Köln, Univ., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

Köln, Univ., Diss., 2001. / Computerdatei im Fernzugriff.

Köln, Universiẗat, Diss., 2001.

Zugl.: Bayreuth, Universiẗat, Diss., 2009.

Universiẗat, Diss., 2003--Dortmund.

4 ABSTRACT Development and testing of novel non-toxic electrode materials, detection arrangements and analytical methods applicable in determination of selected agrochemicals is the main aim of this Ph.D. Thesis. New working electrodes based on silver solid amalgam paste (AgSA-PE) with organic pasting liquid and other based on crystallic silver amalgam (CAgAE) were developed, their electrochemical behaviour investigated and further used in voltammetric determination of widespread and toxic environmental pollutant 4-nitrophenol (4-NP). This analyte could be determined by DPV at AgSA-PE with limit of detection (LD) 1×10í6 mol lí1 and using CAgAE with LD 4×10í7 mol lí1 , both in 0.2 mol lí1 acetate buffer pH 4.8. Attempts to decrease LDs by utilization of adsorptive stripping voltammetry were not successful in either case. Crystallic silver amalgam was also successfully used for construction of microcylindric flow-through cell and tested for amperometric determination of nitrophenol mixture in HPLC-ED system. Both novel electrodes were found to be suitable alternatives to toxic mercury electrodes and the CAgAE seems to be promising working electrode for flowing systems. Method for sample preparation and voltammetric determination of broad-spectrum herbicide Glyphosate in contaminated soil samples was also...

This work deals with fabrication and test of microfluidic chip for separating substances. For separation of substances is used electrophoresis and detection is by integrated electrodes.

Das dopaminerge und das serotonerge Transmissionssystem sind zwei wichtige Transmissionssysteme, die in eine Vielzahl von Krankheiten des ZNS involviert sind. Es ist gut bekannt, daß eine enge Interaktion zwischen beiden Systemen stattfindet. Krankheiten des ZNS, die sich auf umschriebene Veränderungen zurückführen lassen, haben durch die Interaktionen von Transmissionssystemem weitreichende Folgen auf verschiedene Bereiche des Gehirns. Neuere Therapien machen sich diese Interaktionen zunutze, um in das Krankheitsgeschehen einzugreifen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Reaktion des dopaminergen Systems auf eine genetische Veränderung im serotonergen System untersucht. Die untersuchten transgenen Tiere besaßen ein Gensequenz, die für eine Antisense-m-RNA gegen die m-RNA der TPH kodierte. Die TPH katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Serotoninbiosynthese. Zur Charakterisierung des dopaminergen Systems wurden die Freisetzung und die hochaffine Wiederaufnahme durch den DAT als Parameter ausgewählt. Die Freisetzung aus Synaptosomenpräparationen war bei den transgenen Tieren signifikant gegenüber den nicht-transgenen Tieren erniedrigt. Bei der hochaffinen Wiederaufnahme ließen sich keine Unterschiede zwischen transgenen und nicht-transgenen Tieren feststellen. Die beobachtete Erniedrigung der Freisetzung bestätigt die Erkenntnisse einer Vielzahl von Studien, die einen stimulatorischen Einfluss von Serotonin auf das dopaminerge System beschreiben. / The dopaminergic and the serotonergic transmission systems are two important systems that are involved in a great number of central nervous system (CNS) diseases. It has long been known that a close interaction exists between them. Due to the interactions of transmission systems diseases of the CNS located on a identifiable spot have far-reaching consequences on other systems. Newer therapies take advantage of these interactions in order to interfere with the pathologic process. This study was performed to investigate how the dopaminergic system reacts to a alteration in the serotonergic system. The observed transgenic animals carried the gene for an antisense-construct against the m-RNA of tryptophahydroxylase (TPH). TPH catalyzes the rate limiting step in serotonin biosynthesis. In order to characterize the dopaminergic system 2 parameters were chosen: dopamine release and dopamine high affinity reuptake. The following results were obtained: Release of dopamine from synaptosomal preparations was decreased significantly in comparison to non-transgenic control animals. No difference concerning high affinity dopamine reuptake measured by continuous potential amperometry was noted. The findings concerning release of dopamine are in line with studies describing a facilitatory effect of serotonin on the dopaminergic system.

Hämoglobin-A1c (HbA1c) ist ein Hämoglobin (Hb)-Subtypus, der durch nicht-enzymatische Glykierung des N-terminalen Valinrestes der Hämoglobin-beta-Kette entsteht. Das gemessene Verhältnis von HbA1c zum Gesamt-Hämoglobin (5-20 % bei Diabetikern) repräsentiert den Mittelwert der Blutglucosekonzentration über einen zweimonatigen Zeitraum und stellt zur Beurteilung der diabetischen Stoffwechsellage eine Ergänzung zur Akutkontrolle der Glukosekonzentration dar.<br /> Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen amperometrischen Biosensor für die Bestimmung des medizinisch relevanten Parameters HbA1c zu entwickeln. Durch Selektion geeigneter Bioerkennungselemente und deren Immobilisierung unter Erhalt der Bindungsfunktion für die Zielmoleküle Hämoglobin bzw. HbA1c wurden spezifische, hochaffine und regenerationsstabile Sensoroberflächen geschaffen. Für die Entwicklung des HbA1c-Biosensors wurden zwei Konzepte - Enzymsensor und Immunosensor - miteinander verglichen. <br /> Die enzymatische Umsetzung von HbA1c erfolgte mit der Fructosylamin Oxidase (FAO) aus Pichia pastoris N 1-1 unter Freisetzung von H2O2, welches sowohl optisch über eine Indikatorreaktion als auch elektrochemisch nach Einschluss der FAO in PVA-SbQ und Fixierung des Immobilisats vor einer H2O2-Elektrode nachgewiesen wurde. Die Kalibration des Enzymsensors mit der HbA1c-Modellsubstanz Fructosyl-Valin ergab Nachweisgrenzen, die ausserhalb des physiologisch relevanten HbA1c-Konzentrationsbereich lagen. Aus der Umsetzung von glykierten Peptiden mit einer nicht HbA1c analogen Aminosäurensequenz, z.B. Fructosyl-Valin-Glycin wurde zudem eine geringe HbA1c-Spezifität abgeleitet.<br /> Für den Immunosensor wurden zwei heterogene Immunoassay-Formate unter Verwendung von hochaffinen und spezifischen Antikörpern in Kombination mit Glucose Oxidase (GOD) als Markerenzym zum Nachweis von HbA1c untersucht. Beim indirekt-kompetitiven Immunoassay wurde anstelle des kompletten HbA1c-Moleküls das glykierte Pentapeptid Fructosyl-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin (glkPP) als Kompetitor und Affinitätsligand immobilisiert und so eine regenerierfähige Oberfläche geschaffen. Beim Sandwich-Immunoassay wurde im ersten Schritt Gesamt-Hämoglobin an die mit Haptoglobin (Hp) modifizierte Festphase angereichert und im zweiten Schritt der gebundene HbA1c-Anteil nachgewiesen. <br /> Für die Konstruktion des HbA1c-Immunosensors wurden Affinitätsmatrizen durch Modifizierung von Cellulose-Dialysemembranen mit glkPP bzw. Hp hergestellt. Grundlegend studiert wurde die Aktivierung der Cellulose-Membranen mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) und 1-Cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP) als Aktivierungsagenzien. Eine gerichtete Immobilisierung der Liganden wurde realisiert, indem glkPP über dessen C-Terminus (einzige Carboxylatgruppe) und Hp über dessen periodat-oxidiertem Kohlenhydratrest an die amino- oder hydrazidfunktionalisierte Membranen kovalent gekoppelt wurden. <br /> Mit dem Einsatz der glkPP- und Hp-modifizierten Membranen in der elektrochemischen Messzelle war erstmalig der biosensorische Nachweis von HbA1c möglich. Als Transduktor diente eine Pt-Elektrode, an der das von der GOD generierte H2O2 umgesetzt und ein mit der HbA1c-Konzentration korrelierendes Stromsignal erzeugt wurde. Die Immunosensoren zeigten Ansprechzeiten von 3 s. Mit dem Immunosensor auf Basis des indirekt-kompetitiven Testprinzips wurde eine Kalibrationskurve für HbA1c im Bereich von 0,25-30 &#181;g/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %) mit Assayzeiten von 60 min und mit dem Immunosensor im Sandwich-Format eine Kalibrationskurve im Bereich von 0,5-5 &#181;g/ml (7,8-78 nM; 5-50 % HbA1c vom Gesamt-Hb, CV 6-10 %, 3 h) aufgenommen. / Hemoglobin-A1c (HbA1c) is a hemoglobin subtype formed by non-enzymatic reaction of glucose with the N-terminus of the beta-polypeptide chains. As it reflects the glycemic status of diabetics over the preceding 8-12 weeks, the determination of HbA1c has become an established procedure in the management of diabetes mellitus. It is measured as the percentage of total hemoglobin. Up to 5 % HbA1c are considered as normal whereas in diabetic subjects it could be elevated from 5-20 %. In addition to amperometric biosensors for glucose self monitoring which have been successfully applied in diabetes management, biosensors for HbA1c would be an useful supplement for a comprehensive diabetes control. <br /> <br /> Objective of this work was to develop and compare amperometric biosensors for determination of HbA1c based on enzymatic and immunochemical methods. <br /> <br /> For the enzyme based HbA1c assay a novel fructosamine oxidase (FAO) derived from marine yeast Pichia pastoris, strain N1-1 was utilized. It recognizes and oxidatively degrades fructosyl-valine (FV) which corresponds to the glycated N-terminus of the beta-chain of HbA1c and therefore is regarded as a model compound for HbA1c. Hydrogen peroxide which is liberated by the FAO during FV conversion was indicated optically in a horseradish peroxidase (POD) coupled reaction and electrochemically. For the biosensor the FAO was embedded in polyvinyl alcohol-stylbazole (PVA-SbQ) and fixed it in front of a Pt-electrode. So far, the measuring range of FV did not cover the clinically relevant range of HbA1c. Low specificity was assumed since enzyme activity also was obtained with glycated peptides, e.g. fructosyl-valine-glycine, not corresponding to the glycated N-terminus of the hemoglobin-beta-chain.<br /> <br /> For the immunosensor two immunoassays formats - heterogeneous sandwich and heterogeneous competitive - were tested. The assays were designed as follows: The competitive immunoassay was based on the immobilized synthetic glycated pentapeptide fructosyl-valine-histidine-leucine-threonine-proline (glkPP) utilized as HbA1c analogue. The peptide has an amino acid sequence corresponding to the N-terminus of the hemoglobin beta-chains and is capable for competition together with the HbA1c of the sample for the amount of a glucose oxidase (GOD)-labelled anti-HbA1c antibody. In the sandwich-type assay haptoglobin (Hp), a natural hemoglobin binding molecule with antibody characteristic properties, was used as bioreceptor for enrichment of total hemoglobin onto the surface. In a subsequent step the HbA1c fraction was quantified by a GOD-labelled HbA1c specific antibody. <br /> <br /> Cellulose dialysis membrane was used as the solid support for immobilization of Hp and glkPP near the sensor surface. For activation of the membrane two reagents, 1,1&prime;-carbonyldiimidazole (CDI) and 1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate (CDAP), were compared with respect to the degree of activation and coupling efficiency. Site-directed immobilization of Hp and glkPP was achieved by coupling Hp via its carbohydrate residue and glkPP via its C-terminus to the activated membrane using a bis-amine or bis-hydrazide spacer. <br /> <br /> The affinity membranes were placed in front of a modified Clark-type hydrogen peroxide electrode in an electrochemical measuring cell and HbA1c analysis was carried out within the stirred cell. Detection of the bound GOD-label was achieved by measurement of the electrocatalytic oxidation of hydrogen peroxide at +600 mV vs. Ag/AgCl. The indication was done in only 3 s. For the competitive principle a typical inhibition curve with a linear range between 0,25-30 &#181;g/ml (3,9-465 nM, CV 3-9 %, 60 min per sample) HbA1c was obtained. Due to the high functional stability of the peptide multiple regeneration of the affinity surface was possible without loss of binding capacity. With the sandwich assay configuration the clinically relevant range could easily be covered (calibration curve: 5-50 % HbA1c corresponding to 7,8-78 nM, CV 6-10 %, 3 h per sample).

9 Abstract In this Ph.D. thesis possibilities of using our proposed potential programs for a multiple-pulse amperometry and a fast scan differential pulse voltammetry in combination with flow systems are presented. The development of new sensitive amperometric and voltammetric methods for the determination of oxidisable biologically active organic compounds is another aim of this work. In the first part of the work, the flow injection system and multiple-pulse amperometric detection were employed to develop and optimize a simple, low-cost, and rapid method for the simultaneous determination of natural and synthetic antioxidants. This technique involves the application of an appropriate potential waveform consisting of a suitable sequence of pulses on a single working electrode, thus allowing distinguish the analytes in a mixture with no need of separation. Conditions for the determination of antioxidants and modelling of the potential program were tested and studied, respectively. Second part of the work describes and characterizes the application of the fast scan differential pulse voltammetry (FSDPV) in combination with the flow systems. FSDPV is the electroanalytical technique that use high scan rate to record voltammograms within several milliseconds and ensures high temporal resolution. This technique...