Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-09-14T19:32:53Z No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-30T20:24:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-30T20:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_ Hernandez Moura Silva.pdf: 4796639 bytes, checksum: 25de57ac126c223d229f1cdfef26506e (MD5) Previous issue date: 2008 / O anticorpo anti-CD3 tem sido utilizado como imunoterápico na prevenção da rejeição a órgãos transplantados e considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. Entretanto, o único anticorpo anti-CD3 utilizado para uso clínico aprovado pelo FDA, o OKT3, possui origem murina o que gera uma resposta imunogênica quando administrado, impossibilitando uma utilização prolongada e, assim, diminuindo sua eficácia. Uma técnica que vem ao encontro da solução desse problema é a humanização de anticorpos, que por meio de manipulações gênicas propicia um aspecto “mais humano” a essa molécula, atenuando a resposta imunogênica desencadeada. Nesse sentido, foi avaliada a atividade ligante e a função efetora de duas versões humanizadas do anticorpo anti-CD3 apresentando o resíduo murino treonina (T) ou o resíduo humano arginina (R) na posição 86 da cadeia variável pesada. Posição essa, considerada importante estruturalmente. Para expresão dos anticorpos humanizados foram construídos vetores de expressão dicistrônicos, os quais foram utilizados para produção das imunoglobulinas em células de mamíferos da linhagem CHO, de forma estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade para posterior análise da atividade ligante e da função efetora. Os resultados indicam que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos. Contudo, são incapazes de bloquear completamente a ligação do anticorpo murino OKT3 à superfície de linfócitos, em ensaios de competição. Em conjunto com análises estruturais, esses dados indicam uma perda de afinidade das versões humanizadas provavelmente devido à substituição de resíduos importantes estruturalmente na cadeia leve humanizada. As versões humanizadas também apresentam uma capacidade mitogênica menor que a apresentada pelo OKT3, corroborando a perda de afinidade desses anticorpos. Esses dados sugerem que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos, mas o processo de humanização levou a uma diminuição da afinidade original desses anticorpos. Nesse sentido, para se restabelecer a atividade ligante dos anticorpos recombinantes sugerimos a realização de algumas mutações específicas para com isso avaliar o seu futuro uso clínico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Anti-CD3 antibodies have been used for the prevention of organ allograft rejection and are also considered a promising immunotherapic for autoimmune diseases treatment. Currently, there is only one anti-CD3 antibody approved by FDA for clinical use, the OKT3. Unfortunately, due to its murine origin, it promotes an immunogenic reaction when administrated, limiting its long-term use and reducing the treatment effectiveness. To solve this problem we have proposed humanized versions of this anti-CD3 to avoid its immunogenic properties. In this work was evaluated the binding activity and effector function of two humanized anti-CD3 antibodies. The first one has the murine residue threonine (T) 86 VH position while the second version shows the human residue arginine (R) at position 86 in VH. Modeling analysis indicated that this position is structurally important. To express the recombinant antibodies we constructed a dicistronic expression vector and produced the immunoglobulins in CHO cell lines. To analyze the binding activity and effector function, the recombinant proteins were previously purified by affinity chromatography. The results show that humanized antibodies were able to binding to the human CD3 on the T lymphocyte surface. However, they weren’t able to completely block OKT3 binding to T lymphocyte surface on competitive assays. Along with structural analysis, this data indicate an affinity loss of humanized versions probably due the substitution of important residues on humanized VL. The humanized versions also presented a less mitogenic activity than that observed by OKT3, corroborating the affinity loss of these antibodies. These data suggest that the humanized antibodies are able to bind to human CD3, but the humanization procedure caused a decrease on recombinant antibody affinity, compared with OKT3. To restore the binding activity of these antibodies specific mutations and back mutations must have to be taken in order to permit its future clinical use evaluation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-03-18T13:38:57Z No. of bitstreams: 1 2009_YuriSantosOliveira.pdf: 1895347 bytes, checksum: 419eb5913705e8f045ad7b3a3c6dfda0 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-03T21:20:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_YuriSantosOliveira.pdf: 1895347 bytes, checksum: 419eb5913705e8f045ad7b3a3c6dfda0 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-03T21:20:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_YuriSantosOliveira.pdf: 1895347 bytes, checksum: 419eb5913705e8f045ad7b3a3c6dfda0 (MD5) Previous issue date: 2009-02 / Nos últimos 20 anos a utilização de anticorpos monoclonais (mAbs) para fins terapêuticos vêm revolucionando o tratamento de diversas enfermidades. Desde a aprovação pelo FDA (Food and Drug Administration USA), em 1986, do anticorpo murino anti-CD3, Orthoclone OKT3 o mercado de anticorpos monoclonais vem crescendo a passos largos. Esse trabalho teve como objetivo o melhoramento do anticorpo OKT3 humanizado utilizando a técnica de domain shuffling. Para tanto scFvs contendo a região codante da cadeia variável pesada humanizada foram obtidos variando-se os genes de cadeias leves, clonadas a partir de uma biblioteca humana. Esses scFvs foram produzidos na forma de partículas virais de fusão para serem utilizados em procedimentos de seleção de acordo com a técnica de phage display. Para dar início a seleção de partículas virais ligantes, foi necessária a expressão e purificação do antígeno CD3 recombinante em E. coli. Esse antígeno foi expresso na fração citoplasmática solúvel de células da linhagem BL21. Foi realizada a purificação e constatou-se a manutenção das características antigênicas do CD3 por imunoensaio com anticorpos anti-CD3 comerciais ou recombinantes. Em seguida, averiguou-se se os fagos selecionados eram capazes de se ligar ao antígeno e a quais ciclos de seleção eles pertenciam. Concluiu-se com o presente trabalho que o procedimento de seleção de anticorpos na forma de scFv pela estratégia de shuffling de cadeia aliada à técnica de Phage Display foi eficaz em selecionar clones com capacidade de ligação ao antígeno recombinante. Esse trabalho aponta para a validação dos anticorpos obtidos em comparação com os anticorpos comerciais (OKT3 e UCHT). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In the last 20 years the use of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic purposes are revolutionizing the treatment of various diseases. Since the approval by the FDA (Food and Drug Administration - USA) in 1986, the murine anti-CD3 antibody, Orthoclone OKT3, monoclonal antibodies market is scaling up. This work aimed the improvement of a humanized OKT3 antibody using the technique of domain shuffling. The strategy chosen was keeping constant the anti-CD3 humanized heavy chain coding region combined with light chains genes, cloned from a human Fab library. These scFvs were fused to filamentous phage gene protein III. These fusion virions were used in selection procedures as stated by Phage Display technique. To proceed the selection we first expressed and purificated the CD3 recombinant antigen in E. coli. This antigen was recovered from the soluble cytoplasmatic fraction of E. coli strain BL21cells. Purification was carried out by metal affinity chromatography, and the recombinant protein antigenic features were assessed by immunoassay using comercial or recombinant anti-CD3 antibodies. The selection procedure was performed in four selection rounds, and the selected phages were screened by their ability of antigen recognition. The bound phages were found predominantly among those from round four (86 % of the assayed phage clones). In conclusion, this work was able to select new anti-CD3 antibodies and these new molecules must now be further charicterized to validate them in comparison with commercial antibodies (OKT3 and UCHT) and as a second generation of biopharmaceuticals.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-27T12:41:51Z No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-03T13:34:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-03T13:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / O conhecimento sobre as intera cções moleculares entre anticorpos com a nidade a acidos nucl eicos e seus alvos ainda e muito limitado. Trabalhos anteriores do grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Bras lia de busca em bancos de dados apon- tavam para uma prov avel tendência de reconhecimento de acidos nucl eicos dos anticorpos pertencentes a fam lia murina de imunoglobulina de cadeia vari avel pesada dez, ou VH10. Portanto, para melhor entender esse comportamento, decidiu-se analisar bibliotecas de regiões determinantes de complementaridade tr^es de cadeia pesada, CDR H3, em contextos das fam lias murinas VH10 e VH4, antes e ap os essas bibliotecas terem sido selecionadas contra DNA ta simples. Desta forma, procurou-se compreender o comportamento dessas duas fam lias e de certos determinantes da CDR H3 no reconhecimento de anticorpos a DNA. As bibliotecas de estudo foram submetidas a seq uenciamento de alto-desempenho, utilizando-se a metodologia Illumina, e foram ent~ao analisadas por meio de um pipeline de Bioinform atica. Esse pipeline consistiu na prepara c~ao das seq uências FASTQ recebidas e na an alise posterior, sendo esta ultima composta por estudos de variabilidade das bibliotecas, enriquecimento de seq uências ap os a sele ção contra DNA, divergência de Kullback-Leibler, compara ção de padrões e composi ção da CDR H3. A an alise revelou que a os padrões de seq uências selecionadas positivamente e negativamente são muito semelhantes em VH10, e que este arcabou co e menos estringente que VH4 em relação a exigir seq uências de CDR H3 mais espec cas a DNA. Portanto, concluiu-se que a fam lia VH10 apresenta tendência intr nseca a forma c~ao de anticorpos anti-DNA, o que não ocorre com a fam lia VH4. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / We still possess very little knowledge of the molecular interaction between anti-nucleic acids and their targets. Previous research in databases made by the Molecular Immunology group of the University of Brasilia has indicated a probable tendency of nucleic acids' recognition of the antibodies of the murine heavy chain immunoglobulin family ten, VH10. Therefore, to better understand this behaviour, we analysed libraries of heavy chain complementarity determinig region three, CDR H3, in the context of the murine families VH10 and VH4, before and after these libraries have been selected against DNA single strand. In this manner, we sought to understand the behaviour of these families and of certain CDR H3 features in the antibody's recognition of DNA. The libraries were submitted to deep-sequencing Illumina platform and then analysed by a Bioinformatics pipeline. The pipeline was comprised in the preparation of the FASTQ Illumina sequences and in an afterwards analysis, which consisted in studies of library variability, sequence enrichment, Kullback-Leibler divergence, pattern comparison and CDR H3 composition. Analysis revealed that the patterns of the positive and negative selected groups are similar in VH10 and that this framework is more stringent than VH4 in demanding CDR H3 sequences that are more DNA-speci c. Therefore, it was concluded that the VH10 family presents an intrinsic tendency to form anti-DNA antibodies, which does not occur with the VH4 family.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-27T20:17:10Z No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-27T22:07:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-27T22:07:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) Previous issue date: 2009 / O desenvolvimento de novos anticorpos recombinantes teve impacto significativo no tratamento de diversas doenças. Contudo, devido a complexidade estrutural da molécula de imunoglobulina, a produção desta em células de mamífero ainda é um desafio. Uma das dificuldades é obter uma produção equimolar das cadeias pesada e leve para a prevenção do acúmulo de cadeias não-montadas, seguido de apoptose por estresse. Em nosso grupo, vimos trabalhando com um anticorpo com potencial imunoregulatório específico para o antígeno CD3 humano. Anticorpos anti-CD3 têm sido utilizados como imunoterápicos na prevenção da rejeição aguda de órgãos transplantados e é considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. A produção desse anticorpo em cultura de células animais tem se mostrado limitante devido ao baixo rendimento de anticorpo recombinante. Na tentativa de desenvolver estratégias alternativas para aprodução de anticorpo recombinante, foram construídos vetores de expressão, onde o anticorpo inteiro é produzido a partir de construções monocistrônicas, bicistrônicas e tricistrônica em células de mamíferos. As versões monocistrônicas possuem uma seqüência codificadora de um sítio clivável por furina entre as duas cadeias do anticorpo. A versão bicistrônica possui um elemento IRES sintético entre as duas cadeias. Além disso, foi introduzida uma marca seletiva para o antibiótico Geneticina associada ao mesmo cassete de expressão como um cístron extra guiado por outro elemento IRES. Para produção do anticorpo anti-CD3 foram utilizadas as linhagens celulares HEK293 e BHK-21, de forma transiente e estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados para a produção de imunoglobulina intacta. Os resultados indicam que a construção bicistrônica pMACIA HIL e monocistrônica pMACIA HL são capazes de garantir a expressão de ambas as cadeias de anticorpo. Já as construções monocistrônica pMACIA LH e bicistrônica pMACIA HL IRES neo não foram capazes de produzir o anticorpo recombinante. A construção tricistrônica pMACIA HIL IRES neo foi a construção que se mostrou mais promissora, apresentando estabilidade de produção do anticorpo em transfectomas estáveis. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The development of new pharmaceuticals derived from recombinant antibodies had a significant impact in the treatment of various illnesses. However, due to the structural complexity of the immunoglobulin molecule, the production of these molecules in mammal cells is still challenging. One of the difficulties is the equimolar production of heavy and light chains and the prevention of the stress induced by the accumulation of unassembled protein. We are working with a potentially immunoregulatory recombinant humanized antibody specific for the human CD3 antigen. Anti-CD3 antibodioes have been used in the prevention of the acute graft rejection and are considered as a promising pharmaceutical for the treatment of autoimmune diseases. The production of this antibody in culture of animal cells has shown to be problematic due to the low yield of recombinant antibody recovery. In the attempt to create alternative strategies for recombinant production of antibody, monocistronic, bicistronic and tricistronic expression vectors were constructed to coordinate the expression of a complete antibody in mammal cells. The monocistronic versions possess a furin cleavage coding sequence between the both antibody chains. The bicistronic version possesses a synthetic IRES element between the two chains. A selective mark for the Geneticin antibiotic was introduced in the expression cassette as an extra cistron driven by another IRES element. The cell lines HEK293 and BHK-21 were used for transient or stable production of the anti- CD3 antibody. Recombinant antibodies were purified by affinity chromatography and analyzed for the production of intact immuglobulin. The results indicate that the bicistronic construction pMACIA HIL and the monocistronic construction pMACIA HL are capable to express both antibody chains. On the other hand, the monocistronic construction pMACIA LH or the bicistronic construction pMACIA HL IRES neo were not able to produce the recombinant antibody. The tricistronic vector pMACIA HIL IRES neo was shown to be the most promising construction to obtain the whole antibody production in stable transfectomes.

Orientador: Claudio Lucio Rossi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T15:36:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AndreaDomenicaTeodoroda_M.pdf: 1752161 bytes, checksum: c92e55590527105d44f45851f41d3483 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A cisticercose é considerada um importante problema de saúde pública em países da Ásia, África e América Latina. Na América Latina, freqüências elevadas desta doença têm sido registradas no México, Peru, Chile e Brasil. A doença é causada pela infecção com o estágio larval (Cysticercus cellulosae) do parasita Taenia solium. Isto ocorre através da ingestão de alimentos contaminados por fezes, contendo ovos de T. solium, de auto-infecção fecal-oral ou de auto-infecção por peristalse reversa. A forma embrionária do parasita penetra a mucosa intestinal, cai na corrente sangüínea, migrando, principalmente, para músculo esquelético, tecido subcutâneo, olhos e sistema nervoso central (SNC). Quando os cisticercos estão presentes no SNC (neurocisticercose), dependendo do número, localização e estágio de desenvolvimento, podem causar sintomatologia extremamente severa. As manifestações clínicas da neurocisticercose são variadas e inespecíficas. Assim, o diagnóstico definitivo deve ser sempre considerado em um contexto epidemiológico e confirmado por dados laboratoriais e de imagem. As técnicas de neuroimagem, tais como a tomografia computadorizada e a ressonância magnética nuclear, além de permitirem um diagnóstico mais preciso da neurocisticercose, têm contribuído para uma melhor compreensão dos processos patofisiológicos da infecção. Entretanto, devido ao seu alto custo, as técnicas de imagem são, praticamente, inacessíveis para países em desenvolvimento, onde a incidência da doença é bastante elevada. A pesquisa de anticorpos anti - C. cellulosae em amostras de líq~ido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com suspeita clínica de neurocisticercose tem sido muito utilizada para o diagnóstico da infecção. No presente estudo, é descrita uma técnica imunoenzimática (ELISA) quantitativa para o imunodiagnóstico da neurocisticercose. A técnica de ELISA foi padronizada usando uma fIação purificada (FPC I) de um extrato bruto de C. cellulosae, obtida por meio de cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel. Em um estudo comparativo, a técnica quantitativa de ELISA usando a fração FPC I (ELISA-FPC) e uma técnica de ELISA qualitativa padronizada com um extrato bruto de C. cellulosae (ELISA-EBCC) foram usadas para a pesquisa de anticorpos IgG anti - C. cellulosae em amostras de LCR de 57 pacientes com neurocisticercose e 50 pacientes com infecções heterólogas (neurosIfilis, neurotoxoplasmose, neurocriptococose, esc1erose múltipla e meningites bacteriana e viral). As duas técnicas de ELISA apresentaram sensibilidade de 95% , enquanto que as especificidades obtidas com as técnicas ELISA-FPC e ELISA-EBCC foram de 100% e 92%, respectivamente. O bom desempenho, em tennos de sensibilidade e especificidade, aliado ao baixo custo, indicam que a técnica ELISA-FPC pode ser de grande utilidade para o imunodiagnóstico da neurocisticercose / Abstract: Cysticercosis is an important health problem in many Asia, Mrica and Latin America countries which have inadequate sanitary conditions, as well as in some industrialized nations with a high immigrant population from disease-endemic areas. In South America, high frequencies of this disease have been reported in Peru, Chile and Brazil. Cysticercosis is caused by infection with the larval form (cysticercus) of the tapeworm Taenia solium. The cysticerci may be located in areas where they produce no symptoms, such as musc1e or cutaneous tissues. On the other hand, the presence of cysticerci in the central nervous system (CNS), a condition known as neurocysticercosis, can cause seizures and other neurological problems. The clinical signs and symptoms of neurocysticercosis are variable and non-specific, leading to different neurological and psychiatric diagnoses. Thus, a definitive diagnosis of neurocysticercosis should always be considered in an epidemiological context and confirmed by laboratory and neuroimaging data. The methods used for diagnosing neurocysticercosis include neurOlmagmg techniques (computed tomography and nuclear magnetic resonance) and cerebrospinal fluid (CSF) ~alysis. Neuroimaging techniques have contributed to a more accurate diagnosis and a better understanding of the pathophysiology of neurocysticercosis. However, because of their high cost and restricted availability, these procedures may be of limited use in developing countries with high rates of infection. The detection of specific antibodies against Cysticercus cellulosae antigens in CSF samples from patients suspected of having neurocysticercosis is a useful tool for diagnosing the disease, especially when neuroimaging techniques are not available or inconclusive. In the present study, a quantitative '"oenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the immunodiagnosis of neurocysticercosis is described. The ELISA was standardized using a purified C. cellulosae fraction (PCF I) obtained by ion exchange chromatography. The ELISA using PCF I (PCF-ELISA) and a a qualitative ELISA using a whole extract from C. cellulosae (WECC-ELISA) were used to screen for Cysticercusspecific IgG antibodies in cerebrospinal fluid (CSF) samples from 57 patients with neurocysticercosis and 50 patients with heterologous infections. The sensitivity of both assays was 95%, whereas the specificities of PCF-ELISA and WECC-ELISA were 100% and 92%, respectiveIy. The excellent sensitivity and specificity of the PCF-ELISA malce this assay a potentially useful tool in screening for antibodies against C. cellu/osae / Mestrado / Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T05:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CamargoNeto_NeiFerreirade_M.pdf: 2470332 bytes, checksum: 169edc55c1b93750e9f04bec199da8f5 (MD5) Previous issue date: 1977 / Mestrado

Glicoconjugados são abundantes na superfície de Trypanosoma cruzi e têm sido bastante estudados por diferentes grupos. A degradação dessas moléculas, no entanto, tem sido alvo de pouco interesse. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade de alfa-L-fucosidase em T.cruzi uma vez que trabalhos anteriores haviam concluído que várias hidrolases, entre elas a alfa-L-fucosidase estavam ausentes em epimastigota (AVILA, et al., 1979). Empregando-se p-nitrofenilfucopiranosídeo como substrato e extrato de formas epimastigotas, verificou-se que a enzima apresenta praticamente a mesma atividade em um intervalo de pH entre 6,0 e 7,5, caindo drasticamente em pHs mais ácidos. A incubação prévia da enzima a 28°C em pH 7,0 leva à perda de aproximadamente 30% de sua atividade após 1h 30mim e à perda de 100% após 4 horas de incubação. O efeito de íons na atividade da enzima foi estudado,verificando-se que Zn +2 inibe 90% sua atividade, enquanto que outros, como o Ca +2 praticamente não tem efeito. A enzima é parcialmente encontrada na fração particulada, podendo ser solubilizada parcialmente com 1% de Triton X-100 ou com NaCl 1 M. As tentativas feitas de purificar a enzima foram infrutíferas, uma vez que não se encontraram condições para manter a proteína ativa por longos períodos de tempo. A alfa-L-fucosidase está presente não só em pimastigotas, mas também em tripomastigotas, embora parentemente com diferentes atividades específicas, sendo maior em epimastigotas. Mesmo nos epimastigotas, grandes variações de atividade específica foram detectadas ao longo deste trabalho (de 0,03 a 0,23 unidades). Anticorpos preparados contra alfa-L-fucosidase comercial de epidídimo bovino imunoprecipitaram de extratos de epimastigotas previamente marcados com 35 S-metionina, um polipeptídeo em torno de 50 kDa após eletroforese em gel desnaturante e uma banda de 130-150 kDa em gel não desnaturante, sugerindo que a enzima em T.cruzi pode ser dimérica, a exemplo de outras alfa-L-fucosidases descritas na literatura. A imunoprecipitação de extrato de epimastigotas marcados com 35 S-metionina na presença de tunicamicina, com o anticorpo anti-alfa-L-fucosidase revelou um polipeptídeo de 45 kDa, mostrando que a enzima é glicosilada. A glicosilação daenzima também foi observada pelo emprego de corantes comerciais. Além disso, os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase imunoprecipitam moléculas com atividade de alfa-L-fucosidase,embora não se tenha observado aumento da atividade, possivelmente devido à perda de atividade da enzima nas condições empregadas durante a imunoprecipitação. Os anticorpos anti-alfa-L-fucosidase reconhecem, por imunofluorescência indireta, tanto as formas epimastigotas como tripomastigotas de cultura de tecido. A análise por microscopia de transmissão mostra a reatividade intensa do anticorpo com uma região membranar localizada na região posterior do epimastigota. No caso do tripomastigota, a reatividade é menos pronunciada mostrando uma leve marcação no interior do parasita. / Alpha-L-fucose is a component of glycoproteins, inc1uding glycoproteins isolated from Tcruzi. a-L fucosidases have been isolated from different sources, but earlier studies were unable to detect this enzyme in T. cruzi epimastigotes (AVILA et al., 1979). In this work immunocytochemical and biochemical techniques have been used to localize and characterize a membrane-associated, neutral-pH-optimum alpha-L fucosidase from Trypanosoma cruzi epimastigotes. Light and electron microscopy specifically localized the alpha-L fucosidase on membranes in the posterior region of the epimastigotes and on the parasite surface. Immunoreactivity for alpha-L-fucosidase, a1though less intense, was also detected on the surface of trypomastigotes. Fractionation of epimastigotes homogenates indicated that over 50% of the a-Lfucosidase activity was associated with the 80 000 g pellet. This pellet-associated activity could be solubilized with 1 M NaCl or with 1% Triton X-I 00, suggesting that alpha-L-fucosidase is peripherally associated with membranes. Analysis of alpha-L-fucosidase on epimastigote extracts indicated that the enzyme had a pH-activity curve (with an optimum near 7) which was comparable to other alpha-L-fucosidases reported in the literature. A higher specific activity (in units/mg) was found in epimastigotes as compared to the other differentiation stages of the parasite: 0.028 for epimastigotes, 0.002 for metacyc1ic trypomastigotes and 0.015 for tissue - cultured trypomastigotes. SDS/PAGE and Westem blotting analysis indicated that epimastigotes have a protein band of 50 kDa which was immunoreactive with anti-alpha-L-fucosidase antibodies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-09T16:34:51Z No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-10T18:20:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T18:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JuanFernandoRiascoPalácios.pdf: 14164265 bytes, checksum: be8665ac0b5a23fed04eb06845b22157 (MD5) / Os anticorpos monoclonais são glicoproteínas especializadas com capacidade de reconhecer outras moléculas (antígenos). Eles são ferramentas importantes na clínica e biotecnologia e têm sido úteis no diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas, inflamatórias, imunológicas e neoplásicas, assim como no estudo da interação patógeno/ hospedeiro, e na detecção e quantificação de diversas moléculas. Os anticorpos monoclonais murinos (mAb) apresentam aplicações terapêuticas limitadas devido à sua natureza heteróloga, que pode gerar respostas imunogênicas e consequente a perda de atividade. A incorporação de técnicas de biologia molecular, e engenharia genética e proteomica tem aumentado a produção e utilização de anticorpos monoclonais, desenvolvendo técnicas como hibridoma, quimerização, e humanização de anticorpos monoclonais totalmente humanos. Ao longo dos últimos anos, novas gerações de anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD20 têm sido desenvolvidas para potenciais vantagens sobre a clássica e primeira geração do mAb rituximabe, Apesar de seus sucessos, nem todos os pacientes respondem ao tratamento com rituximabe e quase todos tem um recaída em seu tratamento. Assim, melhorar as propriedades deste anticorpo para melhorar a sua eficácia é muito desejável. Comparado com o rituximabe, novos mAbs têm atividade anti-tumor melhorada, resultante do aumento da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e / ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Neste aspecto, cultivos de células animais são os sistemas de expressão para essas proteínas preferenciais, que requerem modificações póstradução. É assim que o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Brasília tem se interessado pela produção de proteínas heterólogas de interesse clínico em células de mamíferos desde 2001. Este trabalho teve como objetivo a produção de novos anticorpos anti CD-20 na forma de fragmento recombinante FvFc em sistema de expressão heteróloga em células de ovário hamster chinês (CHO-K1) e em células de rim embrionário humano (HEK-293). A eficiência de transfecção para ambas as linhagens celulares foi avaliada comparativamente, bem como a expressão transiente. Os resultados indicam as células de mamífero como um sistema ótimo para a produção de proteínas heterólogas, Os segmentos dos genes correspondentes a três versões recombinantes humanizadas homologas ao anticorpo monoclonal quimérico rituximabe obtidas por CDR graffting (Zaparolli 2015) A, O, e L) e uma versão híbrida elecionada por VL shuffling (H), foram amplificados e clonados num vetor de expressão para células de mamífero. Os resultados mostraram uma eficiência de transfecção e produção de anticorpos menor na linhagem de células CHO-K1 em comparação com HEK-293, embora estas fossem estáveis para a produção de anticorpo em transfectomas estáveis. Os anticorpos recombinantes produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade, quantificados por ELISA, e analisados em relação a sua qualidade por SDS-PAGE, eletroforese capilar (Bioanalyzer) e Western Blotting. Os resultados deste projeto têm demostrado que fomos bem sucedidos na expressão e produção das construções humanizadas do anticorpo anti-CD20. / Monoclonal antibodies are specialized which have the ability to recognize other molecules (antigens). They are important tools in clinical practice and biotechnology and have been useful in the diagnosis and treatment of infectious, inflammatory, immunological and neoplasic diseases, as well as in the study of the host/pathogen interaction, and in the detection and quantification of diverse molecules. Murine monoclonal antibodies (mAb) present limited therapeutic applications because of their heterologous nature, which can generate immunogenic responses and consequent loss of activity. The incorporation of molecular biology, proteic and genetic engineering have extended the production and uses of monoclonal antibodies, finding techniques like hybridoma, chimerization, humanization and fully human monoclonal antibodies. Over the last few years, new generations of anti-CD20 monoclonal antibodies (mAbs) have been developed for potential benefits over the classical, first-generation mAb rituximabe. Despite its successes, not all patients respond to rituximabe therapy and virtually all relapse. Improving the properties of rituximabe to enhance its efficacy further is therefore highly desirable. Compared with rituximabe, new mAbs have enhanced antitumor activity resulting from increased complement-dependent cytotoxicity (CDC) and/or antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). In this aspect animal cell, cultures are the preferential expression systems for those proteins, which require extensive posttranslational modifications. Our research group has been interested in the production of heterologous proteins in mammalian cells since 2001. This work aimed the production of new antibodies anti CD-20 as a recombinant FvFc fragment, in heterologous expression system Chinese hamster ovary cells (CHO-K1) and Human Embryonic Kidney cells (HEK-293) the transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression. The results indicate mammalian cells as an optimal system for the production of heterologous proteins, Were amplified and cloned into an expression vector for mammalian cells the corresponding gene segments the three recombinant versions humanized homologous to monoclonal quimeric Rituximabe antibody obtained by CDR graffting (Zaparolli 2015) A,O and L) and a hybrid version selected by VL shuffling (H) . The results showed a lower transfection efficiency and production of antibodies in the CHO-K1 cell lineage compared to HEK- 293 cells, although these were stable for the production of antibody in stable transfectomas. The antibodies were purified by affinity chromatography were analyzed by ELISA, SDS-PAGE, capillary electrophoresis (bioanalyzer) and Western Blotting, for the production and quality of intact immunoglobulin. The results of this project have shown that we have succeeded in the expression and production of humanized constructs anti-CD20 antibody.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (SARM) é um dos principais patógenos responsáveis pela infecção nosocomial e recentemente tem sido isolada fora do ambiente hospitalar, trazendo uma grande preocupação a médicos e pesquisadores. Esta resistência à meticilina é devida à presença do gene mecA, o qual codifica a PLP2a, uma proteína ligadora de penicilina, que tem baixa afinidade pelos antibióticos β-Lactâmicos. A vancomicina, até recentemente, era o tratamento de escolha para pacientes acometidos pela SARM; porém o isolamento de cepas com resistência intermediária e S. aureus totalmente resistentes à vancomicina, gerou uma grande mobilização da comunidade científica na busca de alternativas para o tratamento destas cepas multirresistentes, através do desenvolvimento de vacinas e soroterapia. A vacina de DNA é uma técnica recente que, entre outras vantagens, não necessita da purificação do antígeno protéico para induzir uma resposta imune, diminuindo o custo de produção, quando comparada às vacinas protéicas. Neste trabalho, demonstramos que a utilização de uma vacina de DNA com um fragmento do gene mecA produz uma resposta imune humoral, com a produção de anticorpos específicos anti-PLP2a em eqüinos imunizados com esta vacina, e que estes anticorpos, após sua purificação, permanecem ativos. Como ainda não existe informação suficiente em relação à segurança do uso das vacinas de DNA diretamente em humanos, o uso desta técnica em eqüinos, com o objetivo de gerar um soro hiperimune, para utilizá-lo após sua purificação no tratamento de pacientes acometidos com infecção provocada por SARM, poderia ser uma alternativa viável e segura no combate a esta bactéria resistente a quase todos agentes antimicrobianos. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the major pathogens responsible for nosocomial infection and has been recently isolated outside the hospital environment, causing a great concern to physicians and researchers. This methicillinresistance is due to the presence of the mecA gene, which codes for PBP2a, a penicillinbinding protein, which has low affinity for β-Lactamic antibiotics. The treatment of choice for patients afflicted by MRSA was, until recently, vancomicyn; however the isolation of vancomycin-intermediate and resistant S. aureus strains generated a great mobilization of the scientific community for the search of alternatives for the treatment of these multiresistant strains, such as, for example vaccines and soroterapy. The DNA vaccine is a recent method that, among others, does not require the purification of the of the proteic antigen to induce a immune response, reducing production costs as compared to protein vaccines. In the present study we demonstrated that the use of a DNA vaccine with a fragment of the mecA gene produces an humoral immune response, with the production of anti-PBP2a specific antibodies in horses immunized with this vaccine, and these antibodies, once purified, maintain their activity. Since there is not sufficient information about the safety of DNA vaccines used directly to humans, the use of this vaccine in horses, with the intent of generating an hyperimmune serum to be used after its purification in the treatment of patients afflicted with infection caused by MRSA could be a possible and safe alternative to fight this bacteria resistant to almost all antimicrobial agents.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-06-10T19:36:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Gustavo Miranda.pdf: 1853807 bytes, checksum: f9a1c2b796442124414bba8e163ac719 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-10T19:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Gustavo Miranda.pdf: 1853807 bytes, checksum: f9a1c2b796442124414bba8e163ac719 (MD5) / Doenças como a leishmaniose é uma importante causa de morbidade e mortalidade no Brasil e seus diagnósticos devem ser melhoradas. A produção de anticorpos monoclonbais anti-L. infantum e acoplamento ao sensor piezoelétrico, para formar um dispositivo bioeletrônicos capaz de detectar rapidamente antígenos de Leishmania sp, tanto qualitativa como quantitativamente, é uma alternativa promissora para o diagnóstico da leishmaniose, devido à sua alta especificidade e sensibilidade, portabilidade e baixo custo, em comparação aos métodos convencionais. Objetivo: Desenvolver um imunossensor capaz de detectar antígenos de L. infantum em tecidos de animais infectados. Material e Método: Quatro hibridomas produtores de anticorpos monoclonais anti-amastigota de L. infantum teve sua especificidade confirmada por ELISA. Esses anticorpos foram imobilizados sobre um cristal piesoelétrico de quartzo através de uma fina camada de 2-aminoetanotiol (cisteamina) e glutaraldeído, e submetidos a injeções de extratos de baço de hamster infectados e não-infectados com L. infantum. Resultados: Quatro anticorpos (5A9H8, 2B7B8, 4B6F7 e 5AB3A10B4), todos da classe IgG, foram acoplados à superfície do transdutor e foram capazes de reagir contra extrato de baço de hamster infectado com L. infantum. A metodologia desenvolvida foi capaz de detectar 3,5x10 4 amastigotas por grama de tecido infectado com os anticorpos 5A9H8, 4B6F7 e 5AB3A10B4, e 1,75x10 4 com o anticorpo 2B7B8. Conclusões: Os resultados demonstraram que este teste pode ser útil para quantificar amastigotas de L. infantum em órgãos de animais experimentais para estudos sobre a patogênese da leishmaniose visceral americana e é uma ferramenta promissora para desenvolver um diagnóstico de leismanioses humana e canina. / Salvador