Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-15T13:26:00Z No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:23:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JulianaMayumiHosoume.pdf: 49515490 bytes, checksum: 8ec5b49a63cce2ce425accf5a4c518b7 (MD5) / Anestésicos gerais são diariamente utilizados em uma miríade de procedimentos cirúrgicos. Todavia o intricado mecanismo molecular de ação desses compostos ainda é desconhecido. A hipótese mais creditada sugere uma ação de anestésicos em diferentes canais iônicos de tecidos neurais por interação em múltiplos sítios de ligação nessas proteínas de membrana. Estudos in vitro recentes mostram alteração na condução dos canais de potássio dependentes de voltagem pela ligação de anestésicos halogenados em múltiplas cavidades com distintas afinidades em diferentes conformações. Entre esses canais está o canal iônico dependente de voltagem de mamífero Kv1.2. Foi demonstrado que uma mutação pontual G329T nesse canal iônico confere maior sensibilidade ao anestésico geral sevoflurano. Nesse contexto, a investigação da interação envolve não somente a descoberta de regiões putativas de ligação, como também de que forma essa interação poderia alterar o equilíbrio entre as diferentes conformações do canal iônico. Contudo, a ligação do anestésico pode ser uma condição necessária, mas não suficiente para ter efeito modulatório. Sabese que o sevoflurano, um anestésico inalável, potencializa o canal Kv1.2, deslocando a curva de condutância-voltagem para voltagens mais negativas e aumentando a condutância máxima. Para tanto, foram realizadas simulações de dinâmica molecular do canal Kv1.2 selvagem e do canal Kv1.2 G329T em bicamada lipídica com solvente explícito, a fim de amostrar as flutuações estruturais das conformações aberta e fechada desta proteína. Uma ligeira diminuição da flutuação da cadeia do canal mutante foi conferida por análise de RMSD (Root Mean Square Deviation) e RMSF (Root Mean Square Fluctuation) ao longo das trajetórias. Dessas simulações, foram escolhidos ao acaso 120 frames de cada simulação para a realização de docking molecular por meio do AutoDock Vina, assim obtidos aproximadamente 2400 modos de interação. Após o agrupamento e análise das soluções, foram eleitos os centros das nuvens de soluções de quatro potenciais sítios distintos para estruturar o complexo anestésico-canal e, então, avaliar a afinidade do ligante sítio-específica por cálculos de energia livre baseados em simulações de dinâmica molecular. Pela utilização do método LIE (Linear Interaction Energy), percebeu-se grande afinidade pelo sítio próximo ao filtro de seletividade, de tal forma que este pode estar favorecendo a estabilização da conformação condutiva, logo aumentando a condutância do canal. Pela mutação estar associada com um aumento da constante de equilíbrio para um estado pré-aberto, é proposto que um conjunto de sítios podem estar desestabilizando esse estado. Como resposta ao resultado obtido e pelo desafio em conciliar os resultados microscópicos com o efeito na relação condutância voltagem por anestésico, é apresentado um esquema teórico para avaliar múltiplos estados de ligação. Aqui, é exposta uma perspectiva inicial para uso do modelo teórico apresentado. Ao considerar, por indisponibilidade da definição precisa das outras conformações, apenas as conformações aberta e fechada do canal, além das afinidades obtidas para múltiplos sítios, foi possível calcular as densidades de probabilidades para os estados ligados e, dessa forma, encontrar um deslocamento da curva condutância-voltagem com a mesma tendência ao experimental. Os presentes dados revelam importantes regiões de interação anestésico/proteína e permite a proposição de formas de análise do intricado mecanismo de modulação por ligantes, favorecendo assim futuros estudos experimentais dos mecanismos de ação na anestesia. _____________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / General anesthetics are daily used in a myriad of surgical procedures worldwide. Nevertheless their molecular mechanism of action remains elusive. An accredited hypothesis suggests that anesthetics modulate distinct ion channels in neural tissue by interacting in multiple binding sites in these membrane proteins. New in vitro studies show that halogenated anesthetics modifies the conductance/voltage relation of voltage gated potassium channels by binding to multiple cavities with different affinities in a conformationdependent fashion. Within this context, the present investigation is focused not only on searching the putative binding sites, but also on discovering the manner by which the binding could modify the conformation energy landscape, since the binding of the anesthetic can be a necessary but not sufficient condition to have a modulatory effect. The mammal Kv1.2 channel stands as a potential target of inhalation anesthetics. Sevoflurane, a halogenated anesthetic, potentiates this channel, shifting the conductance/voltage relation leftward and increasing the maximum conductance. Recently, the G329 point mutation in this channel has been associated with an augmentation of the sensitivity to the general anesthetic sevoflurane. To explore this issue, molecular dynamics simulations of the Kv1.2 wild type and Kv1.2 G329T inserted in a phospholipidic membrane with explicit water treatment were performed. The sampling was performed to both open and closed conformations. A slightly reduction of fluctuation near the linker S4-S5 was noticed on the mutant by analysis of RMSF through the simulated trajectory. From these simulations, 120 frames were selected from each construction for running docking calculation. These approach was used in order to account for molecular flexibility of the protein. From the molecular docking applying AutoDock Vina, nearly 2400 binding modes were obtained. After clustering and analysis of solutions, four putative independent binding cavities were selected to construct the anesthetic/channel complex and then ligand site-specific affinities were estimated by free energy calculations based on molecular dynamics simulations. By employing the LIE (Linear Interaction Energy) method, a relative strong affinity by the site near the selectivity filter was noted. The interaction with this site could favor the stabilization of the conductive state, hence increasing the conductance of the channel. Since the G329T mutation is associated with an increased equilibrium constant of the pre-open state, it is proposed that a group of sites could destabilize this state. As an answer to the issue of conciliating the obtained binding affinities with the anesthetic effect on the conductance/voltage relation, it is presented here a theoretic model to evaluate multiple binding states. In an initial attempt to analyze the accuracy of the prediction by the model, considering only the conductive open and closed conformations, since the unavailability of a detailed structure of the other relevant states, besides the calculated binding affinities, it was possible to compute probability densities for the bound states, thus estimating a leftward shift on the conductance-voltage curve. The present data reveals putative anesthetic binding regions and potential binding free energies and allows proposition of a approach to rationalize the complex mechanism of modulation by multiple binding sites with multiple occupancies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-17T18:50:27Z No. of bitstreams: 1 2018_LeonardoCirqueiraPimentel.pdf: 22698391 bytes, checksum: a84e79cda85f13261ade4ac2ccb02f4a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-07-20T21:09:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_LeonardoCirqueiraPimentel.pdf: 22698391 bytes, checksum: a84e79cda85f13261ade4ac2ccb02f4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-20T21:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_LeonardoCirqueiraPimentel.pdf: 22698391 bytes, checksum: a84e79cda85f13261ade4ac2ccb02f4a (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / O uso de anestésicos gerais na medicina é datado em mais de 100 anos. Apesar da evolução da anestesiologia e do uso consolidado dessa classe de fármacos, o mecanismo molecular da anestesia geral ainda é desconhecido. Diversos estudos vêm mostrando que os canais iônicos são os principais alvos dos anestésicos, com um grande número de interações entre ligantes e receptores já caracterizados. Porém, está sendo mostrado que a interação é bastante complexa: existe a presença de múltiplos sítios de ligação, que sofrem influência tanto da concentração de anestésicos quanto da conformação do canal. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a interação do anestésico geral sevoflurano com o canal iônico de potássio dependente de voltagem de mamíferos Kv1.2. Esse par é de muito interesse da medicina atual, pois o sevoflurano é um anestésico bastante utilizado e o Kv1.2 é expresso em neurônios do sistema nervoso central e em células cardíacas, com papel chave em diversos distúrbios. Experimentos de eletrofisiologia mostram que o sevoflurano leva à uma ativação mais precoce dos canais Kv1.2 e causa um aumento na corrente máxima. Muitos trabalhos vêm tentando clarificar quais são os sítios de ligação do Kv1.2, e estudos envolvendo ferramentas computacionais vêm sugerindo uma ligação do sevoflurano ao poro de condução da proteína. Esse sítio precisa ter sua existência validada, afinal a presença do anestésico nesse local pode atrapalhar a função do Kv1.2. Para investigar se a ligação é possível, em um primeiro estudo neste trabalho, foram caracterizadas diversos parâmetros físico-químicos de um segmento de membrana, e na sequência as propriedades da migração do sevoflurano da água para a bicamada lipídica. A energia livre de partição mostrou que o anestésico tem maior afinidade pela região anfifílica do interior da membrana, tornando possível o acesso do sevoflurano aos diversos sítios transmembrânicos sugeridos e reduzindo a probabilidade de acesso aos sítios mais hidratados. Descrições termodinâmicas juntamente com ferramentas computacionais de modelagem molecular permitiram o desenvolvimento de um experimento de competição em condições fisiológicas, que indicaram que a ligação do sevoflurano sob fluxo iônico é pouco provável. Além disso, simulações com voltagem mostraram que mesmo quando ligado ao poro central, o sevoflurano não atrapalha a condução iônica. Esses resultados são de grande importância ao mostrar que a ligação do sevoflurano ao sítio do poro central é uma ligação de pouca probabilidade, e que caso ocorra, o funcionamento do canal não é alterado. / The use of general anesthetics in medicine is dated to more than a hundred years. Despite the anesthesiology evolution and the well-established usage of this drug class, the molecular mechanism of general anesthesia is still unknown. Several studies have been showing that the ion channels are the main targets of anesthetics, with a huge and still growing number of characterized receptor-ligand interactions. However, these interactions are complex: there are multiple binding sites, which are influenced by the anesthetic concentration and the channel conformation. This work main goal was to study the interaction between sevoflurane and the mammal voltage dependant potassium channel Kv1.2. Nowadays medicine is very interested in this interaction pair because sevoflurane is widely used and Kv1.2 is expressed in central nervous system and in heart cells, with a key role in neuronal and cardiac disturbance. Eletrophysiology experiments show that sevoflurane induces an easier channel opening and an increase in Kv1.2 maximum currents. Some studies are trying to clarify what are the binding sites, and a site located in the main pore of the channel is being suggested. This site has to be validated, because the presence of sevoflurane at the main pore of the channel can alter Kv1.2 functioning. To check if binding is possible, in the first part of this work, there was a physico-chemical characterization of a membrane patch, and later a sevoflurane water-membrane migration free-energy description. The partition free-energy variation shows that the anesthetic has more affinity to the inner membrane amphiphilic region, making it possible for sevoflurane to acess several suggested transmembrane sites and reducing binding probabilites to hidrated sites. Thermodinamic descriptions joined with computational tools of molecular modeling allowed to develop a competition experiment under physiological conditions, which showed that sevoflurane binding to the central cavity is less probable. Furthermore, simulations in the presence of voltage showed that sevoflurane bound at the central cavity did not hinder ionic conduction across the channel. These results are very important, because they show that sevoflurane binding to the central pore is a low probability event, and when it occurs, the channel functioning is not altered.