Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2013. / ENGLISH ABSTRACT: Proteins from various sources, including grape berry cells, yeast, bacteria and fining agents e.g. albumin and casein, have previously been identified in wine. These proteins play various critical roles in the functioning and survival of the organisms that produced them but also exhibit oenological properties, once secreted in the juice/wine. Some of them can indeed be beneficial to winemaking, by releasing aroma compounds from grape-derived precursors, or detrimental to wine quality, by causing protein haze. Yeasts contribute significantly to the protein pool during and after alcoholic fermentation. However, while the extracellular proteins of Saccharomyces cerevisiae, the main wine yeast species, have been characterised, those of non-Saccharomyces yeasts remain largely unknown, especially under winemaking conditions. Although specific extracellular enzymes released by non-Saccharomyces yeasts have been the focus of many studies in recent years, the targeted approaches used have restricted our knowledge to these specific enzymes and excluded the other secreted proteins. A more comprehensive insight into entire secretomes could improve our understanding of how yeasts survive in wine and interact with other species in mixed culture fermentations. This study aims to characterise the exo-proteome of Saccharomyces and selected non-Saccharomyces yeasts in pure and mixed cultures in a wine-like medium. Fermentation kinetics were monitored and the extracellular proteins isolated at the end of fermentation. M. pulcherrima hardly fermented whereas L. thermotolerans fermented slowly but steadily. As expected S. cerevisiae completed the fermentation rapidly. In sequential fermentations, the kinetics resembled those of the non-Saccharomyces yeasts for a period before switching to that of S. cerevisiae. This period varied from 4 to 15 days for M. pulcherrima and L. thermotolerans respectively. Visual observations of the protein content of the medium at the end of fermentation using 1D and 2D SDS-PAGE gels as well as identification of these proteins using mass fingerprinting revealed the large variety of proteins secreted and the influence of yeast interactions on each other’s secretome. The fermentation kinetics observed could partially be explained by the extent of the contribution of the different yeast to the protein content. Proteins secreted by non-Saccharomyces yeasts lowered the potential of wine to form protein haze, with both M. pulcherrima and L. thermotolerans in pure and mixed culture fermentations showing lower haze formation than S. cerevisiae. As far as we know, this is the first report on the secretome of non-Saccharomyces under winemaking condition and the influence non-Saccharomyces proteins have on the protein haze potential of wine, providing the basis for future investigations. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Proteïene vanaf verskeie bronne (insluitend druiwe korrels, gis, bakterieë en verhelderings agente bv. albumien en kaseïen) is reeds in wyn identifiseer. Hierdie proteïene speel verskeie rolle in die funksionering en oorlewing van die organismes wat dit produseer, maar beskik ook oor wynkundige eienskappe sodra dit in die sap of wyn uitgeskei word. Hoewel sommige proteïene in wyn wel voordelig mag wees as gevolg van die vrystelling van aroma komponente vanuit druif‐voorlopers, kan dit ook nadelig wees vir wyn kwaliteit deur die troebelheid wat dit kan veroorsaak Gis dra aansienlik by tot die totale proteïen inhoud van wyn, beide gedurende asook na alkoholiese fermentasie. Alhoewel die ekstrasellulêre proteïene van Saccharomyces cerevisiae (die mees algemeen gebruikte gis vir wynmaak) reeds goed gekarakteriseer is, is die proteïene van nie-Saccharomyces giste grootliks onbekend, veral die wat tydens wynmaak vrygestel word. Gedurende die laaste paar jaar het verskeie studies gefokus op spesifieke ekstrasellulêre ensieme wat deur nie-Saccharomyces giste produseer word, maar geteikende benaderings het ons kennis beperk tot net hierdie spesifieke ensieme, en enige ander afgeskeide proteïene uitgesluit. ʼn Meer omvattende insig oor die algehele afgeskeide proteoom kan ons begrip van hoe gis in wyn oorleef en interaksies tussen gis spesies in gemengde kultuur fermentasies verbeter Hierdie studie streef om die sekretoom van Saccharomyces en geselekteerde nie-Saccharomyces giste in suiwer en gemengde kultuur fermentasies van sintetiese wyn medium te karakteriseer. Fermentasie kinetika is gemonitor en die ekstrasellulêre proteïene is teen die einde van fermentasie geïsoleer. Metschnikowia pulcherrima het swak fermenteer terwyl Lachancea thermotolerans stadig tog reëlmatig fermenteer het. Soos verwag, het S. cerevisiae vinnig tot droog fermenteer. In agtereenvolgend geïnokuleerde fermentasies is die kinetika vir ʼn tydperk soortgelyk aan die van die nie-Saccharomyces giste voordat dit oorskakel na die van S. cerevisiae. Hierdie tydperk wissel respektiewelik vanaf 4 tot 15 dae vir M. pulcherrima en L. thermotolerans. Visuele waarnemings van die proteïen-inhoud van die medium aan die einde van die gisting met behulp van 1D en 2D SDS-PAGE gels asook identifisering van hierdie proteïene met behulp van massa vingerafdrukke onthul die groot verskeidenheid proteïene wat afgeskei word, asook die invloed van die giste se interaksies op mekaar se sekretoom. Die fermentasie kinetika waargeneem kan gedeeltelik verklaar word deur die omvang van die bydrae van die verskillende gis tot die proteïen-inhoud. Proteïene wat afgeskei word deur nie-Saccharomyces giste verlaag die potensiaal van wyn om proteïen troebelheid te vorm, met beide M. pulcherrima en L. thermotolerans (in suiwer en gemengde kultuur fermentasies) wat minder troebelheid vorm as fermentasies met S. cerevisiae. Sover ons kennis strek, is hierdie die eerste verslag oor die sekretoom van nie- Saccharomyces onder wynmaak toestande en ook oor die invloed wat nie-Saccharomyces proteïene op die proteïen troebelheid van wyn het, en vorm die basis vir toekomstige navorsing. / Winetech and THRIP

Moët & Chandon est le leader mondial incontesté dans le secteur des vins mousseux de haute qualité. La sélection des différentes gammes de vins de qualité se fait sur la base de la dégustation de vin, après la fermentation malolactique par la dégustation des jurys d'experts. Une partie importante du volume vinifié ne peut être classé parmi les vins les plus qualitatifs à cause d'un caractère organoleptique appelé «trait lactique». Cette caractéristique est due à la formation de métabolites volatils au cours de la fermentation du vin en particulier diacétyle, acétoïne et de 2,3-pentanedione. Le diacétyle, également connu sous le nom de 2,3-butanedione, est le principal marqueur associé à l'apparition de notes beurrées. Moët & Chandon souhaite commencer une thèse pour contrôler l'apparition de trait lactique dans ses vins de bases. Bien que la production de diacétyle se produit à la fois pendant la fermentation alcoolique (FA) et la fermentation malolactique, la thèse se concentrera sur la gestion de la FA. Une approche multi-factorielle basée à la fois sur l'ingénierie microbiologique et chimique sera mis en œuvre. Dans un premier temps, le travail visera à mieux comprendre le fonctionnement et la régulation des voies métaboliques impliquées dans la formation de diacétyle. De cette information, nous allons développer des stratégies de contrôle de la fermentation afin de minimiser le caractère lactique de vins. Dans ce travail, le rôle et l'impact des paramètres de fermentation sera particulièrement évalué. Le projet commencera par la mise en œuvre des outils d'analyse nécessaires au suivi des marqueurs de trait lactique (diacétyle, acétoïne, 2,3-pentanedione, ...). Deuxièmement, sur un support synthétique, le projet permettra de caractériser le processus de fermentation. Surtout, les équilibres azotés seront contrôlés et les cinétiques de synthèse des composés responsables de trait d'arôme lactique seront déterminées. Une étude de l'impact des acides aminés précurseurs permettra de mieux comprendre le rôle du métabolisme de l'azote. Enfin, l'étude de l'effet de divers facteurs tels que la nature des substances nutritives, température de fermentation et l'apport en oxygène devrait conduire à l'élaboration de stratégies de contrôle rendant possible la diminution du caractère lactique dans les vins destinés à la fermentation secondaire. Dans la dernière partie de projet, les différentes stratégies développées sur moûts synthétiques seront évaluées dans des conditions de vinification réelles. / Champagne company Moët & Chandon is the undisputed worldwide leader in the high quality sparkling wines sector. The selection of different ranges of quality wine is done on the basis of the wine tasting, after malolactic fermentation by tasting expert juries. A significant part of the vinified volume cannot be valued among the most qualitative wines because of a particular feature called « lactic trait ». This trait is attributable to the formation of volatile metabolites during wine fermentation particularly diacetyl, acetoin and 2,3-pentanedione. Diacetyl, also known as 2,3-butanedione, is the main marker associated with the appearance of milky-buttery notes. Champagne company Moët & Chandon wishes to initiate a thesis to control the onset of lactic trait in its wines. Although the production of diacetyl occurs both during alcoholic fermentation (AF) and malolactic fermentation, the thesis will focus on the management of AF. A multi-factorial approach based on both microbiological and chemical engineering will be implemented. At first, the work will aim to better understand the functioning and regulation of metabolic pathways involved in the formation of diacetyl. From this information, we will develop some strategies of fermentation control to minimize the lactic trait of wines. In this work, the role of fermentation parameters will be particularly evaluated. The project will start by the implementation of the analytical tools needed to monitor markers of lactic trait (diacetyl, acetoin, 2,3-pentanedione, ...). Secondly, on synthetic media, the project will allow to characterize the fermentation process. Especially, nitrogen balances will be performed and the kinetics of synthesis of the aroma compounds responsible of lactic trait will be determined. A study of the impact of the precursor amino acids will enable to better understand the role of the nitrogen metabolism. Finally, the study of the effect of various factors such as the nature of nitrogen nutrients, fermentation temperature and oxygen intake should lead to the development of control strategies making possible the decrease of the lactic trait in wines intended for the secondary fermentation. In the final part of the work, the different strategies developed on synthetic must will be assessed in real winemaking conditions.

As leveduras Dekkera/Brettanomyces estão envolvidas na deterioração de vinhos após o término das fermentações alcoólicas e maloláticas, tendo se apresentado como agente contaminante de processos contínuos de produção de etanol industrial. São caracterizadas pela morfologia celular típica (células alongadas e ogivais), alta produção de ácido e crescimento lento, porém de difícil identificação. Embora muitos trabalhos já tenham sido publicados acerca do seu papel na fermentação do vinho, pouco se conhece sobre o seu comportamento no processo de fermentação para produção de álcool combustível. Desta forma, este trabalho objetivou selecionar, identificar e caracterizar linhagens de Dekkera e Brettanomyces isoladas de processos fermentativos, através de testes de taxonomia clássica, moleculares (PCR e sequenciamento) e de biotipagem através do sistema killer, visando a avaliação de fermentações mistas de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis, a última em níveis de contaminação variando de 101 a 103 células/mL, em meio de caldo de cana, em processo de fermentação em batelada com reciclo celular (14 ciclos de 12 horas) para produção de etanol. Os testes morfológicos e fisiológicos/bioquímicos de oito linhagens selecionadas pela alta produtividade de ácido a partir da glicose e morfologia celular característica, apontaram os gêneros Dekkera ou Brettanomyces, sem possibilidade de identificação em nível de espécie devido à ambigüidade dos resultados dos testes fisiológicos. O sequenciamento da região ITS (Internal transcribed spacer) do DNA ribossomal confirmou somente três linhagens como Dekkera bruxellensis, sendo as demais predominantemente pertencentes à espécie Pichia guillermondii. O tamanho da região ITS, incluindo o gene 5,8S, variou de 400 500 pb entre as três linhagens. A utilização do sistema killer como método de biotipagem para leveduras Dekkera mostrou-se inviável devido ao fenótipo predominantemente neutro apresentado pelas linhagens. Somente a levedura killer CCA510 (Kluyveromyces marxianus) apresentou atividade inibitória contra as três linhagens de D. bruxellensis. Os ensaios fermentativos realizados com a linhagem de D. bruxellensis (CCA059) em fermentações puras e mistas com S. cerevisiae (CCA193, PE-02), mostraram que a levedura contaminante foi capaz de crescer em meio de caldo de cana, independentemente do tamanho do seu inóculo inicial (101 a 103 células/mL), impactando negativamente a fermentação etanólica, causando a diminuição da viabilidade de S. cerevisiae, diminuindo o pH do meio, decréscimo na produção de etanol e eficiência fermentativa, possivelmente devido à produção de ácido acético a partir do ART do meio de fermentação. Extrapolando-se os resultados obtidos em escala de laboratório para a escala industrial de uma destilaria de médio porte, a contaminação por Dekkera bruxellensis acarretaria uma perda de 6 milhões a 15 milhões de litros de álcool na safra, que deixariam de ser produzidos, dependendo do nível de contaminação. / Dekkera/Brettanomyces yeasts are found to be either contaminants in wine after completion of alcoholic and malolactic fermentations and in continuous fermentations for fuel alcohol production. They are characterized by typical cell morphology (elongated and ogival cells), high acid production and slow growth, however not easily identified. Although their role in wine fermentations is well-defined, a little is known about their behavior during fermentation for ethanol production. This work aimed the screening, identification and characterization of Dekkera and Brettanomyces strains isolated from fermentative processes, through classical taxonomic tests, molecular analysis (PCR and DNA sequencing) and biotyping by killer system. Following fermentation essays were carried out to evaluate mixed fermentations of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxellensis, the last one in contamination levels varying from 101 to 103 cells/mL, in sugar cane medium, using batch fermentation process with cell recycle (fourteen 12-hour cycles) for fuel ethanol production. Morphological and physiological/biochemical tests involving eight strains selected for their high acid production from glucose and typical cell morphology, pointed out to the genera Dekkera or Brettanomyces, without possibility of species identification due to the variability and ambiguity of physiological tests. DNA sequencing of the ITS (Internal transcribed spacer) region belonging to ribosomal DNA confirmed only three strains as Dekkera bruxellensis, the others were predominantly Pichia guilliermondii. The ITS region, including the 5,8S gene, varied from 400 to 500 bp among the three strains. The use of killer system as a biotyping method for Dekkera strains might not be applied because the strains were predominantly neutral to killer toxins. Only the killer strain CCA510 (Kluyveromyces marxianus) showed to have inhibitory activity against the strains of D. bruxellensis. The fermentative essays using a strain of D. bruxellensis (CCA059) in mixed and pure fermentations with S. cerevisiae (CCA193, PE-02), have shown that the contaminant yeast was able to grown in sugar cane juice, regardless of the initial inoculum size ((101 to 103 cells/mL), impairing the bioethanol fermentation, causing diminished S. cerevisiae viability, pH decrease, lower ethanol production and fermentative efficiency, mainly due to the acetic acid production from reducing sugar present in fermentation medium. Extrapolation of the results obtained in laboratory scale to industrial scale in a medium-sized distillery, have revealed that contamination by Dekkera bruxellensis would result in a alcohol loss of 6 millions to 15 millions of liters, which would not be produced, depending on the contamination level.

As características do processo industrial brasileiro para a produção do bioetanol tornam as destilarias susceptíveis a presença de microrganismos contaminantes que ocasionam na queda de rendimento de produção. Dentre as etapas do processo, tem-se a fermentação alcoólica, que consiste na metabolização de açúcares pela cepa de levedura selecionada da espécie Saccharomyces cerevisiae produzindo o etanol. Nesta etapa ocorre a contaminação por leveduras do gênero Saccharomyces, leveduras não Saccharomyces e bactérias. As bactérias mais encontradas são as pertencentes ao grupo das bactérias láticas (LAB), que por utilizarem diferentes vias para metabolizar os açúcares, são classificadas em heterofermentativa obrigatória, homofermentativa obrigatória e heterofermentativa facultativa. Entre os gêneros deste grupo, os Lactobacillus são os mais comuns devido à sua habilidade em tolerar altas concentrações de etanol e açúcares, altas temperaturas e baixo pH. As espécies L. fermentum e L. plantarum foram relatadas em diversos trabalhos como entre as espécies mais encontradas contaminando esse ambiente. Os Lactobacillus contaminantes estão em constante interação com a cepa de levedura que por consequência, tem sua eficiência fermentativa reduzida. Este trabalho teve por objetivo analisar os metabólitos produzidos durante a fermentação alcoólica industrial e que podem ser utilizados pelas bactérias contaminantes, obtendo assim, condições para serem competitivas e persistentes no processo. Para isso, foram utilizadas duas linhagens, isoladas de destilaria e identificadas como L. fermentum (I3a) com metabolismo heterofermentativo obrigatório e L. plantarum (I4a) com metabolismo heterofermentativo facultativo, apresentando nas condições estudadas um metabolismo homofermentativo. Ambas as linhagens foram submetidas ao crescimento na presença do glicerol, malato e piruvato, que são metabólitos produzidos e excretados pela levedura e o manitol produzido e excretado pela bactéria heterofermentativa obrigatória. Foi observado que o metabólito manitol é uma eficiente fonte de carbono para ambas as linhagens proporcionando crescimento mesmo sem a presença de açúcares. Além disso, a combinação entre glicose, frutose, manitol e malato foi capaz de aumentar o crescimento das linhagens. Já a presença do piruvato, apresentou estímulo de crescimento para a linhagem heterofermentativa. Em relação ao consumo, as linhagens foram capazes de metabolizar o manitol, malato e piruvato, entretanto, não apresentaram consumo do glicerol. Com isso, ambas as linhagens são beneficiadas pelo metabolismo da levedura e ainda a heterofermentativa é capaz de reabsorver o manitol quando os açúcares fermentescíveis são esgotados e de disponibilizar o metabólito para uso da homofermentativa. / The characteristics of the Brazilian industrial process to produce bioethanol make the distilleries susceptible to the presence of contaminating microorganisms that cause in the fall of production yield. Among the stages of the process, we have the alcoholic fermentation, which consists in the metabolization of sugars by the yeast strain selected from the Saccharomyces cerevisiae species producing the ethanol. At this stage contamination occurs by yeasts of the genus Saccharomyces, yeasts not Saccharomyces and bacteria. The most commonly found bacteria are those belonging to the group of lactic bacteria (LAB), which, because they use different routes to metabolize sugars, are classified as obligate heterofermentative, obligate homofermentative and facultative heterofermentative. Among the genera of this group, Lactobacillus are the most common because of their ability to tolerate high concentrations of ethanol and sugars, high temperatures and low pH. The species L. fermentum and L. plantarum have been reported in several studies as among the most frequent species contaminating this environment. Lactobacillus contaminants are in constant interaction with the yeast strain which consequently has its fermentative efficiency reduced. This work aimed to analyze the metabolites produced during industrial alcoholic fermentation and that can be used by the contaminating bacteria, thus obtaining conditions to be competitive and persistent in the process. For this, two strains were used, isolated from distillery and identified as L. fermentum (I3a) with obligate heterofermentative metabolism and L. plantarum (I4a) with facultative heterofermentative metabolism, presenting a homofermentative metabolism under the conditions studied. Both strains were submitted to growth in the presence of glycerol, malate and pyruvate, which are metabolites produced and excreted by yeast and mannitol produced and excreted by the obligate heterofermentative bacterium. It was observed that the metabolite mannitol is an efficient source of carbon for both strains providing growth even without the presence of sugars. In addition, the combination of glucose, fructose, mannitol and malate was able to increase strains growth. However, the presence of pyruvate presented growth stimulus for the heterofermentative strain. In relation to consumption, the strains were able to metabolize mannitol, malate and pyruvate, however, they did not present glycerol consumption. Thus, both strains are benefited by yeast metabolism and the heterofermentative can reabsorb mannitol when the fermentable sugars are depleted and to make the metabolite available for homofermentative use.

Dentre as leveduras selvagens mais comumente encontradas na fermentação alcoólica, destaca-se o gênero Saccharomyces apresentando colônias rugosas com células dispostas em cachos (pseudohifas). Este biótipo de levedura tem sempre sido associado com problemas na indústria, ocasionando queda no rendimento fermentativo. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo realizar a caracterização genética, morfo-fisiológica e da resistência ao estresse de linhagens de Saccharomyces cerevisiae que apresentam colônias rugosas e mucosas, buscando alternativas que possam contribuir para o manejo dessas leveduras selvagens (rugosas) na fermentação alcoólica. Foram realizados testes de caracterização para crescimento invasivo, atividade killer, temperatura, pH, concentração de etanol e açúcar, presença de actidione, floculação e capacidade fermentativa, utilizando-se 22 linhagens de leveduras (11 rugosas e 11 mucosas) selecionadas previamente por seqüenciamento da região ITS do DNA ribossomal. O efeito do tratamento ácido em diferentes valores de pH sobre o crescimento de duas linhagens (52 rugosa e PE-02 mucosa) foi também avaliado, seguido do monitoramento do crescimento em meio de caldo de cana após tratamento ácido. Em seguida, testes fermentativos em meio de caldo de cana foram conduzidos em culturas puras e mista dessas linhagens. Os testes de caracterização morfofisiológica mostraram que a invasividade em meio YEPD Agar ocorreu em baixa freqüência dentre as 22 leveduras testadas; dez dentre onze leveduras rugosas apresentaram taxa de floculação expressiva, e entre as mucosas a floculação foi praticamente inexistente; nenhuma das linhagens apresentou produção de toxina killer; as linhagens com colônias rugosas apresentaram capacidade fermentativa significativamente inferior às linhagens com colônias mucosas, em sistema de batelada com ciclo único de 48 horas em meio de caldo de cana, demonstrando velocidade mais lenta de fermentação. Quanto à resistência ao estresse por temperatura, pH, etanol e concentração de açúcar, as linhagens mucosas tiveram maior resistência à acidez do meio, enquanto as linhagens rugosas foram mais resistentes às concentrações elevadas de etanol e açúcar. Nenhuma levedura foi resistente ao actidione. A análise genética, através dos loci microssatélites, revelou a presença de dois grupos principais relacionados geneticamente, sendo o primeiro ramo constituído principalmente de colônias rugosas (67%), contendo, no entanto, a linhagem PE-02, apresentando linhagens com alta taxa de floculação e tolerância às altas concentrações de açúcar e etanol; o outro grupo (com três subgrupos) compreendeu principalmente colônias mucosas, apresentando pouca resistência às situações estressantes aqui estudadas. A levedura com colônia rugosa (linhagem 52) foi bastante afetada pelo tratamento ácido em valores de pH 1,0 e 1,5, ao contrário da levedura com colônia mucosa (PE-02). A fermentação em sistema de batelada com reciclo celular e tratamento ácido conduzido em pH 1,5 teve efeito sobre o crescimento da levedura rugosa quando em cultura mista com a levedura mucosa, não resultando em prejuízo à eficiência fermentativa, quando comparada com a cultura pura da PE-02. Em cultura pura da levedura rugosa, constatou-se eficiência fermentativa por volta de 60%, confirmando o baixo desempenho destas leveduras. O conhecimento das respostas das leveduras rugosas 12 às situações estressantes pode ajudar a manejar a fermentação alcoólica para minimizar o efeito da levedura contaminante. / Among the wild yeasts more commonly found in the alcoholic fermentation, wrinkled colonies with pseudohyphal morphology belonging to Saccharomyces genus are highlighted. This yeast biotype has been associated with industrial problems, resulting in the decrease of the fermentative yield. In this context, this work aimed to perform the genetic, morphological/physiological characterization and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae strains which exhibited wrinkled and mucous colonies, searching for alternatives that could contribute to the management of these wild yeasts (wrinkled colonies) in the alcoholic fermentation. Characterization tests for invasiveness in Agar medium, killer activity, temperature, pH, ethanol and sugar concentration, actidione, flocculation and fermentative capacity were carried out with 22 strains (11 wrinkled and 11 mucous colonies), which were screened previously by the sequencing of the ITS region of the ribosomal DNA. The effect of the acid treatment using different pH values over the growth of two strains (52 wrinked and PE-02 mucous) was also evaluated, following the growth monitoring in sugar cane juice after acid treatment. Fermentative tests in sugar cane juice were carried out with pure and mixed cultures of these strains. The morphological/physiological tests showed that the invasiveness in YEPD Agar medium occurred in low frequency among the 22 strains tested; ten out of eleven wrinked yeasts exhibited expressive flocculation, and among the mucous, the flocculation was near zero; none of the strains showed killer activity; the wrinkled colonies presented lower fermentative capacity comparing to mucous colonies, in a 48- hour cycle in batch system using sugar cane juice, with slower fermentation rate. Concerning the resistance to temperature, pH, ethanol and sugar concentration, the mucous colonies were more resistant to low pH, while the wrinkled colonies were more resistant to the elevated ethanol and sugar concentrations. None of the yeasts were resistant to actidione. The genetic analysis by microsatellite loci revealed the presence of two main genetic related groups, the first branch comprised mainly of wrinkled colonies (67%), containing however the PE-02 strain, showing strains with high flocculation rate and tolerance to high concentration of sugar and ethanol; the other group (with three subgroups) comprised mainly mucous colonies, showing lower resistance to the stressing conditions here studied. The yeast with wrinkled colony (strain 52) was severely affected by the acid treatment in pH values of 1.0 and 1.5, but the same did not occur with the mucous colony (PE-02). The batch fermentation with cell recycle and acid treatment in pH 1.5 had effect over the wrinkled yeast growth when in mixed culture with the mucous yeast, and did not impair the fermentative efficiency comparing to the pure culture of PE-02. In pure culture with the wrinkled colony, a fermentative efficiency as low as 60% was observed, confirming the low performance of these yeasts. The knowledge of the response to stressful conditions exhibited by the yeasts with wrinkled colonies can help to manage the alcoholic fermentation in order to minimize the effect of the contaminant yeast.

Durante o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae em meios contendo sacarose, a enzima invertase hidrolisa a sacarose no ambiente extracelular em glicose e frutose, as quais são posteriormente captadas pelas células por difusão facilitada. Num trabalho prévio, a localização da enzima invertase foi modificada nesta levedura, eliminando-se a forma extracelular e superexpressando-se a forma intracelular da enzima (Stambuk et al., 2009). Como resultado, a captação de sacarose por esta linhagem modificada (iSUC2) é realizada pelo co-transporte ativo com íons H+, implicando no gasto de 1 mol de ATP para cada mol de H+ extrudado pelas células para manutenção do pH intracelular. Como forma de compensar este gasto energético, espera-se que a linhagem iSUC2 desvie uma maior parte do fluxo de carbono para a geração de energia e, consequentemente, para a formação de etanol, em relação a uma linhagem selvagem. No presente trabalho, uma avaliação fisiológica quantitativa de uma linhagem com esta modificação genética foi realizada tanto em quimiostatos limitados por sacarose, como em cultivos descontínuos com sacarose como única fonte de carbono. Os dados obtidos em quimiostatos anaeróbios demonstram que na linhagem iSUC2 a enzima invertase ficou retida no ambiente intracelular e apresentou atividade absoluta total cerca de duas vezes maior que na linhagem-referência (SUC2). Além disto, verificou-se um aumento de 4% no fator de conversão de sacarose a etanol (Y ETH/S), em relação à linhagem SUC2. No entanto, como foi observado que cerca de 8 % da sacarose não foi consumida pelas células da linhagem iSUC2 durante o estado-estacionário dos quimiostatos anaeróbios, decidiu-se melhorar a capacidade do transporte ativo deste dissacarídeo nesta linhagem através de uma estratégia de engenharia evolutiva caracterizada pelo cultivo destas células em quimiostatos longos limitados por sacarose, em anaerobiose. Obteve-se assim, após cerca de 60 gerações, uma linhagem mutante (iSUC2 evoluída) com atividade de transporte de sacarose 20 vezes superior à linhagem iSUC2, sendo capaz de consumir toda a sacarose do meio de cultivo. Esta linhagem apresentou um aumento de 11% no YETH/S e uma diminuição de 27% no fator de conversão de sacarose a células (YX/S), quando comparada à linhagem-referência. A análise do transcriptoma revelou o aumento da expressão de vários genes codificadores de transportadores de hexoses, bem como genes relacionados ao metabolismo de maltose, incluindo o gene do transportador de alta-afinidade para alfa-glicosídeos AGT1, quando a linhagem iSUC2 evoluída foi comparada à linhagem iSUC2. Detectou-se que a evolução em quimiostato resultou na duplicação do gene AGT1, sem que houvesse mutação neste gene. Através da superexpressão do gene AGT1 na linhagem iSUC2, conseguiu-se gerar uma linhagem que apresentou YETH/S muito próximo ao da linhagem iSUC2 evoluída. No entanto, outros parâmetros fisiológicos, foram diferentes nestas duas linhagens, indicando que a duplicação do gene AGT1 não foi a única mutação que ocorreu durante o processo de evolução em quimiostato. Este trabalho ilustra o potencial da combinação entre engenharia metabólica e engenharia evolutiva para a obtenção de linhagens de levedura melhoradas, para aplicação na produção industrial de etanol combustível a partir de meios contendo sacarose. / When growing on sucrose-containing substrates, Saccharomyces cerevisiae secretes invertase that hydrolyses sucrose into glucose and fructose, which are subsequently assimilated by facilitated diffusion. In a previous work, the cellular location of invertase in yeast was modified, by eliminating the extracellular form of the enzyme and over-expressing the intracellular one (Stambuk et al., 2009). As a result, sucrose uptake by this modified strain (iSUC2) occurs by an active H+-sucrose symport system, in which 1 ATP needs to be used by the cells to extrude the proton co-transported. In order to compensate for this, it is expected that these cells will deviate a higher proportion of the carbon flow towards energy generation, and consequently to ethanol formation, in comparison with the wild-type phenotype (SUC2). In the present work, a quantitative physiological evaluation of the iSUC2 strain was performed in both batch and chemostat cultures. Cells from the iSUC2 strain harvested from steady-state anaerobic sucrose-limited chemostats retained all invertase intracellularly and showed a 2-fold higher total invertase activity, when compared to the SUC2 strain grown under identical conditions. Besides this, the ethanol yield on sucrose in the former cells was 4% higher than in the latter case. However, due to the high levels of residual sucrose during these cultivations with the iSUC2 strain, we attempted to improve the transport capacity in the iSUC2 strain by evolutionary engineering. After 60 generations of cultivation in an anaerobic sucrose-limited chemostat, an evolved strain was selected, which presented a 20-fold increase in the sucrose transport capacity, when compared with the parental strain (iSUC2), leading to almost no residual sucrose. During growth of this evolved strain in anaerobic sucrose-limited chemostats, the ethanol yield on sucrose was 11% higher and the biomass yield on sucrose was 27% lower, when compared with the SUC2 strain. Transcriptome analysis revealed an increase in the expression level of several hexose transporters, as well as many MAL-related genes, including the gene for the high-affinity permease AGT1. Indeed, it was verified that this gene was duplicated during the evolution experiment, but no point mutation was detected. By over-expressing the AGT1 gene in the iSUC2 strain, it was possible to attain a similar ethanol yield on sucrose, when compared to the evolved iSUC2 strain. However, several other physiological parameters were different in both strains, indicating that the AGT1 gene duplication was not the only mutation that occurred during evolution in the chemostat. To conclude, this work illustrates that the combination of metabolic and evolutionary engineering is a powerful strategy to obtain improved sucrose-fermenting yeast strains.

As microalgas são conhecidas pela sua elevada capacidade fotossintética e pela produção de compostos de alto valor agregado. Nutrientes essenciais como nitrogênio e carbono, a intensidade da luz e a temperatura são responsáveis por mudanças substanciais na produção de biomassa e compostos de interesse. Este trabalho teve como objetivo estudar os fatores como concentração de nitrogênio, variação da temperatura, regime de iluminação e regime de operação do fotobiorreator (batelada, batelada repetida e contínuo) que afetam a formação e a composição da biomassa (proteínas, lipídeos, carboidratos, ácidos graxos e carotenoides) da microalga Heterochlorella luteoviridis e desenvolver um sistema de cultivo para a utilização do CO2 formado durante a fermentação alcoólica na produção de vinho. Primeiramente foram avaliados os efeitos da temperatura (22 °C a 32 °C) e concentrações de nitrogênio (75 mg L-1 a 375 mg L-1 NaNO3) sobre a formação de biomassa H. luteoviridis e sua composição química. A concentração de nitrogênio e a temperatura influenciaram no teor de carboidratos, carotenoides e proteínas, contudo não afetaram o perfil qualitativo de carotenoides e ácidos graxos. A maior concentração de biomassa (3,35 g L-1) foi obtida com a maior concentração de nitrogênio testada. Mantendo-se a temperatura fixa (27 °C) realizaram-se cultivos com concentração de nitrogênio entre 300 mg L-1 e 750 mg L-1 NaNO3. A máxima produção de biomassa (5,26 g L-1) e carotenoides (2,06 mg g-1) foi obtida com concentração de nitrogênio de 650 mg L-1 NaNO3. As cinéticas de crescimento e consumo de nitrogênio em batelada foram ajustadas a modelos fenomenológicos. O modelo matemático proposto neste trabalho mostrou o melhor ajuste para biomassa (R2 = 0,994) e consumo de nitrogênio (R2 = 0,996). A partir deste modelo foram realizadas simulações de cultivo em modo de operação batelada repetida e contínuo com diferentes taxas de diluição e os cultivos com as maiores produtividades de biomassa preditas foram validados experimentalmente. As culturas em batelada repetida apresentaram produtividade de biomassa menor que a predita, enquanto que a contínua apresentou produtividade similar à predita pelo modelo (1,09 ± 0,01 g L-1 d-1). Os cultivos em batelada-repetida e contínuo apresentaram biomassa com maiores teores de proteínas, ácidos graxos poli-insaturados ômega 3 e carotenoides quando comparados à batelada. O cultivo contínuo foi repetido utilizando CO2 proveniente da fermentação alcoólica da produção de vinho como fonte de carbono, o qual apresentou comportamento similar ao cultivo com a CO2 comercial. Por fim, avaliou-se os efeitos da intensidade e dos comprimentos de onda da luz no crescimento e na composição da microalga H. luteoviridis. As culturas iluminadas por LED brancos com intensidade máxima de 1500 μmol m-2 s-1 apresentaram maiores produtividades de biomassa (0,29 g L-1 d-1). Comparando culturas iluminadas por LEDs vermelhos e/ou azuis, os primeiros estimularam o crescimento da biomassa enquanto que os últimos estimularam a biossíntese de carotenoides, lipídeos e proteínas. / Microalgae are known for their high photosynthetic activity and by the production of high-value products. Essential nutrients, like nitrogen and carbon, light intensity, and temperature are responsible for substantial changes in biomass and compounds production. This work aimed to study the parameters as concentration of nitrogen, temperature variation, lighting regime and operation regime of the photobioreactor (batch, repeated-batch and continuous) that affect biomass production and composition (proteins, lipids, carbohydrates, fatty acids and carotenoids) of the microalga Heterochlorella luteoviridis, and to develop an integrated culture system to use the CO2 from alcoholic wine fermentation to grow the microalga. Firstly, the effects of temperature (22 °C to 32 °C) and nitrogen concentration (75 mg L-1 to 375 mg L-1 NaNO3) were evaluated. Both parameters affected carbohydrates, carotenoids and protein contents in the biomass but did not affect the qualitative profile of carotenoids and fatty acids. The highest biomass concentration (3.35 g L-1) was achieved at the highest nitrogen concentration. New cultures were performed using nitrogen concentration between 300 mg L-1 and 750 mg L-1 NaNO3, and keeping temperature fixed at 27 °C. The maximal biomass and carotenoid production, 5.26 g L-1 and 2.06 mg g-1, were achieved using 650 mg L-1 NaNO3. The biomass growth and nitrogen consumption were adjusted by phenomenological models. The model proposed in this work showed the highest adjust for biomass (R² = 0.994) and nitrogen (R² = 9.996) data. This model was used to simulate repeated-batch and continuous cultures using several dilution rates. The cultures with the highest predicted biomass productivities were experimentally validated. The repeated-batch cultures showed lower biomass productivities than the predicted one, while the continuous culture showed biomass productivity similar to the one predicted by the model (1.09 ± 0.01 g L-1 d-1). The biomass resultant from these cultures had higher contents of proteins, omega-3 polyunsaturated fatty acids and carotenoids, compared to the biomass from batch cultures. The continuous culture was repeated using CO2 from wine fermentation as a carbon source. The results were similar to the ones using commercial CO2, showing the feasibility of the integrated process. Finally, the effects of light intensity and wavelength were evaluated on the growth and composition of H. luteoviridis biomass. Cultures illuminated with white LEDs at maximum intensity of 1500 μmol m-2 s-1 showed the higher biomass productivity, 0.29 g L-1 d-1. Comparing cultures illuminated with red and/or blue LEDs, the former stimulated biomass growth and the latter the carotenoid, lipids and protein biosynthesis.

Parte do malte pode ser substituído por adjuntos, que podem ser à base de cereais, ou de carboidratos de origem vegetal. A cana de açúcar constitui-se de uma matéria prima favorável à fermentação alcoólica por ser rica em carboidratos e micronutrientes, e pode ser utilizada como um adjunto do malte. Estudos de fermentação do mosto com este adjunto, na forma de caldo e de melado de cana, foram realizados na Planta Piloto de Bebidas da EEL-USP, e a partir daí, foram feitas análises físico-química, microbiológicas e sensoriais da cerveja obtida, com diferentes proporções de adjunto. As fermentações foram realizadas inicialmente em escala de bancada (1 L), utilizando mostos preparados com caldo ou melado de cana com ou sem diferentes tratamentos de clarificação, em duas concentrações diferentes (25% e 50% de caldo ou melado), além do mosto puro malte. Análises de concentração e viabilidade celular, pH, consumo de extrato e formação de etanol foram realizadas ao longo das fermentações e, também foi efetuado o cálculo de produtividade e rendimento. Os ensaios sem tratamento do caldo ou melado foram escolhidos para uma produção em uma escala de 5 L, para que análises físico-químicas e sensorial fossem realizadas. A cerveja elaborada com 25% de melado de cana sem tratamento foi a cerveja mais aceita e foi escolhida para a produção em escala piloto (200 L). Análises físico-químicas e de envelhecimento foram realizadas, e essa cerveja também foi avaliada sensorialmente juntamente com duas cervejas de mercado, onde novamente foi declarada como a mais aceita, mostrando que o melado de cana é um adjunto adequado na fabricação de cervejas, mostrando ser um potencial no mercado de bebidas. Finalmente, cervejas com melado de cana foram elaboradas na forma ale e lager em uma infra-estrutura bem equipada em um laboratório em uma universidade belga. / Part of malted barley can be replaced by adjuncts, which can be from cereals, or carbohydrates of vegetable origin. Sugarcane is a raw material favorable to the alcoholic fermentation to be rich in carbohydrates and micronutrients, and can be used as a adjunct. The wort fermentation studies with this adjunct in the form of sugarcane juice and sugarcane syrup, were performed in the Beverage Pilot Plant EEL-USP, and from there, it were made physical-chemical, microbiological and sensorial analysis with beers with different proportion of adjuncts. The fermentations were initially carried out in laboratory scale (1 L) prepared with sugarcane juice or sugarcane syrup in different treatments and in two different concentrations (25% and 50%), and also 100% of malt wort. Analysis of cell concentration and viability, pH, extract consumption and ethanol formation were held throughout the fermentations and also calculation of the productivity and yield. Assays with sugarcane juice and syrup without treatment were selected for production on a slightly larger scale (5L) and physico-chemical and sensorial analyzes were performed. Beer made with 25% of sugarcane syrup without treatment was a beer more accepted and it was chosen for the production on a pilot scale (200 L). Physico-chemical and aging analyzes were performed, and that beer was also evaluated by sensory analyzis compared with two beer market, where again it was declared as the most accepted, showing that the sugarcane syrup is a very interesting adjunct in the manufacture of beer, showing a potential in the beverage market. Finally, beers with sugarcane syrupo were prepared in ale and lager form in a well-equipped infrastructure in a laboratory in a Belgian university.

A atual demanda mundial para redução nas emissões de dióxido de carbono vem aumentando e o uso de etanol como combustível tem sido considerado como uma boa alternativa. Entretanto as condições de cultivo da levedura obrigam o micro-organismo a lidar com diferentes estressores, sendo as altas temperaturas e elevadas concentrações de etanol exemplos dos mais limitantes durante o processo produtivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo encontrar mutantes de Saccharomyces cerevisiae que apresentassem maior resistência a altas concentrações de etanol e altas temperaturas concomitantemente. Para isso, utilizamos como modelo a coleção YKO (Invitrogen®), que contém 4,828 linhagens mutantes para genes não essenciais na levedura. Primeiramente, estabelecemos as condições de estresse (concentração de etanol e temperatura) as quais se mostrassem limitantes para o crescimento da linhagem isogênica selvagem (BY4741). Foram estabelecidas as condições de estresse em 10% de etanol em conjunto com aumento de temperatura para 37ºC, que foram então utilizadas para testar a tolerância das linhagens mutantes agrupadas em 53 pools. Foram identificadas as linhagens mutantes para as ORFs UBP15, THI12, CLA4, DIT1 e MTC7 que suportaram tais condições, se mostrando possíveis candidatos para melhora genética em linhagens industriais como PE2 e CAT1. / The current world demand for reduced emissions of carbon dioxide is increasing the use of ethanol as a fuel has been considered as a good alternative. However culture conditions requiring the yeast micro-organism to cope with different stressors, as the high temperatures and high concentrations of ethanol the most lititant examples during the production process. Thus, the present study aimed to find Saccharomyces cerevisiae mutants that having greater resistance to high ethanol concentrations and high temperatures concurrently. For this, we use a model collection YKO (Invitrogen®) which contains 4.828 mutant strains for non-essential genes in yeast. First, we establish the stress conditions (ethanol concentration and temperature) which would prove limiting to the growth of the isogenic wild type (BY4741). Were established stress conditions in 10% ethanol together with temperature rise to 37ºC, which were then used to test the tolerance of mutant strains grouped into 53 pools. The mutant lines were identified for UBP15, THI12, CLA4, DIT1 and MTC7 ORFs who endured such conditions are showing possible candidates for genetic improvement in industrial strains as PE2 and CAT1.

O presente estudo relata a avaliação da metodologia de microplaqueamento em gotas como uma forma alternativa para contagem da bactéria Lactobacillus fermentum CCT 1407 em cultura isolada, ou em cultura mista com Saccharomyces cerevisiae, utilizando o meio de cultivo MRS e actidiona como inibidor da levedura. A análise dos resultados revelou que a metodologia de microplaqueamento em gotas foi equivalente ao plaqueamento em profundidade, o qual é a metodologia rotineiramente utilizada. Este trabalho também relata o comportamento das linhagens Fleischmann, PE-2 e M-26 quando em cultivo misto com a bactéria L. fermentum CCT 1407 durante seis reciclos fermentativos realizados com mosto composto de 30% de melaço e 70% caldo de cana, incubados à temperatura de 32 o C. Foi utilizada a análise de variância para analisar as variáveis e análise sob o esquema parcelas subdivididas no tempo em delineamento blocos ao acaso. Os resultados obtidos mostram que ocorreram reduções de viabilidade nos tratamentos realizados com a linhagem Fleischmann promovendo um estímulo à multiplicação bacteriana, porém, os tratamentos com a linhagem PE-2 apresentaram menores reduções de viabilidade e o estímulo à multiplicação bacteriana foi menor. Ao comparar a o comportamento das linhagens M-26 e PE-2 durante a fermentação em cultivo misto com L. fermentum CCT 1407 não houve diferença estatística significativa, através do teste F, para os seguintes parâmetros: viabilidade celular, rendimento fermentativo, teor alcoólico, massa microbiana e glicerol, sendo detectada diferença significativa para os parâmetros contaminação bacteriana e pH do vinho delevurado. Para o início do experimento comparativo entre as linhagens M-26 e PE-2 foi inoculada a bactéria (1,5.10 6 UFC.mL -1 ) e ao final do sexto ciclo as contaminações foram 3,3.10 7 UFC.mL -1 e 6,0.10 7 UFC.mL -1 nos tratamentos realizados com as linhagens M-26 e PE-2, respectivamente. O aumento da contaminação bacteriana estimulou a formação de glicerol. O teor de trealose apresentou relação positiva com a viabilidade sendo considerado um indicador das condições fisiológicas da levedura, independentemente da linhagem avaliada. / The present study reports the evaluation of pour plate method in drops as an alternative to count the bacteria L. fermentum CCT 1407 in isolated culture, or in mixed culture with Saccharomyces cerevisiae, using the means of cultivation MRS and actidiona as inhibitor of yeast. The analysis of the results revealed that the pour plate method was equivalent to the in depth plate method, which is the methodology most commonly used. This study also presents the behavior of the strain Fleischmann, PE-2 and M-26 when in mixed culture with the bacteria L. fermentum CCT 1407 for six fermentative re cycles accomplished with composed must of 30% of molasses and 70% cane broth, incubated to the temperature of 32 o C. The variance analysis was used to analyze the variables. The obtained results show viability reductions in the treatments accomplished with the strain Fleischmann promoting bacterial multiplication, even so, the treatments with the strain PE-2 presented smaller viability reductions and the incentive to the bacterial multiplication was also smaller. When comparing the behavior of the both strains, M-26 and PE-2, during the fermentation in mixed cultivation with L. fermentum CCT 1407 there was no significant statistical difference, according to the results of the test F, for the following parameters: cellular viability, fermentative output, alcohol content, microbial mass, and glycerol. Significant difference was just detected for the parameters of bacterial contamination and pH of the wine. For the beginning of the first fermentative cycle it was inoculated 1,5.10 6 UFC.mL -1 and at the end of the sixth cycle the contamination was 3,3.10 7 UFC.mL -1 and 6,0.10 7 UFC.mL -1 in the treatments accomplished with the strains M-26 and PE-2, respectively. The increase of bacterial contamination stimulated the glycerol formation and the trehalose content-presented positive relationship with the viability being considered an indicator of the physiologic conditions of the yeast, regardless the appraised yeast strains.