O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-06Bitstream added on 2014-06-13T18:52:39Z : No. of bitstreams: 1 ignacio_eo_me_sjrp.pdf: 543030 bytes, checksum: 69449426c829671ed9efa1ecc7b8a9db (MD5) / Este trabalho teve como objetivo produzir enzimas lipolíticas por fermentação em estado sólido em um biorreator de leito fixo, empregando para isso o fungo mesofílico Metarhizium anisopliae ICB 421 e o fungo termofílico Thermomucor indicae-seudaticae N31, utilizando como substrato bagaço de cana de açúcar (BC), farelo de trigo (FT) e grãos de soja moída (S). As enzimas produzidas podem ser utilizadas para diversos fins industriais, entre eles a produção de biodiesel. Os testes para produção de enzimas foram realizados inicialmente em sacos de polipropileno e apresentaram para M. anisopliae atividade lipolítica de 13,71 U/gss a 28 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70% e cultivado por 5 dias; para T. indicae-seudaticae atividade lipolítica de 2,81 U/gss a 45 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70% e cultivado por 2 dias. Nestes ensaios, as variáveis testadas, composição do meio, umidade inicial, substituição do óleo de soja por farelo de soja e tempo de fermentação, afetaram a atividade das enzimas obtidas. Na sequência, como parte do aumento de escala, os ensaios foram conduzidos em dois biorreator de leito fixo, tendo-se como variáveis a vazão de ar e a umidade inicial do substrato, sendo que ambas afetaram a atividade enzimática, que atingiu 5,61 U/gss para M. anisopliae a 28 °C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70%, vazão ar 180 L/h, cultivado por 5 dias, e 2,48 U/gss para T. indicae-seudaticae a 45°C, em meio composto por 50% BC, 25% FT e 25% S, com umidade de 70%, vazão ar 80 L/h, cultivado por 2 dias. Das enzimas produzidas, a de M. anisopliae apresentou valores muito baixos de transesterificação, descartando-a para a aplicação na obtenção de biodiesel, mas a de T. indicae-seudaticae mostrou-se promissora para esta aplicação / This study aimed to produce lipolytic enzymes through solid state fermentation (SSF) in a fixed-bed bioreactor, using Metarhirium anisopliae ICB 421 mesophilic fungi and Thermomucor indicae-seudaticae N31 thermophilic fungi, and sugar cane bagasse, wheat, and soybeans as substrate. The enzyme produced can be used for various industrial purposes, including biodiesel production. Tests for enzyme production initially performed in polypropylene and showed to M. anisopliae lipolytic activity of 13.71 U / gds at 28 ° C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity and cultivated for 5 days for T. indicae seudaticae lipolytic activity of 2.81 U / gds at 45 ° C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity and cultivated for 2 days. In these assays, the variables tested, medium composition, initial moisture, replacement of soybean oil by soybean meal and fermentation time, affected the activity of the enzymes obtained. Furthermore, as part of scaling, tests were conducted in a fixed bed bioreactor, testing again the process conditions for optimizing the production of lipase; the variables used in this step were air flow, and initial substrate moisture, both of which affect the enzymatic activity, that reached 5.61 U/gds to M. anisopliae at 28°C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity, air flow 180 L/h, for 5 days, and 2.48 U/gds for T. indicae-seudaticae at 45°C in medium composed of 50% BC, and 25% FT 25% S, with 70% humidity, air flow 80 L/h, for 2 days. . Enzymes produced, M. anisopliae showed very low transesterification, dismissing the application for obtaining biodiesel, but for T. indicae-seudaticae has shown promise for this application

Orientador: João Claudio Thoméo / Banca: Marcia Maria de Souza Moretti / Banca: Pedro de Oliva Neto / Resumo: O objetivo deste trabalho foi de aumentar a produção de conídios de Metarhizium anisopliae através de alterações do substrato e das condições de cultivo e produzi-lo em biorreator de bandeja. Os substratos testados foram arroz tipo 1, quirera de arroz e farelo de arroz, sendo o cultivo realizado em embalagens plásticas contendo 10 g de substrato seco. Inicialmente, foi empregado arroz tipo 1 como substrato, variando-se as formas de umidificação no seu preparo, sendo o cultivo realizado em embalagens plásticas contendo 10g de substrato seco. Determinada a condição adequada de umidificação, os substratos arroz tipo 1 e quirera de arroz foram submetidos a diferentes condições de fotoperíodo: escuto contínuo, claro contínuo e escuro e claro alternados. O farelo de arroz foi adicionado a bagaço de cana-de-açúcar de modo a estruturar fisicamente o meio de cultivo. Os melhores resultados foram obtidos com arroz e quirera de arroz. A primeira alternativa de ampliação de escala foi realizada em embalagens plásticas, utilizando arroz tipo 1 e quirera com 500g de substrato seco. A etapa seguinte da ampliação de escala foi em um biorreator de bandeja com aeração realizada sobre a camada de substrato, sendo os testes realizados com arroz tipo 1, e duas espessuras de camada partículas, 2 e 4 cm. Em todos os ensaios, a resposta observada foi a concentração final de conídios. Foi testada ainda a virulência dos conídios produzidos em relação a lagartas de Diatraea flavipennella nas diferentes... / Abstract: The work targeted the increase of the production of spores of Metarhizium anisopliae through modifications of the substrate and of the cultivation conditions, and produce such spores in a tray bioreactor. Type 1 rice, broken rice and rice bran were tested as substrate, which were cultivated in plastic bags containing 10 g of dry substrate. Alternatives of humidification were tested with type 1 rice. For the best alternative of humidification, type 1 rice and broken rice were submitted to alternatives of different exposures to light, provided by a fluorescent lamp: continuous dark, continuous light, alternation between dark and light. To the bran was added sugar cane bagasse in order to provide physical structure to the culture medium. The best results were obtained with rice and broken rice and the illumination regime does not influence on the spore production. The first attempt of scaling-up the spore production was the use of plastic bags containing 500 g of dry substrate, either rice or broken rice. The next scaling-up step was in a tray bioreactor aerated flowing air parallel to the top of the cultivation medium, using type 1 rice as substrate in two different thickness of medium, 2 and 4 cm. In every experiments, the response variable was the conidia concentration. The virulence against Diatraea flavipennella caterpillars was also tested for spores produced in the different experimental conditions. The results showed that rice bran is not an efficient alternative due to ... / Mestre

Orientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Italo Delalibera Júnior / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: A pesquisa objetivou analisar a suscetibilidade de duas populações distintas de Helicoverpa armigera a produtos comerciais à base de Bacillus thuringiensis (Bt) e isolados de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Metarhizium rileyi. As populações foram coletadas em lavouras de soja nos municípios de Rio Verde (GO) e Luís Eduardo Magalhães (BA) e criadas em laboratório até a décima geração antes do início dos bioensaios. Os formulados utilizados foram Dipel® PM (B. thuringiensis var kurstaki), Xentari® WG (B. thuringiensis var. aizawai) e Agree® WG (B. thuringiensis var. aizawai GC91 transconjugado com B. thuringiensis var. kurstaki), com a aplicação de 50 μL da suspensão do produto biológico, na concentração de 107 esporos viáveis/mL, sobre a superfície da dieta acondicionada em recipientes esféricos de plástico (2 cm de diâmetro x 3 cm de altura). Em cada recipiente foi inserida uma lagarta, de cada instar larval, em um total de 100 lagartas por tratamento distribuídas em 10 repetições. As avaliações referentes à mortalidade foram efetuadas a cada 24 horas, até o sétimo dia após a aplicação dos tratamentos. Os fungos B. bassiana e M. anisopliae foram obtidos a partir dos produtos comerciais biológicos Boveril® PM e Metarril® PM, respectivamente, enquanto que M. rileyi foi isolado de cadáveres de H. armigera, sendo padronizados na concentração de 108 conídios viáveis/mL. Como unidade experimental foram utilizados recipientes de plástico (2 cm de diâmetro x 3 cm de altura), com dieta artificial na qual uma alíquota de 50 μL do fungo foi misturada ou aplicada na superfície. Em cada recipiente foi inserida uma lagarta de primeiro instar, com menos de 24 h de vida, totalizando 100 lagartas por tratamento distribuídas em 10 repetições. A mortalidade foi avaliada a cada 24 h, até o décimo dia após a aplicação dos tratamentos. Lagartas de primeiro instar de H. armigera, de ambas ... / Abstract: The research aimed to assess the suscetibility of two distinct Brazilian populations of Helicoverpa armigera to commercial Bacillus thuringiensis insecticides and isolates of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Metarhizium rileyi.The pest populations were collected in soybean fields located in Rio Verde (GO) and Luís Eduardo Magalhães (BA), taken to laboratory and reared until the tenth generation on artificial diet, to be used in the experiment.The bioassays were performed using spherical plastic receptacles (2-cm diameter x 3- cm height) containing artificial diet until complete the half volume. The formulated products used were Dipel® WP (B. thuringiensis var kurstaki), Xentari® WG (B. thuringiensis var. aizawai) and Agree® WG (B. thuringiensis var. aizawai GC91 with B. thuringiensis var. kurstaki), spraying 50 μL of biological product solution at 107 viable spores/mL, on the surface of the diet. One caterpillar was inserted in each receptacle, related with larval instar, totaling 100 caterpillars per treatment and each group containing 10 caterpillars were considered a replication. Mortality were assessed each 24h, until the seventh day after the beginning of the bioassay. To perform the bioassays with entomopathogenic fungi, B. bassiana and M. anisopliae were obtained from the bio-insecticides Boveril® WP and Metarril® WP, respectively and M. rileyi was isolated from H. armigera cadavers at concentration of 108 viable conidia/mL. The bioassays were performed using spherical plastic receptacles (2-cmdiameter x 3-cm height) containing artificial diet until complete the half volume. After this step, a solution of 50 μL containing the entomopathogenic fungi was sprayed on the diet surface. One caterpillar was inserted in each receptacle, with less than 24 h after hatch, totaling 100 caterpillars per treatment. Each group containing 10 caterpillars were considered a replication. Mortality were assessed each 24h, until ... / Mestre

A eficácia do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae para controle de carrapatos foi evidenciada em vários experimentos in vitro, entretanto, há poucos relatos de ensaios em condições de campo para demonstrar a real aplicação do controle biológico. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia de M. anisopliae no controle de Rhipicephalus microplus em condições de laboratório e de campo associado ou não a acaricidas químicos, utilizando bovinos. Inicialmente, foi avaliada a compatibilidade de M. anisopliae (cepa E6) em ensaio in vitro com cinco produtos comerciais contendo: amitraz, cipermetrina, clorpirifós e duas associações de piretróides sintéticos e organofosforados (PS+OF). Em geral os acaricidas apresentaram pouco efeito na viabilidade do fungo. Quando M. anisopliae foi associado ao amitraz e a clorpirifós, ocorreu diminuição na viabilidade em aproximadamente 63% e 67% a 48 e 96 horas após a mistura, respectivamente. A eficácia de M. anisopliae (cepa E6) também foi avaliada sobre uma cepa de R. microplus multiresistente a acaricidas. Foram realizados experimentos in vitro e em condições de campo, utilizando o fungo isoladamente ou em associação com um acaricida comercial de pulverização em bovinos infestados com a cepa Jaguar (de R. microplus resistente a carrapaticidas). Para os ensaios a campo, vinte bovinos foram divididos em quatro grupos (n = 5): (i) o grupo tratado com acaricida; (ii) o grupo tratado com o fungo, (iii) o grupo tratado com a associação de fungo + acaricida, e (iv) o grupo controle (não tratado). Os animais foram separados em piquetes com animais naturalmente infestados e também com infestação experimental com a cepa Jaguar. Em cada infestação foram utilizadas 20.000 larvas de R. microplus, aplicadas em três semanas a -21, -14 e -7 dias antes do primeiro tratamento e uma semana depois de cada tratamento. Os animais dos grupos tratados foram pulverizados com o fungo na concentração de 108 conídios/mL com intervalo de 21 a 28 dias sendo realizados sete tratamentos. Desde o primeiro tratamento até o final do experimento, os três grupos tratados, apresentaram nas contagens, número de carrapatos inferior ao grupo controle (P <0,05). Os grupos tratados com a suspensão de esporos de fungo ou com acaricida isoladamente apresentaram um controle semelhante, com um mínimo de 50% de eficácia e média de 75%. Mais significativo foi o tratamento com associação do fungo com o acaricida que resultou em eficácia de 91,7%, após o primeiro tratamento e acima de 98% após os outros seis tratamentos. Assim, fica aqui demonstrada a real aplicabilidade do uso do fungo M. anisopliae (Cepa E6) para controle de R. microplus resistentes a acaricida, em especial a sua associação com acaricidas. / The of the fungus Metarhizium anisopliae to control ticks has been shown in several in vitro experiments. However, there have been few reports of assays in field conditions in order to demonstrate the real applicability of the biological control. Thus aim of the present study was to evaluate the efficacy of M. anisopliae to control Rhipicephalus microplus under laboratory and field conditions. Firstly the compatibility of M. anisopliae (strain E6) to acaricides was tested in vitro using five commercial acaricides: amitraz, cypermethrin, chlorpyriphos and two associations of synthetic pyrethroid and organophosphate (SP+OP). In general, the acaricides only displayed mild effects on fungus viability. The lower fungal viability was with amitraz and chlorpyriphos, approximately 63% of fungus viability at 48 hours post-mixture and 67% at 96 hours, respectively. Secondly, the efficacy of M. anisopliae (strain E6) to control a multiacaricide-resistant strain of R. microplus (Jaguar) was evaluated, in vitro and under field conditions in tick infested bovines, using the fungus alone or in association with a commercial acaricide by manual spraying. The field experiment was conducted with twenty bovines divided into four groups (n = 5); (i) acaricide-treated group, (ii) fungus-treated group, (iii) fungus+acaricide group, and (iv) control non-treated group. Animals were allocated into highly infested paddocks and were also experimentally infested with 20.000 larvae of R. microplus in three weeks -21, -14, and -7 days before the first treatment and one week after each treatment. Animals in the treated groups were sprayed with M. anisopliae at a concentration of 108 conidia/mL at 21 or 28 days intervals (seven treatments). From the first treatment to the end of the experiment, the treated groups had lower tick infestation (P < 0.05). Groups treated with fungus suspension and acaricide alone, presented a similar efficacy, with minimal of 50% and 75% average. Importantly, the association of fungus and acaricide promoted a minimal percent of 91.7% tick-control after the first treatment and over 98% tick-control in the other six treatments. Thus in this work we demonstrate the real applicability of the use of M. anisopliae (strain E6) to control acaricide resistant ticks R. microplus in particular using the association of fungal spores and acaricides.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, acarretando o uso intensivo de acaricidas. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. Muito esforço tem sido despendido para o desenvolvimento de uma vacina contra o carrapato, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas e caracterização de seus papéis na fisiologia do carrapato. Nesse sentido, entender melhor os processos envolvidos no desenvolvimento embrionário pode ajudar na identificação de alvos para o controle desse ectoparasita. Foi sugerida previamente a participação da Tick Heme-binding Aspartic Proteinase (THAP), uma aspártico-endopeptidase dos ovos do carrapato, na degradação da vitelina. Neste trabalho, nós avaliamos a função fisiológica e as características bioquímicas adicionais dessa proteína. Para identificar os sítios e o perfil de transcrição do gene da THAP, o RNA total foi extraído de intestino, ovário e corpo gorduroso de fêmeas parcialmente e completamente ingurgitadas e de ovos, e analisado por PCR quantitativo. Esta análise revelou que o gene da THAP é transcrito nos três tecidos, porém maior quantidade de mRNA foi detectada no corpo gorduroso e intestino de fêmeas completamente ingurgitadas, onde o processo de vitelogênese já foi iniciado. Nos ovos, a transcrição do gene da THAP não foi detectada. Para investigar a presença da proteína nos tecidos e ovos foi realizado um westen-blot com soro anti-THAP, que revelou a presença, em pequena quantidade, da proteína na hemolinfa, no intestino e no corpo gorduroso. Maior concentração de proteína foi detectada no ovário de fêmeas completamente ingurgitadas e nos ovos durante todo o desenvolvimento embrionário. Também foi observado que a THAP é sintetizada na forma de pró-endopeptidase e depois do início da embriogênese é convertida à forma ativa por autoproteólise. Uma proteína recombinante (rTHAP) foi produzida pela clonagem da região codificadora no vetor de expressão pET43a e expressão em Escherichia coli. Depois da purificação, a rTHAP apresentou atividade enzimática sobre substrato sintético fluorogênico, sendo especificamente inibida por pepstatina A. Para investigar sua participação na degradação de vitelina (VT), VT purificadas de ovos coletados 1, 7 e 12 dias após a postura foram incubadas com a rTHAP em diferentes pH (3,5; 4,0; 4,5; e 5,0). A análise por SDS-PAGE mostrou que a rTHAP é capaz de hidrolisar VT purificada de ovos coletados 7 dias após a postura em pH 3,5 a 37 ºC. Esta atividade é sensível a heme e inibida por pepstatina A. VT purificadas de ovos coletados 1 e 12 dias após a postura não foram hidrolisadas e em outros pH a atividade da rTHAP não foi eficiente. Nossos resultados sugerem que a THAP é sintetizada principalmente em tecidos extra-ovarianos, estocada nos ovários e incorporada nos oócitos como pró-endopeptidase. Durante a embriogênese, a THAP é ativada a enzima na forma madura desenvolvendo papel no processamento da vitelina do carrapato. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host tick that causes losses to bovine herds, leading intensive use of chemical acaricides. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological methods. Major efforts have been made to develop vaccines against tick; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. In this sense, to understand the processes involved in embryonic development can help in the identification of additional targets to control this ectoparasite. Previously, an aspartic endopeptidase from tick eggs, named THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase), was suggested to be involved in vitellin degradation. In this work, we have investigated the physiological role and additional chemical features of this protein. To identify the site and profiles of the THAP transcription, total RNA extracted from midgut, ovary and fat body from partially and fully engorged females and from eggs was analyzed by qRT-PCR. This analysis showed that THAP mRNA was transcripted in these three tissues. However, highest levels of transcriptions were found in fat body and midgut of fully engorged vitellogenic females. In eggs, THAP mRNA transcription was not detected. In order to investigate the presence of THAP protein in the tissues and eggs, an immunoblot analysis was conducted with an anti-nTHAP serum. The THAP protein was detected in the haemolymph, midgut and fat body and, in higher quantity, in the ovary of fully engorged females, and it was present throughout embryo development. The protein is synthesized as a higher molecular mass form (pro-endopeptidase) and after the onset of embryogenesis THAP is converted into an active form by autocatalysis. A recombinant THAP (rTHAP) was produced through cloning in pET43a vector and expression in Escherichia coli. After the purification the rTHAP was active upon fluorogenic substrate in a reaction specifically inhibit by pepstatin A. To investigate rTHAP vitellin-degradation activity, vitellin (VT) purified from 1-, 7- and 12-day-old eggs were incubated with rTHAP in a range of pHs (3.5, 4.0, 4.5 and 5.0). SDS-PAGE analysis showed that rTHAP is able to hydrolyze VT from 7-day-old eggs in pH 3.5 at 37ºC in a reaction that is heme-sensitive and inhibited by pepstatin A. Vitellins from eggs collected on the 1st and 12th days after oviposition were not hydrolyzed and in other pHs rTHAP activity was not efficient. These results suggest that THAP is synthesized in ovary and extra-ovarian site, stocked in ovary and incorporated by vitellogenic oocytes with a pro-endopeptidase. During embryogenesis, THAP was actived to the mature enzyme and play a role in tick vitellin processing.

A eficácia do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae para controle de carrapatos foi evidenciada em vários experimentos in vitro, entretanto, há poucos relatos de ensaios em condições de campo para demonstrar a real aplicação do controle biológico. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia de M. anisopliae no controle de Rhipicephalus microplus em condições de laboratório e de campo associado ou não a acaricidas químicos, utilizando bovinos. Inicialmente, foi avaliada a compatibilidade de M. anisopliae (cepa E6) em ensaio in vitro com cinco produtos comerciais contendo: amitraz, cipermetrina, clorpirifós e duas associações de piretróides sintéticos e organofosforados (PS+OF). Em geral os acaricidas apresentaram pouco efeito na viabilidade do fungo. Quando M. anisopliae foi associado ao amitraz e a clorpirifós, ocorreu diminuição na viabilidade em aproximadamente 63% e 67% a 48 e 96 horas após a mistura, respectivamente. A eficácia de M. anisopliae (cepa E6) também foi avaliada sobre uma cepa de R. microplus multiresistente a acaricidas. Foram realizados experimentos in vitro e em condições de campo, utilizando o fungo isoladamente ou em associação com um acaricida comercial de pulverização em bovinos infestados com a cepa Jaguar (de R. microplus resistente a carrapaticidas). Para os ensaios a campo, vinte bovinos foram divididos em quatro grupos (n = 5): (i) o grupo tratado com acaricida; (ii) o grupo tratado com o fungo, (iii) o grupo tratado com a associação de fungo + acaricida, e (iv) o grupo controle (não tratado). Os animais foram separados em piquetes com animais naturalmente infestados e também com infestação experimental com a cepa Jaguar. Em cada infestação foram utilizadas 20.000 larvas de R. microplus, aplicadas em três semanas a -21, -14 e -7 dias antes do primeiro tratamento e uma semana depois de cada tratamento. Os animais dos grupos tratados foram pulverizados com o fungo na concentração de 108 conídios/mL com intervalo de 21 a 28 dias sendo realizados sete tratamentos. Desde o primeiro tratamento até o final do experimento, os três grupos tratados, apresentaram nas contagens, número de carrapatos inferior ao grupo controle (P <0,05). Os grupos tratados com a suspensão de esporos de fungo ou com acaricida isoladamente apresentaram um controle semelhante, com um mínimo de 50% de eficácia e média de 75%. Mais significativo foi o tratamento com associação do fungo com o acaricida que resultou em eficácia de 91,7%, após o primeiro tratamento e acima de 98% após os outros seis tratamentos. Assim, fica aqui demonstrada a real aplicabilidade do uso do fungo M. anisopliae (Cepa E6) para controle de R. microplus resistentes a acaricida, em especial a sua associação com acaricidas. / The of the fungus Metarhizium anisopliae to control ticks has been shown in several in vitro experiments. However, there have been few reports of assays in field conditions in order to demonstrate the real applicability of the biological control. Thus aim of the present study was to evaluate the efficacy of M. anisopliae to control Rhipicephalus microplus under laboratory and field conditions. Firstly the compatibility of M. anisopliae (strain E6) to acaricides was tested in vitro using five commercial acaricides: amitraz, cypermethrin, chlorpyriphos and two associations of synthetic pyrethroid and organophosphate (SP+OP). In general, the acaricides only displayed mild effects on fungus viability. The lower fungal viability was with amitraz and chlorpyriphos, approximately 63% of fungus viability at 48 hours post-mixture and 67% at 96 hours, respectively. Secondly, the efficacy of M. anisopliae (strain E6) to control a multiacaricide-resistant strain of R. microplus (Jaguar) was evaluated, in vitro and under field conditions in tick infested bovines, using the fungus alone or in association with a commercial acaricide by manual spraying. The field experiment was conducted with twenty bovines divided into four groups (n = 5); (i) acaricide-treated group, (ii) fungus-treated group, (iii) fungus+acaricide group, and (iv) control non-treated group. Animals were allocated into highly infested paddocks and were also experimentally infested with 20.000 larvae of R. microplus in three weeks -21, -14, and -7 days before the first treatment and one week after each treatment. Animals in the treated groups were sprayed with M. anisopliae at a concentration of 108 conidia/mL at 21 or 28 days intervals (seven treatments). From the first treatment to the end of the experiment, the treated groups had lower tick infestation (P < 0.05). Groups treated with fungus suspension and acaricide alone, presented a similar efficacy, with minimal of 50% and 75% average. Importantly, the association of fungus and acaricide promoted a minimal percent of 91.7% tick-control after the first treatment and over 98% tick-control in the other six treatments. Thus in this work we demonstrate the real applicability of the use of M. anisopliae (strain E6) to control acaricide resistant ticks R. microplus in particular using the association of fungal spores and acaricides.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-24T13:06:56Z No. of bitstreams: 1 Ellen Carine Neves Valente.pdf: 314434 bytes, checksum: ac0a6866be98417967bd151237746424 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T13:06:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ellen Carine Neves Valente.pdf: 314434 bytes, checksum: ac0a6866be98417967bd151237746424 (MD5) Previous issue date: 2011-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Diatraea flavipennella (Box), is a pest of great economic importance to the cultivation of sugar cane in Northeast Brazil. The use of the larval parasitoid Cotesia flavipes (Cam) has not succeeded in controlling the D. flavipennella. The use of entomopathogenic fungi is a viable alternative within the context of integrated management of this pest. Thus, this study aimed to evaluate the effect of isolated URPE-3, URPE-4, URPE-18, URPE-22, and ESALQ 447 of Beauveria bassiana (Bals.) Vuilleman and PL43, E9, ESALQ 1189, URPE-11, and URPE-19 Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin on eggs of 24, 48, and 72 hours old and the 2nd-instar larvae of D. flavipennella in laboratory conditions. The eggs and larvae were sprayed with 1 mL of suspensions (1x107 conidia / mL) (treatment) and sterile distilled water over wetting agent Tween® 80 at 0.01% (control). Tests conducted on eggs of D. flavipennella consisted of four replications, each consisting of approximately 30 eggs. The experiments with caterpillars consisted of six replications, each consisting of seven larvae, totaling 42 larvae per treatment. Eggs and larvae were kept inside of growth chamber at 27 ± 1 ºC, 70 ± 10% RH and 12h photophase. The fungus M. anisopliae was more virulent to eggs, particularly the isolated URPE- 11, which provided 100% of infection in eggs of 24, 48, and 72 hours old, and the LC50 at 2.0x105 conidia. The isolates ESALQ 447 and ESALQ 1189 were more virulent to borer larvae, with mean survival values of 5.76 and 3.23 days, respectively. The LC50 for these isolates was estimated at 1.2 x107 conidia. The results suggest that the fungi M. anisopliae and B. bassiana are important for further evaluation in the applied integrated management of D. flavipennella contributing to the sustainability of sugarcane production in northeastern Brazil. / Diatraea flavipennella (Box), é uma praga de grande importância econômica para a cultura da cana-de-açúcar no nordeste do Brasil. O emprego do parasitóide larval Cotesia flavipes (Cam.) não tem sido suficiente no controle desta praga. O uso de fungos entomopatogênicos é uma alternativa viável dentro do contexto do manejo integrado dessa praga. Dessa forma, este estudo teve por objetivo avaliar o efeito dos isolados URPE-3, URPE-4, URPE-18, URPE-22 e ESALQ 447 de Beauveria bassiana (Bals.) Vuilleman e PL43, E9, ESALQ 1189, URPE-11 e URPE-19 de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin sobre ovos de 24, 48 e 72 horas de idade e lagartas no 2º ínstar de D. flavipennella. Os ovos e lagartas foram pulverizados com 1mL das suspensões (1x107 conídios/mL) (tratamentos) e água destilada e esterilizada mais espalhante adesivo Tween® 80 a 0,01% (testemunha). Os ensaios realizados com ovos de D. flavipennella constaram de quatro repetições, sendo composta por aproximadamente 30 ovos cada. Os ensaios com as lagartas constaram de seis repetições, sendo cada uma composta por sete lagartas, totalizando 42 lagartas por tratamento. Ovos e lagartas foram mantidos em B.O.D. a 27 ± 1ºC; 70 ± 10% UR; 12h de fotofase. O fungo M. anisopliae foi mais virulento para os ovos, destacandose o isolado URPE-11, o qual proporcionou 100% de infecção nos ovos de 24, 48 e 72 horas de idade, sendo a CL50 estimada em 2,0x105 conídios/mL. Os isolados ESALQ 447 e ESALQ 1189 foram mais virulentos sobre lagartas da broca, apresentando valores médios de sobrevivência de 5,76 e 3,23 dias, respectivamente. A CL50 para estes isolados foi estimada em 1,2x107 conídios/mL. Os resultados indicam que os fungos M. anisopliae e B. bassiana são importantes para serem utilizados no Manejo Integrado de D. flavipennella contribuindo para a sustentabilidade da agricultura canavieira no nordeste do Brasil.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5103_1.pdf: 2655923 bytes, checksum: 4a8cd8dfda72129aa8308dbf088c4d10 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae var. anisopliae e Metarhizium flavoviride var. flavoviride são fungos entomopatogênicos com ação comprovada contra várias espécies, embora não tenham sido testados em Chrysomya albiceps, um díptero de importância na saúde pública. Assim, objetivou-se avaliar a ação de B. bassiana, M. anisopliae var. anisopliae e M. flavoviride var. flavoviride em ovos, larvas e adultos de C. albiceps, utilizando as concentrações 104, 105, 106, 107, 108 conídios.mL-1, considerando o percentual de eclosão de larvas, período de pré-pupa, pupa, percentual de emergência de adultos, ritmo de emergência, morte acumulativa, longevidade, período de postura e percentual de eclosão a partir de fêmeas infectadas. O comportamento dos fungos reisolados também foi avaliado através dos parâmetros biológicos: percentual de germinação, número de conídios, número e diâmetro de colônias, bem como a citologia no que se refere à descrição das estruturas vegetativas e reprodutivas. De acordo com a metodologia empregada, verificou-se que os três fungos apresentaram ação contra ovos, larvas e adultos de C. albiceps. Já em relação ao comportamento, foi observado que os fungos reisolados de larva apresentaram o melhor desempenho em relação ao controle e os aspectos citológicos não diferiram quando comparados ao controle. Esses resultados sugerem a possibilidade do emprego desses fungos no controle de C. albiceps

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4415_1.pdf: 476089 bytes, checksum: bfff2f22f85990f6fb497864f0376cec (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / Atualmente o método de maior interesse adotado para o controle de Boophilus microplus, carrapato de um só hospedeiro que acarreta prejuízos globais de milhões de dólares anuais, baseia-se na utilização de fungos entomopatogênicos, sendo Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana os mais utilizados. Este trabalho avaliou a compatibilidade química dos carrapaticidas Cipermetrina High Cis técnica 100 (CHC) e Amitraz sobre M. anisopliae var. acridum. No ensaio químico as concentrações utilizadas foram: 0,20&#956;g; 0,50&#956;g; 1,00&#956;g; 2,00&#956;g; 5,00&#956;g e 10,00&#956;g. Para cada tratamento foram utilizadas cinco repetições e um controle. Os parâmetros analisados foram, a germinação de conídios, o crescimento linear, a esporulação e a condição nuclear. Foi determinada, também a toxicidade. Os menores percentuais de germinação, 49,50%, 58,07% e 51,06% foram observados nos tratamentos com Amitraz nas concentrações 0,20&#956;g; 5,00&#956;g e 10,00&#956;g, respectivamente. O diâmetro da colônia foi afetado no terceiro dia de cultivo (66,67%) na concentração de 0,50&#956;g de CHC. O carrapaticida Amitraz no sexto dia de cultivo na concentração de 10,00&#956;g promoveu um menor percentual de esporulação (33,35%). M. anisopliae var. acridum não apresentou alterações citológicas quando crescido em meio com carrapaticidas. A toxicidade obtida de 46,98% no sexto dia de cultivo, segundo a metodologia utilizada determinou que o produto Amitraz na concentração de 10,00&#956;g é moderadamente tóxico para este fungo. Os resultados obtidos contribuirão para um emprego futuro do controle integrado do B. microplus utilizando-se carrapaticidas químicos e fungos entomopatogênicos