O processo de biomineralização óssea é a deposição de cristais de fosfato de cálcio, na forma de hidroxiapatita formando o tecido ósseo. São mediados pelas vesículas da matriz (MVs) que são liberadas no local específico do início da biomineralização. As MVs contêm altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Para que isso ocorra corretamente são necessárias diversas proteínas/enzimas, bem como microambientes com condições específicas. Neste trabalho uma atenção especial foi dada a duas proteínas presentes nas MVs: Anexina V (AnxA5) e a nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase-1 (NPP1). A Anexina V é responsável pela formação de um canal de cálcio por meio da associação desta proteína tanto com a face externa quanto interna da membrana das MVs. A NPP1 possui a função principal de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP), formando adenosina monofosfato (AMP) e pirofosfato (PPi). Assim, experimentos de expressão de Anexina V e NPP1 foram realizados com o intuito de iniciar os estudos de interação entre as duas proteínas, por meio de reconstituição em lipossomos. A expressão de Anexina V foi realizada em células E. coli BL21(DE3) e induzida por isopropil -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG); para purificação, três procedimentos foram necessários, utilizando coluna de níquel, coluna Desalting e coluna de troca iônica (Mono-Q). Experimentos de dicroísmo circular foram realizados com amostras de Anexina V após purificação e mostraram que todas as amostras apresentavam estruturas em -hélice. Pelo método da gota pendente foi estudada a interação de Anexina V com íons Ca2+ (10 mM) em monocamadas constituídas por dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e de uma mistura de composição lipídica 9:1 de DPPC e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS). Os dados obtidos mostraram alta afinidade de Anexina V por monocamadas constituídas de (9:1) DPPC:DPPS na presença de íons Ca2+. A expressão de NPP1 foi realizada com transfecção por meio de eletroporação do DNA recombinante em células COS-1, e seleção com antibiótico G418 após 24 horas de cultivo. Amostras de fração de membrana controle e NPP1 recombinante foram preparadas após 60 horas de cultivo celular e foi observada atividade catalítica na amostra de fração de membrana da NPP1. Todas as amostras de expressão, tanto de Anexina V e NPP1, foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. A padronização da Anexina V foi obtida com sucesso, porém com relação à NPP1, experimentos ainda devem ser realizados a fim de padronizar a obtenção desta proteína recombinante em quantidade suficiente para continuar os estudos. / The bone biomineralization process is the deposition of calcium phosphate crystals in the form of hydroxyapatite forming the bone tissue. They are mediated by matrix vesicles (MVs) that are released at the specific site of the onset of biomineralization. MVs contain high concentrations of Ca2+ ions and inorganic phosphate (Pi), providing a suitable microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. To occur properly, several proteins/enzymes are needed, as well as microenvironments with very particular conditions. In this work, special attention should be given to two proteins present in the MVs: Annexin V (AnxA5) and nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase (NPP1). Annexin V is responsible for the formation of a calcium channel through the association of this protein with both the outer and the inner face of the MVs membrane. NPP1 has the main function of hydrolyzing adenosine triphosphate (ATP), adenosine monophosphate (AMP) and pyrophosphate (PPi).Thus, experiments of expression of Annexin V and NPP1 were performed with the aim of initiating the interaction studies between the two proteins, through reconstitution in liposomes. Annexin V expression was performed in E.coli BL21 (DE3) and the cells were induced by isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG); for purification, three procedures were required using a nickel column, a Desalting column and an ion exchange column (Mono-Q). Circular dichroism experiments were performed with Annexin V samples after purification and showed that all samples contain -helix structures. Using the pendant drop method, the interaction of Annexin V with (10 mM) Ca2+ ions was studied in monolayers composed of dipalmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC) and a mixture of lipid composition 9:1 DPPC and dipalmitoyl-phosphatidyl-serine (DPPS). Data showed high affinity of Annexin V by monolayers constituted of (9: 1) DPPC:DPPS in the presence of Ca2+ ions. NPP1 expression was performed with transfection by electroporation of the recombinant DNA into COS-1 cells and selection with G418 antibiotic after 24 hours of culture. Samples of the control membrane fraction and recombinant NPP1 were prepared and the activity of the membrane fraction of NPP1 was observed in the samples. All expression samples, both AnxA5 and NPP1, were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The standardization of Annexin V has been obtained with success, but regarding NPP1, experiments have yet to be performed to standardize the production of this recombinant protein and to obtain enough quantity to continue the study.

O processo de biomineralização óssea é a deposição de cristais de fosfato de cálcio, na forma de hidroxiapatita formando o tecido ósseo. São mediados pelas vesículas da matriz (MVs) que são liberadas no local específico do início da biomineralização. As MVs contêm altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato inorgânico (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Para que isso ocorra corretamente são necessárias diversas proteínas/enzimas, bem como microambientes com condições específicas. Neste trabalho uma atenção especial foi dada a duas proteínas presentes nas MVs: Anexina V (AnxA5) e a nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterase-1 (NPP1). A Anexina V é responsável pela formação de um canal de cálcio por meio da associação desta proteína tanto com a face externa quanto interna da membrana das MVs. A NPP1 possui a função principal de hidrolisar adenosina trifosfato (ATP), formando adenosina monofosfato (AMP) e pirofosfato (PPi). Assim, experimentos de expressão de Anexina V e NPP1 foram realizados com o intuito de iniciar os estudos de interação entre as duas proteínas, por meio de reconstituição em lipossomos. A expressão de Anexina V foi realizada em células E. coli BL21(DE3) e induzida por isopropil -D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG); para purificação, três procedimentos foram necessários, utilizando coluna de níquel, coluna Desalting e coluna de troca iônica (Mono-Q). Experimentos de dicroísmo circular foram realizados com amostras de Anexina V após purificação e mostraram que todas as amostras apresentavam estruturas em -hélice. Pelo método da gota pendente foi estudada a interação de Anexina V com íons Ca2+ (10 mM) em monocamadas constituídas por dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e de uma mistura de composição lipídica 9:1 de DPPC e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS). Os dados obtidos mostraram alta afinidade de Anexina V por monocamadas constituídas de (9:1) DPPC:DPPS na presença de íons Ca2+. A expressão de NPP1 foi realizada com transfecção por meio de eletroporação do DNA recombinante em células COS-1, e seleção com antibiótico G418 após 24 horas de cultivo. Amostras de fração de membrana controle e NPP1 recombinante foram preparadas após 60 horas de cultivo celular e foi observada atividade catalítica na amostra de fração de membrana da NPP1. Todas as amostras de expressão, tanto de Anexina V e NPP1, foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. A padronização da Anexina V foi obtida com sucesso, porém com relação à NPP1, experimentos ainda devem ser realizados a fim de padronizar a obtenção desta proteína recombinante em quantidade suficiente para continuar os estudos. / The bone biomineralization process is the deposition of calcium phosphate crystals in the form of hydroxyapatite forming the bone tissue. They are mediated by matrix vesicles (MVs) that are released at the specific site of the onset of biomineralization. MVs contain high concentrations of Ca2+ ions and inorganic phosphate (Pi), providing a suitable microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. To occur properly, several proteins/enzymes are needed, as well as microenvironments with very particular conditions. In this work, special attention should be given to two proteins present in the MVs: Annexin V (AnxA5) and nucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase (NPP1). Annexin V is responsible for the formation of a calcium channel through the association of this protein with both the outer and the inner face of the MVs membrane. NPP1 has the main function of hydrolyzing adenosine triphosphate (ATP), adenosine monophosphate (AMP) and pyrophosphate (PPi).Thus, experiments of expression of Annexin V and NPP1 were performed with the aim of initiating the interaction studies between the two proteins, through reconstitution in liposomes. Annexin V expression was performed in E.coli BL21 (DE3) and the cells were induced by isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG); for purification, three procedures were required using a nickel column, a Desalting column and an ion exchange column (Mono-Q). Circular dichroism experiments were performed with Annexin V samples after purification and showed that all samples contain -helix structures. Using the pendant drop method, the interaction of Annexin V with (10 mM) Ca2+ ions was studied in monolayers composed of dipalmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC) and a mixture of lipid composition 9:1 DPPC and dipalmitoyl-phosphatidyl-serine (DPPS). Data showed high affinity of Annexin V by monolayers constituted of (9: 1) DPPC:DPPS in the presence of Ca2+ ions. NPP1 expression was performed with transfection by electroporation of the recombinant DNA into COS-1 cells and selection with G418 antibiotic after 24 hours of culture. Samples of the control membrane fraction and recombinant NPP1 were prepared and the activity of the membrane fraction of NPP1 was observed in the samples. All expression samples, both AnxA5 and NPP1, were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The standardization of Annexin V has been obtained with success, but regarding NPP1, experiments have yet to be performed to standardize the production of this recombinant protein and to obtain enough quantity to continue the study.

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:58:55Z : No. of bitstreams: 1 limaneto_jf_me_botfmvz.pdf: 482694 bytes, checksum: 8e409b567c057a2c7915beaa9c6e8077 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O primeiro sucesso na clonagem de eqüídeos através do uso de transferência nuclear foi relatado em maio de 2003 após o nascimento de uma mula clonada a partir de células fetais. Acredita-se que a utilização de células diplóides em fase do ciclo celular G0 ou G1 facilite a coordenação entre o ciclo celular e a reprogramação nuclear após a transferência de núcleo. Sendo assim, este experimento objetivou estudar o comportamento de fibroblastos de eqüinos adultos em cultura, analisando o estado do ciclo celular e a viabilidade das células em cultivo pré- e pós-descongelação. Fragmentos de pele de 6 eqüinos adultos, sendo 3 machos e 3 fêmeas, foram divididos em pedaços de aproximadamente 1mm3 e acondicionados (10 fragmentos/garrafa) no fundo de duas garrafas de cultivo (25cm2) umedecidas com 1mL SFB. As garrafas foram inclinadas para a posição vertical e adicionado 5ml de meio DMEM alta glicose + 10% SFB, 100UI/mL Penicilina / 100æg/mL Estreptomicina e 3,0æg/mL Anfotericina B. Após 30 minutos em estufa com 5% CO2 em ar, as garrafas foram dispostas em posição horizontal, para que o meio de cultivo entrasse em contato com os fragmentos teciduais. Todas as garrafas permaneceram por sete dias em estufa com 5% CO2 em ar até o início do crescimento celular. Com 70% de confluência, foi realizada a tripsinização e a primeira passagem. O mesmo procedimento foi repetido para a segunda passagem. Para os grupos de privação de soro (0,5% de SFB) foram produzidas garrafas de cultivo em duplicata para a análise da viabilidade e do ciclo celular nos períodos de 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de cultivo. Para os grupos de confluência foram produzidas duas garrafas de cultivo para a análise da viabilidade e do ciclo celular no período em que o tapete celular atingisse a confluência... / The first success in equine cloning, using nuclear transfer, was reported in May of the 2003 after the birth of a cloned mule obtained from fetal cells. Nowadays there is an agreement, in the literature, that diploid cells in phase G0 or G1 of the cell cycle facilitate coordination between the cell cycle and the nuclear reprogramming after the nuclear transfer. This experiment aimed to study the behavior of equine fibroblasts in culture though the analysis of the cellular cycle and the viability of cells pre- and post-freezing. Skin fragments were obtained from 6 adult horses (3 females and 3 males) and divided in pieces of about 1 mm3. For culture, the bottoms of two culture bottles were moistened with 1 mL of FCS, 10 fragments of skin were deposited, and 5 ml of DMEM high glucose + 10% FCS, 100 IU/mL penicillin, 100 g/mL streptomycin and 3 g/ml amphotericin B were added with the bottles raised vertically. After 30 min incubation in 5% CO2 in air, the bottles were moved to a horizontal position allowing the culture media to make contact with the tissue fragments. All bottles were cultured for 7 days in 5% CO2 in air until the beginning of confluence. The complete culture media was replaced weekly and, at 70% of confluence, trypsinization (ATV Vernese, Adolfo Lutz Institute) and the first passage were performed. Two passages were performed before freezing. For the second passage, the culture and trypsinization were repeated. For cells subjected to serum starvation (0.5% FCS), culture bottles were produced in duplicate for viability and cellular cycle analysis at 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours of culture. For the confluence groups bottles were produced for the analysis of viability and cellular cycle at the moment cells achieved confluence...(Complete abstract, click electronic address below)