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Submitted by LUCAS PORTILHO DA CUNHA null (lucasportilhodacunha@gmail.com) on 2016-04-21T16:42:26Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_LUCAS PORTILHO DA CUNHA VERSÃO FINAL.pdf: 2114741 bytes, checksum: 6122b7305d3f81a525845b852fac3200 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-02T16:39:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cunha_lp_me_sjrp.pdf: 2114741 bytes, checksum: 6122b7305d3f81a525845b852fac3200 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-02T16:39:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cunha_lp_me_sjrp.pdf: 2114741 bytes, checksum: 6122b7305d3f81a525845b852fac3200 (MD5) Previous issue date: 2016-03-28 / O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento de um biorreator de bandeja capaz de produzir esporos do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae. Para esse fim, foi utilizado um biorreator de bandeja para a produção de esporos, que por sua vez foi avaliada em função da carga de substrato empregada. As variações de temperatura no biorreator foram simuladas e observadas experimentalmente. Para o desenvolvimento do biorreator, inicialmente foram realizados ensaios em embalagens plásticas contendo 10g e 500g de substrato, de modo a avaliar como o aumento da carga de meio fermentativo poderia influenciar na produção de esporos. Nestes ensaios, foram medidas as temperaturas no centro geométrico das embalagens e a elevação de temperatura foi relacionada à produção de esporos. Realizou – se uma análise de área superficial do arroz tipo 1 e da quirera de arroz para avaliar a interferência desta propriedade na produção de esporos. A partir dos resultados em embalagens plásticas foram realizados experimentos em um biorreator de 40 cm de comprimento, 29 cm de largura por 12 cm de altura, escoando ar sobre as partículas no sentido da maior dimensão. Foram empregadas cargas de 1, 2 e 3kg de arroz tipo 1, correspondente à altura de leito de 2, 4 e 6 cm, respectivamente, e 1 kg de quirera, correspondendo a 2 cm de altura. A temperatura nas posições de entrada e saída de ar e no meio geométrico do meio de cultivo foram medidas ao longo dos ensaios. A fermentação nas embalagens plásticas e no biorreator foram realizadas a 28oC. Para estimar a geração de calor metabólico do meio de cultivo, foram coletados dados de consumo de O2 e liberação de CO2 durante o período de incubação. Para tal, foi realizada a fermentação em um biorreator de leito empacotado cilíndrico, sendo os gases provenientes do leito e conduzidos a um analisador de gases. Foi proposto um modelo matemático unidimensional, capaz de prever os perfis de temperatura e o crescimento fúngico ao longo do processo em qualquer posição do biorreator. Os resultados experimentais em embalagens plásticas e no biorreator mostraram que menores quantidades de substrato são favoráveis à maior estabilidade da temperatura do meio de cultivo, resultando em maiores quantidades de esporos. No teste de área superficial, foi possível observar um aumento na área da quirera de arroz e consequentemente aumento da quantidade de esporos. Nos testes de cinética de crescimento, pode se observar que o consumo de O2 é baixo comparado a outros fungos. Os dados de simulação não demonstraram sobreaquecimento do meio de cultivo no biorreator com o aumento de carga, o que não afetaria a produção de esporos. Também pode se observar com os dados de simulação que a temperatura da superfície do meio de cultivo não sofreu sobreaquecimento. Porém, com os dados experimentais, foi possível observar um sobreaquecimento no meio de cultivo, em virtude da geração de calor metabólico. Os dados experimentais demonstraram que os melhores resultados obtidos no biorreator, para produção de esporos do fungo Metarhizium anisopliae, foram com cargas de 1 Kg, correspondente a 2 cm de altura de substrato e que com cargas maiores os perfis de temperatura apresentaram elevado aquecimento no meio de cultivo. / This study aimed to develop a bioreactor tray capable of producing spores of the fungus Metarhizium anisopliae entomopathogenic. To this end, we used a tray bioreactor for the production of spores, which in turn was evaluated according to the employed substrate load. Temperature variations in the bioreactor were simulated and observed experimentally. For the development of bioreactor assays were carried out in plastic bags containing substrate 10g and 500g in order to evaluate how increasing fermentative medium loading could influence the production of spores. In these tests we measured the temperature at the geometric center of the packages and the temperature rise was related to spore production performed -. A surface area analysis of rice Type 1 and broken rice to evaluate the interference at this property in the production of spores. From the results in plastic containers experiments were performed in a bioreactor of 40 cm long, 29 cm wide by 12 cm, air flowing onto the particles in the direction of the largest dimension. Loads were applied to 1, 2 and 3 kg of rice type 1, corresponding to the bed height of 2, 4 and 6 cm, respectively, and 1 kg of grits, corresponding to 2 cm. The temperature at the inlet position and the air outlet and the geometric mean of the culture medium were measured throughout the tests. Fermentation in plastic packaging and the bioreactor were carried out at 28 C. To estimate the generation of metabolic heat of culture medium were collected consumption data The O2 and CO2 release during the incubation period. To this end, the fermentation was performed in a bioreactor cylindrical packed bed, and the gases from the bed and driven to a gas analyzer. A one-dimensional mathematical model capable of predicting the temperature profile and fungal growth during the process at any position of the bioreactor is proposed. The experimental results in plastic bottles and bioreactor showed that smaller amounts of substrate are conducive to increased stability of the temperature of the medium, resulting in larger amounts of spores. In the test surface area, it was possible to observe an increase in the area of rice grits and therefore increasing the amount of spores. In the growth kinetics tests, it can be seen that the O 2 consumption is low compared to other fungi. Simulation data showed no overheating of the culture medium in the bioreactor with the increased load, which would not affect the production of spores. It can also be observed with the simulation data as the temperature of the surface of the medium has not suffered overheating. However, with the experimental data, it was possible to observe overheating in the culture medium by virtue of the generation of metabolic heat. The experimental data show that the best results obtained in the bioreactor for the production of Metarhizium anisopliae spores of the fungus were to loads of 1 kg, corresponding to 2 cm substrate height and with larger loads temperature profiles showed high heat in the middle cultivation.

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Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5177_1.pdf: 1753890 bytes, checksum: e623c7879e68e115767606b99f16d884 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005 / Metarhizium anisopliae var. anisopliae, Metarhizium flavoviride var. flavoviride e Beauveria bassiana têm ação comprovada contra diversas espécies de insetos. Os cupins podem ser infectados por esses fungos naturalmente. Avaliou-se a ação desses fungos sobre Nasutitermes coxipoensis em laboratório e quantificou-se a produção de conídios nos insetos mortos. A compatibilidade de M. anisopliae var. anisopliae reisolado de N. coxipoensis com os inseticidas fipronil, imidaclopride e ensossulfan foi determinada através dos parâmetros de germinação, crescimento colonial e esporulação. Foram determinadas doses infectivas por contato direto para cada um dos fungos e aplicadas nos bioensaios. A compatibilidade do reisolado com os inseticidas foi determinada testando-se cinco concentrações dos produtos. A análise dos resultados demonstrou que o método de inoculação por contato direto dos insetos com a cultura fúngica foi eficiente. M. anisopliae var. anisopliae apresentou maior virulência do que M. flavoviride var. flavoviride e B. bassiana. A maior produção de conídios sobre os cadáveres de N. coxipoensis foi observada em M. anisopliae var. anisopliae. O estudo da compatibilidade demonstrou que o produto fipronil foi considerado compatível nas concentrações 0,20μg, 0,50μg e 1,00μg, e incompatível nas concentrações 2,00μg e 5,00μg e os produtos imidaclopride e endossulfan foram compatíveis, não tendo afetado os parâmetros analisados

Os objetivos deste trabalho foram selecionar gramíneas forrageiras com potencial de resistência a Mahanarva fimbriolata, bem como determinar tipos de resistência presentes, por meio da avaliação do efeito sobre a biologia do inseto e de testes de tolerância. Nas gramíneas mais promissoras foi também aplicado o fungo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin para avaliar um possível efeito associado deste com a resistência vegetal. Os ensaios foram realizados sem chance de escolha, com insetos provenientes de criação estoque. No ensaio de biologia, realizado em laboratório com 12 genótipos, os seguintes parâmetros foram avaliados: mortalidade e duração da fase ninfal; peso e longevidade dos adultos; período de pré-oviposição e número de ovos/fêmea; e viabilidade e a duração do período embrionário. No ensaio de tolerância realizado com três gramíneas, em casa de vegetação, foram utilizadas duas densidades de cigarrinhas (dois e quatro casais), avaliando-se o dano causado (com base em escala de notas) aos 3º e 7º dias após a infestação e o crescimento e rebrote das gramíneas ao 14º dia após a desinfestação. Para verificar a associação de plantas resistentes com o fungo M. anisopliae, foram utilizadas, em casa de vegetação, quatro gramíneas como substrato alimentar das cigarrinhas. Em cada genótipo foi feita uma aplicação do fungo sobre ninfas de 3º ínstar, mantendo-se, em cada gramínea, ninfas não tratadas como testemunha, sendo avaliada a mortalidade ninfal até o 15º dia. Concluiu-se que: a) a mortalidade das ninfas de M. fimbriolata criadas em Panicum maximum cv. Paredão é quase total, podendo tal material ser caracterizado como resistente ao inseto por antibiose; b) Andropogon gayanus, Panicum maximum cv. Aruana e Panicum maximum cv. Aries apresentam, em maior grau, resistência a M. fimbriolata dos tipos antibiose e/ou antixenose alimentar, já que afetam o desenvolvimento, a fase adulta e/ou a reprodução do inseto; c) a análise de agrupamento, feita com base nos dados do efeito dos 12 genótipos sobre a biologia de M. fimbriolata, possibilita a divisão dos mesmos em três grupos: um composto por P. maximum cv. Aries, Setaria sphacelata cv. Kazungula, Brachiaria humidicola, A. gayanus e P. maximum cv. Aruana, que inclui os materiais resistentes ao inseto; um formado por Brachiaria decumbens cv. Basilisk, Brachiaria dictyoneura, Brachiaria brizantha cv. MG 4 e Brachiaria ruziziensis com materiais moderadamente resistentes e um grupo com materiais suscetíveis formado por Brachiaria brizantha MG 5 e Brachiaria brizantha ecótipo BB185; d) P. maximum cv. Paredão e B. brizantha cv. Marandu apresentam resistência por tolerância, já que, sob um mesmo nível de infestação, são menos danificados e apresentam recuperação mais rápida, após a desinfestação, quando comparados com B. brizantha ecótipo BB185; e) a aplicação do fungo M. anisopliae causou aumento na mortalidade das ninfas de cigarrinha, sendo o referido aumento dependente do genótipo em que o inseto foi criado. / The goals of this work were to screen grasses with potential of resistance to Mahanarva fimbriolata and to identify the types of such resistance by assessing biological parameters of the insect and performing tolerance bioassays. The effects of a possible interaction between the most promising grasses and the fungus Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin on the spittlebug was also evaluated. Nochoice bioassays were performed using insects from a stock culture. The insect\'s biology was studied in laboratory on 12 genotypes of grasses and the following parameters were assessed: mortality and duration of the immature (nymph) stage, weight and adult longevity, pre-oviposition period and number of eggs/female, and viability and duration of the embryonic period. The tolerance bioassay was performed with three genotypes of grasses in a greenhouse. We used two densities of spittlebugs (two and four couples), assessing the damage (based on a rating scale) at days 3 and 7 after insects were released; and also the growth and resprout of grasses on day 14 after the insects were eliminated. To evaluate the interaction of resistant plants with the fungus M. anisopliae they were used four genotypes of grasses as food substrate for the spittlebugs in greenhouse. For each genotype was made one fungus spraying on third instar nymphs, using another group of nonsprayed nymphs as control. The nymphal mortality was assessed until day 15 after spraying. It was concluded that: a) mortality of M. fimbriolata nymphs reared on Panicum maximum cv. Paredão is roughly complete and such material can be characterized as resistant by antibiosis; b) Andropogon gayanus, Panicum maximum cv. Aruana and Panicum maximum cv. Aries showed, in a higher degree, antibiosis and/or feeding antixenosis to M. fimbriolata, once development, adult stage and/or reproduction of the spittlebugs were affected; c) the cluster analysis based on the biological data of M. fimbriolata reared on 12 genotypes showed three distinct groups: one composed by P. maximum cv. Aries, Setaria sphacelata cv. Kazungula, Brachiaria humidicola, A. gayanus and P. maximum cv. Aruana, which includes the genotypes resistant to the spittlebug; another formed by Brachiaria decumbens cv. Basilisk, Brachiaria dictyoneura, Brachiaria brizanthacv. MG 4 and Brachiaria ruziziensi, with genotypes considered moderately resistant; and a third group with susceptible genotypes composed by Brachiaria brizantha MG 5 and Brachiaria brizantha ecotype BB185; d) P. maximum cv. Paredão and B. brizantha cv. Marandu showed resistance by tolerance once, under the same level of infestation, they are less damaged and recover faster after disinfestation when compared with B. brizantha ecotypo BB185; e) the application of the fungus M. anisopliae increased the immature mortality, nevertheless such increase depended on the genotype on which the insects were reared.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

Zugl.: Hannover, Univ., Diss., 2007

Hannover, University, Diss., 2007.

University, Diss., 2001--Bonn.