sekų palyginimais bei filogenetine analize nustatyta, kad tiriamas kamienas buvo artimiausias G. thermodenitrificans NG80-2 kamienui, kuriame taip pat nustatytas ksilanazės genas. Pagal šią geno seką sukurti pradmenys amplifikuojantys JK1 kamieno ksilanazės geną (1224 bp). Ksilanazės genas klonuotas ir perkeltas į ekspresijos vektorių (pET-28c(+)), sukonstruojant rekombinantinę ksilanazę su His inkarine uodega (50,979 kDa), kas leido ekspresuoti baltymą E. coli ir atlikti gryninimą nikelio afininės chromatografijos metodu. Šiame darbe pirmą kartą charakterizuota G. thermodenitrificans JK1 kamieno ksilanazė. Rekombinantinio fermento optimalios veikimo sąlygos - 70 °C... [toliau žr. visą tekstą] / Cloning, expression and biochemical characterization of the thermostable xylanase from Geobacillus thermodenitrificans strain JK1 Xylan is a major structural polysaccharide in plant cells, and is the second most abundant polysaccharide in nature. Due to its heterogeneity and complexity, the complete hydrolysis of xylan requires a variety of cooperatively acting enzymes. These xylanolytic enzyme systems are quite widespread among prokariotic and eukaryotic microorganisms. Endo-1,4-β-xylanase is considered to play the most important role in xylan degradation. Thermostable xylanases have potential applications in a wide range of industrial processes, including pulp and paper industry, food and animal feeds industry and bioconvertion. In this study a thermophilic JK1 strain producing xylanolytic enzymes was isolated from compost sample. The 16S rRNR and spo0A genes sequence analysis indicated that JK1 strain had the highest similarity with G. thermodenitrificans NG80-2 strain. Based on the xylanase gene sequence from G. thermodenitrificans NG80-2 strain, degenerated primers were designed for amplification of xylanase-coding gene (1224 bp) from JK1 strain. Subsequently, the amplified gene was cloned into expression vector (pET-28c(+)) and the recombinant xylanase with a polyhistidine-tag was designed (50,979 kDa). Biochemical properties of the purified by nickel affinity chromatography recombinant xylanase from G. thermodenitrificans JK1 strain were further characterized. The... [to full text]